SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo di proteomica quantitativa utilizzando la tecnica di etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per analizzare gli effetti di HIV-1 su proteomi exosomal host. Questo protocollo può essere facilmente adattato alle cellule in diverse condizioni di stress o infezione.

Abstract

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introduzione

Molte malattie umane, tra cui le infezioni virali, sono spesso associate a processi cellulari distintivi che si svolgono dentro e intorno alle cellule colpite. Le proteine, spesso in qualità di effettori cellulari finale, mediare questi processi. L'analisi delle proteine, spesso in grado di fornire informazioni preziose per l'ambiente locale di cellule colpite e ci aiutano a comprendere il meccanismo alla base della patogenesi della malattia. Tra le varie tecniche di analisi delle proteine, la proteomica tiene particolarmente grande promessa. Come un potente strumento, su larga scala, proteomica possono fornire una comprensione sistemica di processi cellulari, in particolare nella zona della funzione e l'interazione di proteine. Analizzando proteine ​​specifiche è resa più semplice grazie allo sviluppo di tecniche di marcatura, che consentono investigatori per monitorare l'espressione di componenti cellulari, in particolare proteine, nel sito di indagine. Anche se molte analisi proteomica sono stati effettuati a livello cellularescala proteoma, caratterizzazioni proteomica su compartimenti subcellulari hanno dimostrato di essere particolarmente informativo ^1. Questo è esemplificato bene negli studi di HIV-1.

Esosomi, 30-100 vescicole di membrana nm secreti da una vasta gamma di tipi di cellule ^{2, 3,} sono componenti critici di comunicazione intercellulare e di trasporto molecolare. Essi sono stati scoperti in precedenza a svolgere ruoli importanti nella HIV-1 in erba processo di ^{4, 5.} Grazie alla combinazione di analisi proteomica con dissezione funzionale, abbiamo scoperto che esosomi rilasciati da HIV-1 le cellule infettate sono composti da un unico e quantitativamente diversi firma proteine e molecole regolatrici del porto che hanno un impatto proprietà cellulari su cellule vicine ricettive, tra cui l'apoptosi cellulare e la proliferazione ^6. I metodi sono descritti in questo protocollo,vale a dire SILAC (etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura) ⁷ sulla caratterizzazione proteomica di esosomi da HIV-1 le cellule infette. Approcci simili possono essere applicati per comprendere meglio altri compartimenti subcellulari durante patogenesi regolando stress sperimentale al compartimento o frazione di specifico interesse e di apportare modifiche necessarie alle procedure descritte.

Dato il recente sviluppo di metodi di proteomica quantitativa, ci sono molti tra cui scegliere quando si seleziona il metodo più efficiente per un particolare esperimento. Tra questi ci sono il iTRAQ chimico-based (tag isobariche per la quantificazione relativa e assoluta) ⁸ e il libero etichetta MRM (monitoraggio reazione multipla) ⁹ tecniche. Entrambi i metodi sono strumenti potenti e sono buone scelte per le impostazioni specifiche. Per un laboratorio tipico lavorando principalmente con linee cellulari, tuttavia, questi due metodi hanno relatively costi più elevati e sono più tempo rispetto al metodo basato SILAC. SILAC è una tecnica di marcatura metabolica based che integra forme isotopiche non radioattivi di aminoacidi dal terreno di coltura in proteine ​​cellulari. In genere, gli esperimenti SILAC cominciano con due popolazioni di cellule, per esempio, infetti e non infetti. Ciascuno è differenzialmente etichettati nel suo ambiente isotopico specifico fino al raggiungimento della etichettatura. I exosomes etichettati di queste cellule vengono poi sottoposti ad estrazione delle proteine. Una volta estratti, le proteine exosomal marcate vengono analizzati utilizzando cromatografia liquida tandem massa spettroscopia ^10. Infine, i risultati di spettrometria di massa e proteine ​​significativamente marcate sono sottoposti a statistica e bioinformatica analisi e verifica rigorosa biochimico. I nostri rapporti investigativi precedenti suggeriscono che le procedure SILAC / exosome sono più appropriati per linee cellulari di cellule primarie, come linee cellulari sono di solito in unstato proliferante attivo per l'etichettatura isotopica efficiente,

Protocollo

1. Colture cellulari e HIV-1

NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, si consiglia di verificare la vitalità delle cellule attraverso Trypan Blue colorazione ¹¹ e la loro proliferazione attraverso un saggio di MTT ^12. E 'inoltre fondamentale utilizzare media SILAC appena preparata. Varie linee cellulari possono essere usati, purché siano in fase attiva proliferativa, e sono suscettibili di HIV-1, o la condizione di test di scelta. In questo protocollo, usare la linea cellulare H9 come l'esempio.

