マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

要約

このプロトコルは、雌のC57BL / 6Jマウスにおけるマウス同所性膀胱腫瘍の発生および腫瘍増殖の監視について説明します。

要約

このプロトコルは、ヒト前立腺特異抗原（PSA）、および腫瘍移植の確認のための手続きを分泌するように改変されたマウス膀胱癌細胞株MB49を使用して、雌C57BL / 6Jマウスに膀胱腫瘍の発生について記載しています。簡潔には、マウスは、注射可能な薬剤を使用して麻酔し、仰臥位に配置するために形成されています。尿が膀胱から空いており、ポリ-L-リジン（PLL）の50μLをゆっくりと24 G IVカテーテルを用いて、10μL/ 20秒の速度で滴下します。これは、カテーテルを栓により20分間膀胱内に残されています。カテーテルを除去し、PLLは、膀胱に優しい圧力で空きました。これは、10μL/ 20秒の速度でマウス膀胱癌細胞株（1×10 ⁵細胞/ 50μL）の注入が続きます。カテーテルは、早期の避難を防止するために栓をされています。 1時間後、マウスを反転薬物と復活され、膀胱が空にされます。遅い点滴速度が重要であり、それは腫瘍が上部尿路に、腎臓に発生させることができます膀胱・尿管逆流を減少させるので。細胞株は、よく、これは移植後凹凸腫瘍サイズをもたらすことができるように、細胞の凝集を減少させるために再懸濁されるべきです。

この技術は、高効率で腫瘍を誘導します。腫瘍の成長は、尿中のPSA分泌によって監視されています。 PSAマーカーのモニタリングは、膀胱内の腫瘍の存在を検出するための超音波又は蛍光イメージングよりも信頼性が高いです。放置すれば4週間 - マウスの腫瘍は、一般に、約3により最大サイズ悪影響を与える健康に達します。腫瘍増殖をモニタリングすることによって、正常に腫瘍を移植されなかったものから硬化したマウスを区別することが可能です。唯一のエンドポイント分析を用いて、後者は、誤って治療することによって硬化されていると仮定することができます。

概要

この方法の目的は、腫瘍移植なしのマウスは、エンドポイント分析で硬化されたと考えられないように、マウス同所性膀胱腫瘍を生成し、可能な限り正確に移植された腫瘍を監視することです。全体として、示された方法は、実験的な分析のためにマウスの多くの必要性を低減し、治療結果を決定する際に高い精度を確保します。

注入し、腫瘍細胞を皮下臨床疾患の環境を再現または治療戦略の開発を可能にしないように癌の同所性モデルの開発は、重要です。膀胱のアーキテクチャは、直接、最小限の全身作用を持つ膀胱に膀胱癌治療の点滴注入を可能にします。したがって、例えば、同所性モデルとして、この環境を再現する動物モデルは、新しい治療法を評価することが重要です。いずれの実験のセットアップから引き出された結論はdependenされていますモデルの限界時のトン。

いくつかの技術は、マウスにおける同所性膀胱腫瘍の産生のために開発されてきました。これらは、膀胱のグリコサミノグリカン層を損傷注入する腫瘍細胞を有効に頼ります。使用される技術は、膀胱^1,2内の1つのサイトで、腫瘍の発生につながる、膀胱壁に損傷の一点につながる電気焼灼を含みます。しかし、電気メスを用いた腫瘍移植の成功率は、オペレータに依存10から変化している - 90％、およびそれが腹腔内現像腫瘍を引き起こす、膀胱壁がパンクする危険性を含みます。化学焼灼は硝酸銀、損傷膀胱壁^3を用いて行われます。同様に、酸は、膀胱壁^4を損傷するために使用されています。トリプシンはまた、ウェル⁵のように、膀胱に損傷を与えるために使用されています。これらの方法は、膀胱内の複数の腫瘍の発達をもたらすことができます。化学物質は長すぎるために膀胱壁に接触して残っている場合はさらに、膀胱に重大な損傷の危険性があります。 Ninalga らによって開発された方法。正に帯電したポリ-L-リジン（PLL）被覆膀胱壁への⁶分子を使用します。これは、膀胱のグリコサミノグリカン層に固執する負に帯電した腫瘍細胞を可能にします。この方法は、一般に、膀胱内に開発複数の腫瘍を生じるが、腫瘍移植80である- 100％の^4,7。技術的には、また、実行するための最も簡単な手順です。開発腫瘍があってもサイズがかなりあることを確実にするために、腫瘍細胞は、移植前に大きな塊にグループ化されていないことが重要です。

