JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית ​​השתן בעכברים orthotopic אצל נקבות עכברים C57BL / 6J ועל ניטור של הגידול.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית ​​השתן אצל נקבות עכברים C57BL / 6J באמצעות שורת תאים סרטניים בשלפוחית ​​השתן בעכברים MB49, אשר שונתה כדי להפריש אנטיגן ספציפי לערמונית האדם (PSA), ואת ההליך לאישור של ההשתלה הגידול. בקיצור, עכברים מורדמים באמצעות תרופות להזרקה והם עשויים להניח במצב הגבה. שתן מתפנה מן השלפוחית ​​50 μL של פולי- L- ליזין (PLL) הוא החדיר לאט בקצב של 10 μL / 20 שניות באמצעות קטטר 24 G IV. הוא עזב בשלפוחית ​​במשך 20 דקות על ידי וסותם את הקטטר. צנתר מוסר PLL הוא שפונה על ידי לחץ עדין על שלפוחית ​​השתן. זה ואחריו החדרה של הקו הסלולרי בעכברים שלפוחית השתן סרטן (1 x 10 5 תאים / 50 μL) בשיעור של 10 μL / 20 שניות. קטטר פקוק למנוע פינוי מוקדם. לאחר h 1, העכברים הם החיו עם תרופת היפוך, ואת שלפוחית ​​השתן שהתפנה. שיעור ההחדרה האיטי חשוב,כפי שהיא מקטינה ריפלוקס vesico-השופכן, אשר יכול לגרום לגידולים להתרחש בדרכי השתן העליונות בכליות. שורת התא צריך להיות גם מחדש תלוי להפחית clumping של תאים, כמו זה יכול להוביל בגדלי גידול אחידים לאחר השתלה.

טכניקה זו גורמת גידולים עם יעילות גבוהה. צמיחת גידול מנוטרת על ידי הפרשת PSA שתן. ניטור סמן PSA הוא יותר אמין יותר מאשר אולטרסאונד או דימות פלואורסצנטי לאיתור נוכחות של גידולים בשלפוחית. גידולים בעכברים בדרך כלל להגיע לגודל מקסימאלי משפיע לרעה בריאות בכ 3 - 4 שבועות אם אינו מטופל. באמצעות מעקב אחר צמיחת הגידול, אפשר להבחין עכברים נרפאו מאלו שלא הושתלו בהצלחה עם גידולים. עם ניתוח נקודת סיום רק, זה האחרון עשוי להניח בטעות נרפא על ידי טיפול.

Introduction

המטרה של שיטה זו היא ליצור גידולים בשלפוחית ​​שתן orthotopic murine וכן לפקח על הגידולים המושתלים באופן מדויק ככל האפשר, כך שהעכברים ללא השתלת גידול לא מיוחסים נרפאו ב ניתוח נקודת סיום. בסך הכל, השיטה לראות תפחית את צורך כמויות גדולות של עכברים לניתוח הניסיון ולהבטיח דיוק רב יותר בקביעת תוצאות טיפוליות.

פיתוח מודל orthotopic לסרטן חשוב, כמו תאים סרטניים להשתיל מתחת לעור לא לשחזר את הסביבה של מחלה קלינית או לאפשר פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות. הארכיטקטורה של שלפוחית ​​השתן מאפשרת ההחדרה של טיפולים בסרטן שלפוחית ​​השתן ישירות לתוך שלפוחית ​​השתן עם תופעות מערכתיות מינימאליות. לכן, במודלים של בעלי חיים כי לשחזר בסביבה זו, כגון מודל orthotopic, שחשובים להעריך טיפולים חדשים. מסקנות מכל ניסוי הגדרה הם dependent על מגבלות המודל.