1. Seed 2 x 10 ⁶ cellule H9 in ciascun pallone di coltura cellulare. Grow un gruppo in 10 ml etichettati terreno RPMI 1640 contenente 10% siero bovino fetale dializzato (FBS), 100 mg / L ¹³ C ₆ L-lisina e 100 mg / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginina. Grow l'altro gruppo in 10 ml senza etichetta terreno RPMI 1640 con 10% FBS dializzato, 100 mg / L di L-lisina e 100 mg / L di L-arginina.
2. Far crescere le cellule per sei raddoppi a quel punto le proteine ​​delle cellule nel mezzo etichettato sono praticamente completamente etichettati (> 99%) con aminoacidi pesanti. Aggiungere mezzi freschi o cambiare supporto regolarmente (ogni 1-3 giorni a seconda del tipo di cellula. Per cellule H9, cambiare media ogni 3 giorni). Alla fine di etichettatura, aumentare il volume di coltura (per es ~ 30 ml) per accogliere la crescita di nuove cellule.
   NOTA: Determinare cella esatto tempo di raddoppio all'inizio dell'esperimento tramite colorazione Trypan blu e conteggio delle cellule.
3. Infettare le cellule marcate con HIV-1 _NL4-3 utilizzando standard di HIV-1 infezione protocollo ¹³ per 48 ore. Incubare le cellule con quantità appropriate di virus con una molteplicità di infezione (MOI) circa 0,3. Controllare HIV-1 da p24 quantificazione dei sovranatanti di coltura utilizzando un kit di p24 HIV-1 ELISA. Eseguire un test di immunofluorescenza ¹⁴ per confermare l'infezione con successo delle cellule. Keep crescere le cellule non etichettati in media senza etichetta, senza HIV-1.
4. Raccogliere i supernatanti di entrambi i gruppi alla fine di infezione (passo 2.1).

2. Isolamento Exosome

NOTA: Attraverso una serie di passaggi ultracentrifugazione, frazioni exosomal da sovranatanti sono arricchiti ^15. Eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C, con un rotore Ultracentrifuge che può raggiungere una velocità di almeno 100.000 x g.

1. Raccogliere i surnatanti delle colture in 50 ml provette coniche, evitando le cellule. li centrifugare per 10 minuti a 300 xg per rimuovere le cellule rimanenti.
2. Raccogliere il surnatante in nuovi 50 ml provette coniche e centrifugare per 10 minuti a 2.000 xg per rimuovere le cellule morte. Trasferimento risultante supernatanti a tubi rotori compatibile commerciali che sono in grado di resistere ultracentrifugazione.
3. Assicurati di bilanciare i tubi ultracentrifuga. Centrifugare le provette per 30 min a 10.000 xg per rimuoveredetriti cellulari.
4. Raccogliere i surnatanti in tubi ultracentrifuga e centrifugare per 70 min a 100.000 x g. Eliminare il surnatante.
5. Risospendere il pellet ricco di exosome in 5 ml di PBS fresco. Trasferire le soluzioni a tubi ultracentrifuga freschi e centrifugare ancora per 70 min a 100.000 x g.
6. surnatanti scartare. Per memorizzare i exosomes a lungo termine, risospendere il pellet in 50 ml di PBS e conservare a -80 ° C. In alternativa, procedere direttamente alla estrazione di proteine ​​come illustrato di seguito.