治療効果を評価するためには、かなり類似したサイズの腫瘍を有するマウスにこの研究を実行するのが最善です。したがって、すぐに移植後に腫瘍の大きさを定量化することができ、良好な検出システムは、重要です。いくつかの戦略は、蜂を持っていますn個の腫瘍を評価するために使用されます。これらは、磁気共鳴イメージング^{（MRI）8-10、}蛍光^11、生物発光^12,13、超音波^14、および酵素結合免疫吸着アッセイ^{（ELISA）15,16を}含みます。 MRIと超音波が腫瘍細胞の改変を必要としないが、MRIのために敏感な機器およびコントラスト剤が必要とされています。 luminescence-、蛍光 - 、およびELISAベースのアッセイは、これらの方法によって検出することができるマーカータンパク質を発現する腫瘍細胞の改変を必要とします。発光のために、基板は、ルシフェラーゼ活性の検出のために必要とされます。このように、追加されたステップおよびコストの増大があります。発光と蛍光の両方が特殊な装置を必要とします。蛍光を生成するために、分子酸素によって触媒される緑色蛍光タンパク質（GFP）の環化は、必要とされます。このように、GFP発現は、このかなり信頼性の低いマーカー作り、酸素へのアクセスに応じて、腫瘍塊内で可変であってもよいです ^{17。代用マーカーとして、ヒト前立腺特異抗原（PSA）15,16を分泌するマウス膀胱癌細胞株MB49の変更は、別の戦略です。これらのマーカーはまた、実験の終了時に、腫瘍の存在を確認し、それらを免疫組織化学の代替を製造する代替手段を提供します。この研究は、同所腫瘍移植のPLL方式を報告し、腫瘍の検出システム、すなわちELISA、蛍光、および超音波イメージングの比較を示します。}

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プロトコル

すべての動物の作業は、動物使用上の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに付着し、シンガポール国立大学（プロトコル番号084/12）を取り扱います。

1. インビトロ MB49-PSAの細胞を増殖し、PSAの分泌を測定します

1. マウス膀胱癌細胞を37℃インキュベーター内で10％ウシ胎児血清（FBS）、2ミリモル/ LのL-グルタミン、および0.05ミリグラム/ mlのペニシリン-ストレプトマイシンを補充した完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でMB49-PSA ^15を維持^します °C、5％CO _2。 PSA分泌細胞の選択圧を維持するために200μg/ mLのハイグロマイシンBを加えます。
2. PSA分泌、プレート6ウェル培養プレート中で1×10 ⁶個^の細胞を決定し、48時間、5％CO ₂の存在下で37℃でそれをインキュベートします。
3. 2日後、PSA測定のための上清を収集します。
   1. パスツールピペットを使用して、SUPを転送します15mLの遠心管にernatant。
   2. 浮遊細胞および破片を除去するために、250×gで5分間遠心します。 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ中で30°C - PSAアッセイは、異なる日に行われた場合、に上清を保存します。ない場合は、すぐに次のステップに進みます。
   3. 人間のフリーPSA ELISAキット^7を使用して、PSA濃度を決定します。
4. 播種した細胞を列挙します。
   1. パスツールピペットを用いて、DMEM 1mLで穏やかに細胞を洗浄します。吸引し、完全にメディアを取り出します。
   2. 新鮮な培地の1 mLを加え、よくから細胞を取り除くために、セルスクレイパーで軽くこすり。
   3. マイクロ遠心チューブに細胞を移し、単一細胞懸濁液を確実にするために十分に再懸濁します。
   4. 細胞懸濁液と0.4％トリパンブルー溶液を等量混合します。血球計数器を使用して（色素を取り込まない）生細胞を数えます。
5. NGとPSA発現を算出メディア/ 10 ⁶細胞のPSA / mLと。 120 ngの/ mLの/ 10 ⁶細胞-マウスでの移植のためのMB49-PSA細胞のPSA発現は80です。