טכניקות פותחו מספר לייצור גידולים בשלפוחית ​​השתן orthotopic בעכברים. אלה מסתמכים על הפגיעה בשכבת glycosaminoglycan של שלפוחית ​​השתן, מה שמאפשר לתאים נגועים להיות מושתלים. הטכניקות בשימוש כוללות electrocautery, שתוצאתה נקודה אחת של נזק לדופן השלפוחית, מה שמוביל להתפתחות גידולים באתר אחד בשלפוחית 1,2. עם זאת, שיעור ההצלחה של השתלת גידול באמצעות electrocautery הוא מפעיל תלוי הנע בין 10 - 90%, והיא כוללת את הסכנה כי לדופן השלפוחית ​​יהיה נקב, שמובילה גידולים המתפתחים חלל הצפק. כווייה כימית מתבצעת באמצעות כסף חנק, אשר פוגע בקיר השלפוחית 3. באופן דומה, חומצה נעשה שימוש כדי לפגוע בקיר השלפוחית 4. טריפסין גם נעשה שימוש כדי לפגוע השלפוחית כמו גם 5. שיטות אלה עלולות לגרום להתפתחות של יותר מ גידול אחד בשלפוחית.יתר על כן, קיימת סכנה של נזק חמור השלפוחית ​​אם הכימיקלים נשארים במגע עם דופן השלפוחית ​​במשך זמן רב מדי. השיטה שפותחה על ידי Ninalga et al. משתמש פולי- L- ליזין בעלי המטען החשמלי החיובי (PLL) 6 מולקולות כדי לצפות את קיר שלפוחית השתן; זה מאפשר לתאי הגידול טעונים שלילית להיצמד שכבת glycosaminoglycan של שלפוחית ​​השתן. שיטה זו בדרך כלל תוצאות יותר גידול אחד לפתח בשלפוחית, אך השתלת גידול היא 80 - 100% 4,7. מבחינה טכנית, זה גם ההליך הקל ביותר לבצע. כדי להבטיח כי הגידולים המתפתחים הם די אפילו בגודל, חשוב כי התאים הסרטניים אינם מקובצי גושים גדולים לפני ההשתלה.

על מנת להעריך יעילות טיפולית, עדיף לבצע מחקר זה על עכברים עם גידולים בגודל דומים למדי. לפיכך, מערכת זיהוי טובה שיכול לכמת גודל גידול קצר לאחר ההשתלה היא חשובה. יש מספר אסטרטגיות דבורהn המשמש להערכת גידולים. אלה כוללים הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) 8-10, קרינת 11, פליטת אור 12,13, אולטרסאונד 14, ו assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) 15,16. בעוד MRI ואולטרסאונד אינו דורשים שינויים של התאים הסרטניים, יש צורך סוכני ציוד והניגודיות רגישים עבור MRI. Fluorescence-, luminescence-, המבחנים המבוססים ELISA דורשים שינוי של התאים הסרטניים לבטא חלבוני סמן שיכול להיות מזוהה על ידי שיטות אלה. לקבלת הארה, מצע נדרש לצורך זיהוי של פעילות בלוציפראז; ובכך, יש שלב מוסף התייקרות. שניהם הארת הקרינה דורשות ציוד מיוחד. כדי לייצר קרינה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) cyclization, אשר מזורז על ידי חמצן מולקולרי, נדרש. לפיכך, ביטוי של GFP עשוי להיות משתנה בתוך מסת גידול תלוי גישת החמצן, מה שהופך את סמן למדי אמין 17. שינוי של שורת התאים בעכברי שלפוחית שתן סרטן MB49 להפריש אנטיגן ספציפי לערמונית אדם (PSA) 15,16 כסמן פונדקאי הוא אסטרטגיה אחרת. סמנים אלה גם לספק אמצעים חלופיים המאשר נוכחות גידול על סיום הניסוי, מה שהופך אותם כחלופה אימונוהיסטוכימיה. מחקר זה מדווח על שיטת PLL של השתלת גידול orthotopic ומציג השוואה של מערכות גילוי גידול, כלומר ELISA, קרינה, והדמית אולטרסאונד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל עבודה החיה דבק ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) הנחיות לגבי שימוש בבעלי חיים וטיפול (מספר פרוטוקול 084/12) באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.