3. Proteine ​​estrazione e preparazione

1. Sciogliere isolati pellet exosomal a 100-200 ml RIPA lisi e l'estrazione del buffer con cocktail inibitori della proteasi aggiunto. Il buffer è composta da 25 mM Tris-cloridrato, cloruro di sodio 150 mM, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, e 0,1% SDS (sodio dodecil solfato), a pH 7,6. I cocktail di inibitori della proteasi dovrebbero contenere una varietà di inibitori delle proteasi, come ad esempio l'aprotinina, Bestatin, leupeptin, pepstatina A e EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), che può inibire una gamma completa di proteasi.
2. Centrifugare le soluzioni disciolti per 10 minuti a 13.000 xg (4 ° C), e trasferire il surnatante eliminato per nuovi tubi da 1,5 ml microcentrifuga.
3. Quantificare concentrazione di proteine di ogni campione di esosomi con acido bicinconinico (BCA) o saggio Bradford ^16.
4. Miscelare una quantità uguale di proteine ​​(2 mg) da campioni etichettati e senza etichetta ed eseguire la miscela uguale su un gel SDS-PAGE 4-20% a 120 mA / 200 V per 30 min.
5. Gel Stain con Coomassie blu seguito da decolorazione ^17.
6. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare la corsia campione dal gel. Poi tagliare la corsia di gel in 10-15 pezzi uguali. Mettere ogni pezzo in un 1,5 ml provetta fresco per un totale di 10-15 tubi.
7. Immergere cubi in 25 mM NH ₄ HCO ₃ nel 50% acetonitrile, vortice, e scartare surnatanti. Ripetere due volte. Asciuttocubi in un concentratore ^a vuoto ^{18, 19.}
8. Reidratare cubi con 10 mM ditiotreitolo (DTT), vortex e centrifugare brevemente. Incubare a 56 ° C per 1 ora. surnatante degli scarti.
9. Immergere cubi di gel a 55 mm Iodoacetamide, vortice, ed effetti. Incubare a temperatura ambiente al buio per 45 min. surnatante degli scarti.
10. Immergere cubi in 25 mM NH ₄ HCO _3, vortice, rotazione, e scartare il surnatante.
11. Immergere cubi in 25 mM NH ₄ HCO ₃ nel 50% acetonitrile, vortice, ed effetti. Ripetere 3.9 e 3.10.
12. Asciugare i cubi in un concentratore a vuoto. Aggiungere 25 ml di sequenziamento grado tripsina modificata in 25 mM NH ₄ HCO _3, incubare a 4 ° C per 30 minuti, e scartare la soluzione in eccesso. Immergere cubi in 25 mM NH ₄ HCO ₃ senza tripsina, e incubare una notte a 37 ° C.
13. Brevemente girare cubetti verso il basso e trasferire il peptide risultante in piùct in una nuova provetta. Aggiungere 30 ml di acido formico al 5% in 50% acetonitrile ai cubi, vortex per 30 min, e rotazioni. Unire il surnatante con l'estratto. Essiccare gli estratti peptide con un concentratore a vuoto a meno di 5 microlitri.
14. Invia campioni di impianto di base spettrometria di massa per l'analisi LC-MS / MS. L'analisi dei dati di MS, che può essere generato da un software open source, in genere include un numero di registrazione per ogni proteina identificata, etichettati rapporti / senza etichetta e il numero di peptidi unici identificati.

4. Western Blotting di verifica

NOTA: Western blotting si raccomanda di verificare i risultati di spettrometria di massa.

1. Seguire i protocolli Western Blotting standard e garantire che le quantità uguali di proteine ​​di ogni gruppo vengono caricati. Usare gli anticorpi contro le proteine di interesse (ad esempio A5 annexin, lattato deidrogenasi a catena B) individuati dalla SM. rilevamento Western blotting, insieme a densitometria analisi des, in grado di ribadire che l'identificazione delle proteine ​​MS e quantificazione siano corretti.

5. Analisi dei dati proteomica

NOTA: la valutazione della qualità dei dati, pre-trattamento dei dati, il calcolo e la determinazione di importanti candidati proteine ​​sono fatte separatamente per ciascuno Stato membro si replicano. Una volta che le analisi di cui sopra sono stati completati, i dati analizzati da repliche vengono confrontati e combinati ^{6, 20, 21.}

1. Valutare la qualità dei dati MS.
   1. In primo luogo, log2 trasformare la SILAC-MS etichettato / rapporti senza etichetta di proteine ​​quantificate in un foglio di calcolo.
   2. Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, i rapporti di gruppo in 40-100 bidoni rapporto e tracciare il numero di rapporti per scomparto per generare un istogramma. Un normale distribuzione di istogramma indica una buona qualità dei dati MS ^6. Fare questo passo per tutta la MS replica.
2. Per aumentare la fiducia e l'accuratezza dei rapporti peptide MS, prendere in considerazione la rimozione di proteine ​​che hanno meno di due peptidi quantificati.
3. Per determinare i candidati di proteine in modo significativo l'alto e verso il basso-regolato, utilizzare le seguenti operazioni per il calcolo soglie significative ^22.
   1. Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, generare una regressione non lineare o una curva-fit per i dati di distribuzione di frequenza. Questo passo produce valori che possono essere utilizzati per calcolare i valori di cutoff. Calcolare i valori di cut-off come mediana ± 1,96 σ per il 95% limiti di confidenza o 2,56 σ per il 99% limiti di confidenza.
      NOTA: I dettagli specifici del calcolo dei tagli può essere trovato alla Emmott et al. ^22.
   2. Selezionare i candidati proteina la cui rapporti sono o superiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard sopra la mediana (significativamente sovra-espresso) o inferiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard al di sotto della mediana (significativamente sotto-espressi).
4. Confrontare le repliche dei candidati rilevanti sopra individuati per garantire la coerenza. Assicurarsi che soddisfano i seguenti criteri di passare questa fase di selezione finale: i candidati devono individuare in modo coerente in tutte le repliche; e repliche di un candidato devono essere coerenti nella loro direzione, del regolamento (preferibilmente almeno 2 su 3 repliche di un candidato dovrebbe essere o up-regolati o down-regolato).
5. Finalizzare i dati per i candidati che soddisfano i criteri di cui sopra unendo i dati replicati loro.