2. ELISAおよびリアルタイムPCR分析によって、PSA測定の感度を決定します

1. ウェル当たり1×10 ⁶個^の細胞（ すなわち、10 ^{0、10 1、10 2、10}の最大値が存在するように、親MB49細胞の異なる量の6ウェル培養プレート中の完全DMEM培地中でプレートMB49-PSA細胞^{3、10 4、10 5、}または10 ⁶ MB49-PSA細胞）は、それぞれ、10 ^{6、10 5、10 4、10 3、10 2、10 1、}または10 ⁰ MB49細胞と共に培養されます。
2. 1日後、ステップ1.3で説明したように、PSAの測定のために上清を収集します。人間のフリーPSA ELISAキット^7を使用して、PSA濃度を決定します。
3. 細胞からRNAを抽出します。
   1. 溶解しますRNA抽出試薬1ミリリットルを添加することにより、直接プレート中の細胞。
   2. 室温で5分間インキュベートし、マイクロ遠心チューブに細胞溶解物を移します。クロロホルム0.2 mLを加え、15秒間激しくサンプルをボルテックス。室温で3分間、それらをインキュベートします。
   3. 4℃で15分間、12,000×gでサンプルを遠心。慎重に相間を乱すことなく、新鮮なチューブに上部の水相（0.5ミリリットル）を転送。
   4. イソプロピルアルコール0.5 mLを加え。室温で10分間インキュベートします。 4℃で10分間、12,000×gでサンプルを遠心。チューブの底にRNA沈殿物を乱すことなく、完全に上清を取り除きます。
   5. 75％エタノール1mLで一回ペレットを洗浄。 4℃で5分間、7500×gで遠心分離します。すべてのエタノールを除去し、10分間空気乾燥さペレットを許可します。
   6. ヌクレアーゼフリー水30μL中のRNAを溶解させます。従ってを増加させるために60℃で5分間インキュベートlubility。
   7. 260ナノメートル（A260）での紫外線（UV）分光法を用いて吸光度を測定することにより、RNAを定量します。 RNAの純度を評価するために、280 nmの（A280）での吸光度を測定し、1.6を超えるべきであるA260 / A280比を計算します。
4. 2μgのRNAからcDNAを逆転写します。
   1. 氷上で反応液を調製し、0.2 mLチューブに移します。
   2. 簡単に言えば内容をスピンダウンし、気泡を除去するために、チューブを遠心します。
   3. 以下の条件でサーマルサイクラーにチューブをロードし、逆転写反応を行います。95℃で5分間、続いて37℃で60分。実行が完了した後、4℃でcDNAサンプルを保持します。
   4. 長期保存のために30°C - でサンプルを保管してください。
5. PSAと細胞質βアクチンのためのリアルタイムPCR分析を行います。ベータアクチンは、サンプルを正規化するために使用されます。 96ウェルナンプラーに逆転写されたRNA 100ngの上のアッセイを行いますTE。三連ですべてのサンプルをアッセイ。 50℃で2分間、変性95℃、95℃、15秒で10分間、および60℃で1分：次のパラメータを使用して40サイクルを行います。サイクル閾値35の（CT）での検出の下限を設定します。このように、35を超えたCT値を持つ任意のサンプルでは検出できないと考えられています。

3. MB49-PSAの細胞株の腫瘍形成性を維持

注：in vitroでの長期成長は腫瘍形成性の損失につながります。腫瘍形成性を維持するために、MB49-PSAの細胞株は、2年ごとに少なくとも一回、マウスを介して継代されています。