1. גידול תאי MB49-PSA במבחנת מדידת הפרשת PSA

  1. לשמור murine תאי סרטן שלפוחית השתן MB49-PSA 15 בינוני הנשר שונה של שלמה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עוברי בסרום שור (FBS), 2 mmol / L L- גלוטמין, ו 0.05 מ"ג / מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הוספת 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B כדי לשמור על לחץ מבחר תאים מפרישי PSA.
  2. כדי לקבוע הפרשת PSA, צלחת 1 x 10 6 תאים בצלחת תרבות 6 היטב דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2 למשך 48 שעות.
  3. יומיים לאחר מכן, לאסוף את supernatant לשקילת PSA.
    1. בעזרת פיפטה פסטר, להעביר את supernatant לצינור צנטריפוגות 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 250 XG כדי להסיר תאים ופסולת צף. אם assay PSA מתבצעת ביום אחר, לאחסן את supernatant ב - 30 מעלות צלזיוס צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. אם לא, המשך לשלב הבא באופן מיידי.
    3. קבע את ריכוז PSA באמצעות ערכת ELISA PSA אדם נטול 7.
  4. ספירת התאים המצופים.
    1. בעזרת פיפטה פסטר, לשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל של DMEM. לשאוב להסיר לחלוטין את התקשורת.
    2. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת הטריה לגרד בעדינות עם מגרד תא כדי לסלק את התאים מן הבאר.
    3. מעביר את התאים לצינור microcentrifuge מחדש להשעות אותם ביסודיות כדי להבטיח השעית תא בודד.
    4. מערבבים כמויות שוות של ההשעיה תא ופתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים (אשר אינם תופסים צבע) באמצעות hemocytometer.
  5. חשב את הביטוי PSA כמו ngשל PSA / מ"ל של התקשורת / 10 6 תאים. ביטוי PSA של תאי MB49-PSA להשתלה בעכברים הוא 80 - 120 ng / mL / 10 6 תאים.

2. קביעת הרגישות של מדידות PSA ידי ELISA ו- בזמן אמת ניתוח PCR

  1. פלייט תאי MB49-PSA ב מדיה מלאה DMEM בצלחת תרבות 6 היטב עם כמויות שונות של תאי הורית MB49 כך יש מקסימום של 1 x 10 6 תאים לכל טוב (כלומר, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, או 10 6 תאים MB49-PSA הם מתורבתים עם 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, או 10 0 MB49 תאים, בהתאמה).
  2. יום אחד מאוחר יותר, לאסוף את supernatant למדידת PSA, כמתואר בשלב 1.3. קבע את ריכוז PSA באמצעות ערכת ELISA PSA אדם נטול 7.
  3. חלץ את RNA מן התאים.
    1. Lyseתאים ישירות את הצלחת על ידי הוספת 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA.
    2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר את lysate לתא צינור microcentrifuge. להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם המערבולת דגימות במרץ למשך 15 שניות. דגירה אותם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. צנטריפוגה דגימות XG ב 12,000 במשך 15 דקות ב 4 °. להעביר בזהירות את השלב מהימי העליון (0.5 מיליליטר) לצינור טרי מבלי להפריע את שלבי ביניים.
    4. הוסף 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה דגימות XG ב 12,000 במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant לחלוטין, מבלי להפריע את המשקע RNA בתחתית של התחתית.
    5. שטפו את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את כל אתנול ולאפשר גלולה לייבוש באוויר במשך 10 דקות.
    6. ממיסים את רנ"א 30 μL מים nuclease חינם. דגירה במשך 5 דקות ב 60 ° C כדי להגדיל את כל כךlubility.
    7. לכמת את הרנ"א על ​​ידי מדידת ספיגת באמצעות אולטרה סגול ספקטרוסקופיה (UV) ב 260 ננומטר (A260). כדי להעריך טוהר RNA, למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר (A280) ולחשב את יחס A260 / A280 אשר צריך להיות מעל 1.6.
  4. Reverse-לתמלל cDNA מ 2 מיקרוגרם של רנ"א.
    1. מכינים את תערובת התגובה על הקרח ולהעבירו 0.2 צינורות מ"ל.
    2. צנטריפוגות בקצרה את הצינורות כדי לסובב את התוכן ואת לחסל בועות אוויר.
    3. טען את צינורות לתוך Cycler התרמית ולבצע שעתוק לאחור על התנאים הבאים: 60 דקות ב 37 ° C ואחריו 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר הריצה תושלם, לשמור על דגימות cDNA על 4 מעלות צלזיוס.
    4. אחסן את הדגימות ב - 30 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
  5. ביצוע ניתוח PCR בזמן אמת עבור PSA יקטין בטא cytoplasmic. תקטין Beta משמש לנרמל את הדגימות. בצע את assay על 100 ננוגרם של רנ"א-עבד הפוך בתוך PLA 96-היטבטה. Assay כל הדגימות בשלושה עותקים. בצע 40 מחזורים עם הפרמטרים הבאים: 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, 15 שניות ב 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation, ו 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. הגדר לגבול של זיהוי הנמוך ביותר ב סף מחזור (CT) של 35; וכך, כל המדגם עם ערך CT מעבר 35 נחשב לא ניתן לגילוי.