6. Bioinformatica verifica e caratterizzazione

NOTA: esistenti informazioni genomiche e bioinformatica offre una ricchezza di informazioni per quasi ogni proteina. Data mining e analisi bioinformatica di tali informazioni possono aiutare ad acquisire una grande quantità di comprensione della proprietà e funzioni dei candidati significativi. questa process è di solito necessario per una corretta progettazione di esperimenti su valle.

1. Usando i loro numeri GenBank adesione o gli ID UniProt, la ricerca di candidati contro database exosome correnti (Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ per verificare che le proteine candidati sono stati precedentemente trovati in exosome. Questo passaggio aggiunge un livello di fiducia che i candidati sono infatti in esosomi.
   1. http://www.exocarta.org/ accesso, fai clic su "Query" e in ingresso sia il gene o una proteina nome / numero di adesione. Una pagina di riepilogo apparirà e le prove in exosome verrà mostrato, a condizione che se non vi è alcuna.
2. Cerca i candidati contro l'HIV-1 e la proteina umana Interazione Database ^25. In alternativa, la ricerca di basi di dati specifici che possono fornire informazioni circa l'interazione delle proteine ​​candidati e la condizione di test.
   1. Accedere al database a www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInterazioni. Sulla voce 'proteina nome di dominio', inserire i nomi dei candidati o dei numeri di adesione, e fare clic su Cerca. I risultati della ricerca possono fornire una conoscenza delle interazioni tra HIV-1 ei candidati della proteina, e suggerire che dei candidati potrebbe essere veramente HIV-1 associata.
3. Importa GenBank numero o UniProt gli ID dei candidati in software di analisi GO (come FunRich, strumento di analisi di arricchimento funzionale ²⁶⁾ ed eseguire il software.
   1. Scaricare il software a http://www.funrich.org/. Dopo l'installazione, aprire il software, in analisi di arricchimento, fare clic su "Aggiungi Data Set", e caricare l'elenco delle proteine ​​/ geni. Avanti, selezionare il tipo di grafico per visualizzare l'analisi GO.
      NOTA: GO risultati delle analisi saranno visualizzati sotto forma di grafici a torta. Questo passo ci aiuta a ottenere una visione globale associato con i candidati nei settori della Processo biologico (BP), Cellular componente (CC), e funzione molecolare (MF).
4. L'accesso a DAVID http://david.ncifcrf.gov/ ^27, fare clic su "strumento di annotazione funzionale" sul suo sito web. Inserire la lista dei candidati, selezionare l'opzione "Identifier" del gene, come la "UniProt ID", selezionare "Lista Gene" e di ricerca. I termini arricchiti GO, p-value, e altri parametri possono essere trovate cliccando la pagina "Riepilogo risultati annotazione" sotto la categoria "Gene_Ontology".
5. Per studiare potenziali interazioni dei candidati, con altre proteine, usare apertamente accessibile database di STRING ²⁸ per chiarire potenziali interazioni proteina-proteina e le possibili vie biochimiche.
   NOTA: GO analisi e annotazione funzionale (Sezione 6,3-6,4) può essere eseguita utilizzando il software più recente STRING.
   1. Accedere al database a http://string-db.org/. Inserire l'ID di proteine ​​o la sequenza nelle s designatiscatola earch e selezionare le specie corretti per l'analisi. Fai clic su "Cerca". I risultati forniranno informazioni su entrambe le associazioni dirette (fisico) e indiretti (funzionale). I primi dieci partite noti per il candidato exosomal verranno visualizzati e devono essere considerati per la selezione significativa candidato.
      NOTA: Una grande quantità di informazioni associate con i candidati possono essere analizzati utilizzando la procedura descritta sopra. I candidati più significativi possono essere scelti per ulteriori analisi molecolari e biochimiche valle.

Risultati

La figura 1A è un diagramma di flusso che illustra la procedura di etichettatura SILAC ^21. Al fine di purificare gli esosomi, i campioni devono essere centrifugati tramite centrifuga. Figura 1B mostra le fasi di purificazione exosome di ultracentrifugazione di serie ^21. Una volta purificate, le esosomi sono oggetto di analisi sperimentale proteomica come indicato nella procedura.

Discussione

Nelle procedure descritte in questo documento, abbiamo dimostrato l'applicazione della tecnica SILAC per studiare l'effetto di HIV-1 sul proteoma exosomal host. Inizialmente, le cellule infette non infettate e HIV-1 sono differenziale marcati con isotopi. I exosomes differenziale etichettati vengono quindi purificati prima di eseguire l'estrazione di proteine. Avanti, cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem è impiegato per analizzare il proteoma exosomal. Infine, i dati risultanti spettrometria ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details