1. 細胞。
   1. 収穫は指数関数的に無菌のセルスクレイパーで軽くそれらをこすることによって細胞を増殖させます。細胞懸濁液と0.4％トリパンブルー溶液を等量混合します。血球計数器を使用して生細胞を数えます。細胞の20％以上が死んでいる場合は移植しないでください。
   2. 必要な生きた細胞の量を計算し（1×107細胞/ mL）および15mLの遠心管に移します。 4℃で5分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てます。 DMEMブランクメディアで細胞ペレットを再懸濁します。移植前にFBSのすべての痕跡を除去するために洗浄を3回繰り返します。
   3. マウスは移植のための準備が整うまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
2. 背側腹部にマウスの皮下腫瘍細胞を移植。
   1. （それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）で麻酔薬ケタミンの混合物を使用し、メデトミジン4〜6週齢のC57BL6 / Jマウスを麻酔、体重10gあたり0.1mLので腹腔内注射しました。
   2. 肌を露出させるために右脇腹を剃ります。
   3. ピンセットを用いて、皮下に24 G針を用いて、基礎となる筋肉からそれを分離し、細胞懸濁液（1×10 ⁶細胞）の0.1 mLのを注入するために皮膚を持ち上げます。針を除去しながら、腫瘍細胞が行うように、5〜10秒間注入部位をピンチ注射部位から漏出しません。
   4. 体重10グラム当たり0.1 mLのアチパメゾール（1mg / kg）の皮下注射でマウスを復活させます。
3. ノギスを用いて腫瘍直径を測定することにより、2日毎に腫瘍の増殖を監視します。腫瘍体積」は、「MMの両方において、最長寸法及び「b」は垂直な幅である、式V ^=（A-B）/ 2を使用して計算されます。
4. 腫瘍体積が少なくとも50 mm ³で（約7日）の場合、CO ₂でマウスを安楽死させます。 DMEM中で無菌条件下で滅菌ピンセットやハサミと場所との腫瘍塊を切り出します。
5. 6ウェル培養プレートに、無菌の外科用メスを用いて小片に腫瘍をミンチ。さらに、腫瘍を脱凝集する「乳棒」として1 mLのシリンジプランジャを使用してください。
6. 完全DMEMの3 mLを加え、維持する細胞をインキュベーター中、37℃で、5％CO _2。
7. 細胞はプラットに付着したら、E（1と2日間）、滅菌したパスツールピペットで静かに吸引することによって、メディア、破片、および非接着細胞を除去します。 DMEMで二回洗浄します。細胞を乱さないように注意してください。
8. DMEMの1 mLを加え、セルスクレーパーでそれらをこすることによって細胞を採取します。単一コロニーを選択して展開するには、96ウェル培養プレートにウェル当たり血球計数器およびプレート1細胞を用いて細胞数を計測します。培養の37℃での200μg/ mLのハイグロマイシンBを含むDMEM中で細胞を、5％CO _2。
9. 5日間 - すべての4メディアおよび抗生物質を変更します。彼らは約80〜90％のコンフルエントになるまで細胞を監視します。再プレートピペッティングにより24ウェル培養プレート上の細胞をウェルから細胞を除去します。
10. 24ウェル培養プレート中の細胞がコンフルエントになったら、細胞スクレーパーで掻き取ってそれらを除去し、6ウェル培養プレートにそれらをプレート。
11. 最高のPSAの秘密を使用してクローンをクライオ保存する手順1で説明したように、PSA分泌のための異なるクローンを選別イオンとは、将来のマウス実験のためにそれを使用しています。

4.腫瘍を移植

注：各マウスは、膀胱内のDMEMブランクメディアの50μLで1×10 ⁵ MB49-PSA細胞を移植されています。カテーテル内のデッドスペースに、常に余分なボリューム（マウス当たり余分少なくとも100μL）を準備します。別のアプローチは、Kasman らによって記載されているように、空気充填された注射器を使用することであろう。むしろ充填された注射器よりも^5。