3. שמירה על tumorigenicity של הקו הסלולרי MB49-PSA

הערה: ממושכת צמיחה במבחנה מובילה לאובדן של tumorigenicity. כדי לשמור tumorigenicity, שורת תאי MB49-PSA היא passaged באמצעות העכבר לפחות אחת 2 שנים.

  1. תאים.
    1. קציר אקספוננציאלית גידול תאים על ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד תא סטרילי. מערבבים כמויות שוות של ההשעיה תא ופתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer. אין להשתיל אם יותר מ -20% מכלל התאים מתים.
    2. לחשב את הסכום של תאים חיים נדרש (1 x 107 תאים / מ"ל) ולהעבירם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. Re- להשעות את התא גלולה ב מדיה ריקה DMEM. חזור על לשטוף שלוש פעמים כדי להסיר את כל העקבות של FBS לפני ההשתלה.
    3. שמור על השעיית התא על קרח עד העכברים מוכנים להשתלה.
  2. שתל תאי הגידול תת עורית בעכברים בכנף הגבי.
    1. להרדים עכבר 4 עד 6 שבועות בן C57BL6 / J באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
    2. לגלח את האגף הימני כדי לחשוף את העור.
    3. בעזרת זוג מלקחיים, להרים את העור להפרידו לשריר הבסיסי ולהזריק 0.1 מיליליטר של השעית התא (1 x 10 6 תאים) תת עורי עם מחט 24 G. תוך הסרת המחט, לצבוט את הזריקה במשך 5 עד 10 שניות, כך התאים הסרטניים לעשותלא לדלוף של הזריקה.
    4. להחיות את העכבר עם זריקה תת עורית של atipamezole (1 מ"ג / ק"ג) 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  3. צג צמיחת הגידול כל יומיים על ידי מדידת קוטר הגידול באמצעות מחוגה. היקף הגידול מחושב לפי הנוסחה = V (ab 2) / 2, כאשר "a" הוא הממד הארוך "ב" הוא רוחב בניצב, הן מ"מ.
  4. כאשר נפח הגידול הוא לפחות 50 מ"מ 3 (כ 7 ימים), להרדים את העכבר עם CO 2. ובלו מסת הגידול עם זוג מלקחיים ומספריים סטרילית בתנאי aseptic ומניח DMEM.
  5. בצלחת תרבות 6 היטב, לרכך את הגידול לחתיכות קטנות באמצעות אזמלים סטרילית. השתמש בוכנת מזרק 1 מיליליטר כמו "עלי" כדי disaggregate הגידול נוסף.
  6. הוסף 3 מ"ל של שלמה DMEM ולתחזק את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  7. ברגע שהתאים לדבוק platדואר (בין אחד ויומיים), להסיר את המדיה, פסולת, שאינם חסיד תאים על ידי aspirating בעדינות עם פיפטה פסטר סטרילית. שטפו פעמיים עם DMEM. תשמור על עצמך כדי לא להפריע את התאים.
  8. הוסף 1 מ"ל של DMEM ו לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם מגרד תא. כדי לבחור ולהרחיב מושבות אחת, לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת 1 תא לכל היטב צלחת תרבות 96-היטב. התרבות תאים DMEM עם 200 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  9. שנה את התקשורת ואת אנטיביוטיקה כל 4 - 5 ימים. צג התאים עד שהם בסביבות 80-90% ומחוברות. Re-צלחת התאים על צלחת תרבות 24 גם על ידי pipetting כדי לסלק תאים מן הבאר.
  10. לאחר תאי צלחת התרבות 24 גם הוא ומחוברים, לסלק אותם על ידי גירוד עם מגרד תא צלחת אותם בצלחת תרבות 6 היטב.
  11. מסך השיבוטים השונים עבור הפרשת PSA, כמתואר בשלב 1. קריו לשמר את השיבוט עם סוד PSA הגבוה ביותריון ולהשתמש בו עבור ניסויי עכבר בעתיד.