1. 細胞。
   1. 一日、細胞を約80％コンフルエント、通路完全DMEM培地中のMB49-PSA腫瘍細胞（10％FBS、2ミリモル/ LのL-グルタミン、0.05ミリグラム/ mlのペニシリン - ストレプトマイシン、及び200を補充された移植前2：1のスプリット比で37℃、5％CO ₂にて/ mlのハイグロマイシンB）。
   2. 手続きの日に、無菌のセルスクレイパーで軽くそれらをこすることによって細胞を採取します。細胞懸濁液を等量混合し、0.4％トリパンブルー溶液。血球計数器を使用して生細胞を数えます。細胞の20％以上が死んでいる場合は移植しないでください。
   3. 必要生細胞（2×10 ⁶細胞/ mL）の量を計算し、15mLの遠心管に移します。 4℃で5分間、250×gで遠心分離し、上清を捨てます。 DMEMブランクメディアで細胞ペレットを再懸濁します。移植前にFBSのすべての痕跡を除去するために洗浄を3回繰り返します。
   4. マウスは移植のための準備が整うまで氷上で細胞懸濁液を保管してください。
2. 4〜6週齢の雌C57BL / 6Jマウスは、手順の前に1週間順化することができます。すべての動物の作業は、無菌状態を維持するために、生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。
   1. 体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内に各マウスを計量し、麻酔を注入（75ミリグラム/ kgのケタミンおよび1mg / kgのメデトミジン）。 Bodyweightsは17と22グラムの間であるべきです。何RESPOを観察しないことにより、麻酔を確認つま先のピンチの後にNSE。
   2. 識別のために、耳パンチを用いて耳をマーク。
   3. 水分補給のための2時間-体重10グラム毎に1あたり0.1 mLで腹腔内ハルトマンの溶液または化合物の乳酸ナトリウムを注入します。
   4. まばたき反射が麻酔下で失われ、目が乾くされているので、滅菌綿球を使用して、両眼に無菌眼軟膏を適用します。必要なときに再適用します。
   5. 体温を維持するために（空気との接触によって活性化される）熱パックの上にペーパータオル上で仰臥位でマウスを置き、下に後ろ足をテープで固定します。
3. 指で、下腹部に穏やかな圧力を適用し、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに膀胱から尿を収集します。このサンプルでは、​​尿中のPSAの基礎値として機能します。
4. 1 mLシリンジに無菌のポリ-L-リジン（PLL）を撤回し、削除針スタイレットで、24ゲージIVカテーテルを添付します。カテーテルおよびインの先端に潤滑剤を塗布カテーテル法を導くために鉗子を使用して膀胱に尿道を通してカテーテルをERT。抵抗が感じられるときに停止します。注：研究者は、膀胱内点滴注入のための麻酔薬との潤滑ゲルを使用する必要性および処置後の鎮痛薬の使用についての彼らの獣医学スタッフと議論する必要があります。
5. 膀胱尿管逆流^18を回避するために、10μLのすべての20 sの速度で、ゆっくりとPLLの50μLを植え付けます。流出を防ぐためにストッパーで20分間膀胱内のカテーテルを残します。
6. 20分後、カテーテルを取り外し、ゆっくりと下腹部を押して、任意のコンテンツの袋を空けます。空の1mLの注射器を使用して、カテーテルのうち残りの内容をフラッシュ。
7. ピペッティングにより完全MB49-PSAの細胞を混合し、1 mLシリンジにそれらを撤回。カテーテルを取り付け、潤滑剤を塗布。 10μLごとに20秒の低速で1×10 ⁵細胞の50μLを植え付けます。ストッパーを上に置き換えカテーテル。対照マウスに生理食塩水50μLを与えます。
8. 1時間後、カテーテルを除去し、任意のコンテンツの袋を空けます。後ろ足でテープを外し、自分の腹側面にマウスを置きます。体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。
9. 運動が観察されるまでマウスを監視します。ケージにマウスを返します。
10. 腫瘍検出プロトコル（セクション5、7、または8）が完了すると、CO _2を使用して、マウスを安楽死させます。死後腫瘍検出部6に記載されています。

ELISA 5.モニタリング腫瘍増殖

注：腫瘍の存在と成長は尿中のPSA分泌を測定することにより、マウスに監視されています。研究者は、動物の健康と幸福後腫瘍移植および人道的エンドポイントを監視する上での獣医のスタッフに相談してください。

1. マウスから尿を収集するための二つの方法があります。
   1. 糞便物質からの尿を分離するように設計された個々の代謝ケージに一匹のマウスを置くことによって、尿一夜を収集します。セットアップは、冷蔵されていない場合は、一晩PSAの劣化を防止するために、尿収集チューブにプロテアーゼ阻害剤（100μL）を加えます。しかし、利用可能な代謝ケージの数は、尿収集のこの方法の有用性を制限しています。
   2. それは（そのようなABSL2の部屋のように）代謝ケージを使用するロジスティック不可能である場合には、ステップ4.2.1で説明したように、マウスを麻酔しながら、下腹部に穏やかな圧力をかけるために指を使用して、スポット尿を収集します。治療が点眼される前に、これは通常行われています。私たちの経験から、尿の少なくとも150μLは、麻酔1時間後に収集することができます。
2. 直ちに氷上に採取した尿を置きます。血尿は、腫瘍移植後の第2週目から見ることができます。高い溶血サンプルは、ELISA分析に影響を及ぼし得ます。したがって、尿氷の上に置き、収集した後、迅速に処理しなければなりません。
3. 細胞またはデブリを除去するために4℃で5分間、6700×gで尿管を遠心。
4. 新しいチューブに尿尿マウスとの間出力、一定分量の違いを正規化し、アッセイキット^7を使用してELISAキット^7を使用して、PSAおよびクレアチニンのための分析を行うまで-30℃で保管してください。マウスは、PSAを産生しないにもかかわらず、ELISAを用いて検出された結合、非特異的低レベルがあります。サンプルが陽性であるとみなされるためには、しきい値は正常マウス+ 3標準偏差^（SD）15よりも大きい値に設定する必要があります。