4. השתלת הגידול

הערה: כל עכבר הוא מושתל עם 1 x 10 5 תאים MB49-PSA ב 50 μL של DMEM מדיה ריקה בשלפוחית. בשל השטח המת הקטטר, תמיד להכין נפח נוסף (לפחות 100 μL נוסף לכל עכבר). גישה חלופית תהיה להשתמש במזרק מלא באוויר כפי שתואר על ידי Kasman et al. 5 ולא מזרק מלא.

  1. תאים.
    1. יום אחד לפני ההשתלה, כאשר התאים הם כ 80% ומחוברות, מעבר תאים סרטניים MB49-PSA בתקשורת DMEM מלאה (בתוספת 10% FBS, 2 mmol / L L- גלוטמין, 0.05 מ"ג / מ"ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין, ו -200 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ב ביחס פיצול של 1: 2.
    2. ביום של ההליך, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם בעדינות עם מגרד תא סטרילי. מערבב כמויות שווות של השעית התאפתרון כחול 0.4% trypan. ספירת תאים חיים באמצעות hemocytometer. אין להשתיל אם יותר מ -20% מכלל התאים מתים.
    3. לחשב את הסכום של תאים חיים נדרש (2 x 10 6 תאים / מ"ל) ולהעבירם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. Re- להשעות את התא גלולה ב מדיה ריקה DMEM. חזור על לשטוף שלוש פעמים כדי להסיר את כל העקבות של FBS לפני ההשתלה.
    4. שמור על השעיית התא על קרח עד העכברים מוכנים להשתלה.
  2. אפשר העכברים C57BL נקבה 4 עד 6 שבועות בן / 6J להתאקלם במשך שבוע אחד לפני ההליך. כל עבודת החיה חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על תנאים סטריליים.
    1. לשקול כל עכבר ולהזריק הרדמה (75 מ"ג / ק"ג קטמין medetomidine 1 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף. Bodyweights צריך להיות בין 17 ו -22 גרם. אשר הרדמה על ידי התבוננות לא respoNSE לאחר קמצוץ הבוהן.
    2. לצורך זיהוי, סמן את האוזן באמצעות אגרוף באוזן.
    3. להזריק לקטט נתרן פתרון או תרכובת של הרטמן intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף כל 1 - H 2 עבור הידרציה.
    4. החל משחת עיניים סטריליות לשתי העיניים באמצעות נורת גפן סטרילי, מאז רפלקס המצמוץ אבד בהרדמה והעיניים להתייבש. מרחו את הקרם בעת הצורך.
    5. הנח את העכברים במצב שכיבה על מגבות נייר על גבי חפיסת חום (מופעלת על ידי מגע עם אוויר) כדי לשמור על טמפרטורת גוף ואת קלטת הרגליים האחוריות למטה.
  3. עם אצבע, להפעיל לחץ עדין באזור הבטן התחתונה ולאסוף שתן משלפוחית ​​השתן לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מדגם זה משמש כערך הבסיסי של PSA השתן.
  4. משיכה פולי- L- ליזין סטרילי (PLL) לתוך מזרק 1 מ"ל ולצרף קטטר IV 24-מד, עם stylet מחט הוסר. החל חומר סיכה על קצה הקטטר insERT קטטר דרך השופכה לשלפוחית ​​השתן באמצעות מלקחיים כדי להנחות את הצנתור. עצור כאשר ההתנגדות מורגשת. הערה: חוקרים צריכים לדון עם צוות הווטרינרים שלהם על הצורך בשימוש של ג'ל סיכה עם הרדמה עבור instillations שלפוחית ​​ושימוש משככי כאבים שלאחר ניתוח.
  5. להנחיל 50 μL של PLL לאט, בקצב של 10 μL כל 20 שניות, כדי למנוע ריפלוקס vesico-השופכן 18. השאר את הקטטר בשלפוחית ​​במשך 20 דקות עם פקק כדי למנוע זרימה החוצה.
  6. לאחר 20 דקות, להסיר את הקטטר ואת לפנות את השלפוחית ​​של כל התוכן על ידי לחיצה בעדינות על אזור הבטן התחתונה. באמצעות מזרק ריק 1 מ"ל, לשטוף כל תוכן הנותרים מתוך הקטטר.
  7. מערבבים תאים MB49-PSA ביסודיות על ידי pipetting למשוך אותם לתוך מזרק 1 מ"ל. צרף את הקטטר ולהחיל סיכה. להנחיל 50 μL של 1 x 10 5 תאים בקצב איטי של 10 μL כל 20 שניות. החלף את הפקק עלהקטטר. תן עכברים שליטים 50 μL של תמיסת מלח.
  8. לאחר h 1, להסיר את הצנתרים לפנות את השלפוחית ​​של כל תוכן. הסר את הסרט על הרגליים האחוריות ומניח עכברים על צדדי הגחון שלהם. להחיות את העכברים על ידי תת עורית הזרקת התרופה היפוך (1 מ"ג / ק"ג atipamezole) ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  9. צג העכברים עד תנועתיות הוא ציין. החזר את העכברים בכלובים שלהם.
  10. עם השלמת פרוטוקול זיהוי הגידול (סעיפים 5, 7, או 8), להרדים את העכברים באמצעות ה- CO 2. זיהוי פוסט מורטם גידול מתואר בסעיף 6.

צמיחת גידול ניטור 5. עם ELISA

הערה: גידול נוכחות וצמיחה מנוטרת בעכברים על ידי מדידת הפרשת PSA בשתן. חוקרים צריכים להתייעץ עם צוות הווטרינרים שלהם על ניטור בריאות בעלי חיים ורווחת השתלה שלאחר גידול ונקודות קצה אנושי.

  1. ישנן שתי שיטות לאיסוף שתן מעכברים.
    1. אסוף שתן במשך הלילה על ידי הצבת עכבר אחת בכלוב מטבולי הפרט שנועד להפריד שתן מחומר צואתי. אם ההגדרה אין קירור, להוסיף מעכב פרוטאז (100 μL) לתוך צינור איסוף שתן כדי למנוע של PSA השפלה לילה. עם זאת, מספר כלובי מטבוליים זמינים מגביל את השירות של שיטה זו של איסוף שתן.
    2. איפה זה מבחינה לוגיסטית אי אפשר להשתמש בכלובים מטבוליות (כגון בחדרי ABSL2), לאסוף שתן במקום באמצעות אצבע כדי להפעיל לחץ עדין על אזור הבטן התחתונה ואילו בעכברים מורדמים כמתואר בשלב 4.2.1. זה נעשה בדרך כלל לפני הטיפול הוא חדיר. מניסיוננו, לפחות 150 μL של שתן ניתן לאסוף 1 שעות לאחר הרדמה.
  2. מיד למקום בשתן שנאסף על הקרח. המטוריה תיתכן ראייה בין השבוע השני לאחר השתלת גידול. מאוד דגימות hemolyzed עשויות להשפיע ניתוח ELISA. לכן, שתןיש להציב על קרח לעבד במהירות לאחר איסוף.
  3. בצנטריפוגה צינורות השתן 6,700 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר תאים או פסולת.
  4. כדי לנרמל את ההבדל בתפוקת השתן בין עכברים, aliquot בשתן לתוך צינורות חדשים ולאחסן אותם ב -30 ° C עד ביצוע ניתוחים עבור PSA באמצעות ערכת ELISA 7 ו קריאטינין באמצעות ערכת assay 7. למרות עכברים אינם מייצרים PSA, יש רמות נמוכות של ספציפי ולא מחייב מזוהה באמצעות ELISA. לקבלת דוגמיות להיחשב חיובית, יש להגדיר את הסף ערכים יותר מאשר עכברים רגילים + 3 סטיות תקן (SD) 15.