リアルタイムPCR 6.検出腫瘍のプレゼンス

1. 終了時に、マウスの腹腔を分析し、膀胱を探します。膀胱を切除し、クリオバイアルにそれを置きます。液体窒素中で直ちに凍結します。
2. RNA EXTRで組織を均質化することにより、RNAを抽出アクション試薬。
3. セクション2で説明したように、PSAのための逆転写およびリアルタイムPCR分析を行います。

蛍光イメージング7.モニタリング腫瘍増殖

1. 近赤外蛍光色素¹⁹で1×10 ⁷ MB49-PSAの細胞を標識。
2. プレート-Reおよび細胞は²⁰フローサイトメトリーにより生存度および蛍光を保持するかどうかをチェックするために日4、7、11、14、18、および21上の標識細胞を収穫。
3. セクション4で上述したように、マウスの膀胱中の標識MB49-PSAの細胞を移植します。
4. 2日毎に蛍光イメージングシステムを用いて、腫瘍の増殖をモニターします。
5. 撮影の日に、（それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）麻酔薬ケタミンの混合物とメデトミジンを使用して、マウスを計量し、麻酔、体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内注射。
6. 肌を露出するために腹部を剃ります。
7. 撮像チャンバーにマウスを置き、取得イメージング・システムに付属のソフトウェアを使用して膀胱の画像。
8. 体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。

高周波超音波イメージング8.モニタリング腫瘍増殖

1. 4章で前述したように、マウスにおける移植片腫瘍を、。
2. 2日毎に、超音波イメージングを用いて腫瘍の成長を監視します。
3. 撮影の日に、（それぞれ、75ミリグラム/ kg及び1mg / kg）麻酔薬ケタミンの混合物とメデトミジンを使用して、マウスを計量し、麻酔、体重10グラム当たり0.1 mLで腹腔内注射。
4. 肌を露出するために腹部を剃ります。
5. 24ゲージIVカテーテルを用いて膀胱内に0.9％滅菌生理食塩水の100μLを植え付けます。生理食塩水は、膀胱を膨張させると、超音波画像中の視認性が向上します。
6. 超音波プラットフォーム上にマウスを置き、リットルに導電性ゲルを適用owerの腹部。
7. 皮膚へのハンドヘルドプローブを下げて撮影台²¹上の袋のBモード画像を取得します。
8. 体重10グラム当たり0.1 mLの逆転薬（1ミリグラム/キログラムアチパメゾール）を皮下注射によってマウスを復活させます。

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結果

MB49細胞からのPSAの分泌は、増殖培地と共に変化することが見出されました。これは、増加したPSA分泌（ 図1A）をもたらすため、MB49-PSAは、DMEM培地で増殖させます。 PSA ELISAおよびリアルタイムPCRの感度を決定するために、MB49-PSA分泌細胞の異なる数がMB49親細胞と混合しました。リアルタイムPCR分析は100 PSA分泌細胞/ 1×10 ⁶細胞（ 図

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ディスカッション

プロトコルの中で最も重要なステップは、1）が正常細胞株の腫瘍形成性を維持しています。 2）マウスにおける腫瘍細胞移植の前に測定可能なPSAの分泌を確実。腫瘍の大きさのばらつきを低減するように、3）移植のための単一細胞懸濁液を生成します。そして4）腎臓における腫瘍細胞移植の結果、膀胱尿管逆流を防止するために、遅い速度で細胞を浸透させます。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MB49-PSA cells	N/A	N/A	ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media	HyClone	SH30027.01
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media	Biowest	L0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South American	Biowest	S1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium	Biowest	S181B
Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30088.03
L-glutamine	Biowest	X0550
Penicillin-Streptomycin	Biowest	L0022
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010
free PSA (Human) ELISA kit	Abnova	KA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction	Ambion	15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Applied Biosystems	4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3	Applied Biosystems	4331182	Hs00426859_g1
C57BL/6J female mice	In Vivos		4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)	Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)	Local pharmacy
Ear punch	Electron Microscopy Sciences	72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactate	B Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment	Alcon
Heat pack - HotHands handwarmers	Heatmax Inc
Introcan Certo IV catheter	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jelly	Local pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
Quantichrom Creatinine Assay Kit	BioAssay Systems	DICT-50
Fluorescent dye - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution	Ambion	4427575
Name	Company	Catalog number	Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR System	Applied Biosystems
7500 Software v2.3	Applied Biosystems
Metabolic Cage	Tecniplast	Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system	BD Biosciences
BD FACSDiva software v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system	Caliper Life Sciences
Living Image Software v3.1	Caliper Life Sciences
Vevo 2100 imaging system	VisualSonics