6. נוכחות גידול זיהוי עם בזמן אמת PCR

  1. בסיום הטיפול, לנתח את חלל הבטן של העכבר ולאתר את שלפוחית ​​השתן. ובלו השלפוחית ​​ולמקם אותו לתוך cryovial. להקפיא מיד חנקן נוזלי.
  2. חלץ את הרנ"א על ​​ידי שמאחד את הרקמות בתוך extr RNAמגיב פעולה.
  3. בצע שעתוק לאחור בזמן אמת ניתוח PCR עבור PSA, כמתואר לעיל בסעיף 2.

צמיחת גידול ניטור 7. עם דימות פלואורסצנטי

  1. לייבל 1 x 10 7 תאים MB49-PSA עם פלורסנט לצבוע האינפרה-אדום הקרוב 19.
  2. Re-צלחת ו לקצור את התאים שכותרתו על 4 ימים, 7, 11, 14, 18, ו -21 כדי לבדוק אם התאים לשמור על כדאיות הקרינה על ידי cytometry הזרימה 20.
  3. שותל את תאי MB49-PSA שכותרתו שלפוחיות עכברים, כפי שתואר לעיל בסעיף 4.
  4. צג את צמיחת הגידול באמצעות מערכת דימות פלואורסצנטי כל יומיים.
  5. ביום הדמיה, לשקול להרדים את העכברים באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  6. לגלח את אזור הבטן כדי לחשוף את העור.
  7. מניחים עכברים בחדר הדמיה ולרכושתמונות של השלפוחיות באמצעות התוכנה המסופקת עם מערכת ההדמיה.
  8. להחיות את העכברים על ידי תת עורית הזרקת תרופה היפוך (1 מ"ג / ק"ג atipamezole) ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.

8. מעקב גדילה גידול עם הדמיה אולטרסאונד בתדירות גבוהה

  1. גידולים שתלו בעכברים, כמתואר לעיל בסעיף 4.
  2. כל יומיים, לפקח גדילת הגידול באמצעות הדמיה אולטרסאונד.
  3. ביום הדמיה, לשקול להרדים את העכברים באמצעות תערובת של קטמין הרדמה medetomidine (75 מ"ג / ק"ג ו 1 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), מוזרק intraperitoneally ברמה של 0.1 מ"ל לכל 10 גרם של משקל גוף.
  4. לגלח את אזור הבטן כדי לחשוף את העור.
  5. להנחיל 100 μL של תמיסת מלח 0.9% סטרילי לתוך שלפוחית ​​השתן באמצעות קטטר 24-מד IV. המלוח יהיה להתנפח השלפוחית ​​ולשפר את החשיפה במהלך הדמית אולטרסאונד.
  6. מניחים את העכבר על פלטפורמת אולטרסאונד ולהחיל ג'ל מוליך אל lבטן ower.
  7. מנמיך את חללית כף היד על העור ולרכוש תמונות-מצב B של שלפוחית השתן על פלטפורמת ההדמיה 21.
  8. להחיות את העכברים על ידי תרופת היפוך הזרקה תת עורי (1 מ"ג / קילו atipamezole) ברמה של 0.1 מיליליטר לכל 10 גרם של משקל גוף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרשת PSA מתאי MB49 נמצאה להשתנות עם תקשורת הצמיחה. MB49-PSA הוא גדל DMEM התקשורת כי זה תוצאות הפרשת PSA מוגבר (איור 1 א). כדי לקבוע את הרגישות של ELISA PSA בזמן אמת PCR, מספרים שונים של תאים מפרישי MB49-PSA היו מעורבים עם תאים הורית MB49. PSA ELISA מזהה מינימום של 1 x 10 5...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם 1) בהצלחה שמירה על tumorigenicity של הקו הסלולרי; 2) להבטיח הפרשת PSA למדידה לפני ההשתלה תאים סרטניים בעכברים; 3) יצירת השעית תא יחיד להשתלה כדי להפחית וריאציה בגודל גידולים; ו -4) הקניית תאים בקצב איטי כדי למנוע ריפלוקס vesico-השופכן, וכתוצאה מכך ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

References

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Cancer Research119orthotopic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved