ליפיד הפקת וניתוח שיטה לאפיון קרקע חיידקים בניסויים עם דוגמאות רבות

Summary

המאמר מתאר שיטה מגדילה את התפוקה תוך איזון המאמץ והדיוק של מיצוי שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש באפיון שתי ליפידים סה"כ ואת השפע היחסי של שומנים מחוון כדי לקבוע מבנה הקהילה מיקרוביאלית הקרקע במחקרים עם דוגמאות רבות.

Abstract

קהילות מיקרוביאליות הן נהגים חשובים ווסתים לתהליכי מערכות אקולוגיות. כדי להבין כיצד ניהול של מערכות אקולוגיות עשוי להשפיע על קהילות חיידקים, טכניקה מדויקת יחסית, אבל מאמץ אינטנסיבי כדי assay הרכב הקהילה מיקרוביאלי הוא חומצה שומן phospholipid (PLFA) ניתוח. PLFA פותח על מנת לנתח סמנים ביולוגיים של phospholipid, אשר יכולים לשמש כאינדיקאטורים לביומסה מיקרוביאלית ולהרכב של קבוצות תפקודיות רחבות של פטריות וחיידקים. זה נפוץ שימש להשוות קרקעות תחת קהילות צמחים חלופיים, אקולוגיה, ומשטרי ניהול. השיטה PLFA הוכח להיות רגיש לאיתור משמרות הרכב הקהילה מיקרוביאלית.

שיטה חלופית, חומצת שומן methyl אסתר מיצוי וניתוח (MIDI-FA) פותחה עבור מיצוי מהיר של סך שומנים, ללא הפרדה של חלק phospholipid, מתוך תרבויות טהור כמו טכניקה זיהוי מיקרוביאלי. שיטה זו היאמהירה אך פחות מתאימה לדגימות קרקע מכיוון שאין בה שלב ראשוני המפריד בין חלקיקי הקרקע ומתחיל במקום עם תגובת סבון, שעלולה לייצר ממצאים מן החומר האורגני ברקע בקרקע.

מאמר זה מתאר שיטה אשר מגדילה את התפוקה תוך איזון מאמץ ודיוק של מיצוי של שומנים מתוך קרום התא של מיקרואורגניזמים לשימוש אפיון שתי ליפידים הכולל ואת השפע היחסי של שומנים אינדיקטור כדי לקבוע קרקע קרקע מיקרוביאלית הקהילה במחקרים עם דוגמאות רבות. השיטה משלבת את הדיוק שהושג באמצעות פרופיל PLFA על ידי חילוץ וריכוז שומנים הקרקע כצעד ראשון, וצמצום המאמץ על ידי saponifying החומר האורגני שחולצו ועיבוד בשיטת MIDI-FA כשלב שני.

Introduction

בהתחשב בתפקיד המפתח של מיקרואורגניזמים רכיבה על רכיבי מזון ¹ , שינוי הרכב הקהילה צמח ² , תקנה של פרודוקטיביות הצמח ³ , ופירוק של חומר אורגני ⁴ , הבנה קהילות חיידקים הקרקע הוא חיוני להבנת מערכות אקולוגיות יבשתי.

בגלל השפע הגבוה יחסית שלהם בקרקע, והחתימה הכימית שלהם, ניתן להשתמש ביומרקים של השומנים על מנת לבחון את הקבוצות האקולוגיות הדומיננטיות המהוות קהילות חיידקים בקרקע ⁵ . על ידי כימות ביומרקים השומנים האופייניים לקבוצות מיקרוביאליות שונות, אנו יכולים להעריך את השומנים הכוללים, ולאחר מכן להפריד את השומנים הללו לקבוצות רלוונטיות מבחינה אקולוגית, כגון חיידק גראם חיובי (GM +) וגראם שלילי (GM-), מיקוריזה (AM) ו - saprotrophic פטריות, ו actinomycetes ^{5 ,} Ss = "xref"> 6 ^{, 7 , 8} .

ישנן שיטות רבות לאפיון היבטים של קהילות מיקרוביאליות. השיטה PLFA הוא אחד נפוץ להבנת מבנה הקהילה הבסיסית מיקרוביאלית. זוהי דרך יעילה להעריך את השפע היחסי של קבוצות חיידקים, כמו גם סך ביומסה מיקרוביאלית. בשל מחזור שומנים מהיר, פרופיל PLFA גם מאפשר זיהוי מהיר יחסית של שינויים בקרקע חיידקים הקרקע נותן מידע המאפשר השוואה של תפקוד המערכת האקולוגית, למשל, פטרייתי: יחסי חיידקים כדי להעריך את שיעורי רכיבי מזון מזין ^{1 , 9 , 10} . עם זאת, בעוד שיטת החילוץ PLFA הוא מכובד זמן מכובד, הוא גם זמן רב ואינו להשאיל את עצמו היטב בקנה מידה מחקרים אקולוגיים הדורשים מספר גדול של דגימות משכפל בקנה מידה השדהF "> 11 ^{, 12} .

לעומת זאת, חומצת השומן מתיל אסתר שיטת החילוץ (MIDI-FA) יש פוטנציאל לאפשר התפוקה המהירה. בשיטה זו, דגימות הם saponified, מומרים FAMEs, חילוץ, ולאחר מכן ניתח. שיטת ה- MIDI-FA היא מהירה אך מפלה פחות מ- PLFA, המשלבת מיצוי של שומנים עם הפרדת שיעורים שונים ¹³ (פוספוליפידים, ליפידים נייטרליים וגליקוליפידים).

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה המשלבת אלמנטים של שניהם PLFA ו- MIDI-FA פרופיל ליפידים. היא מעסיקה מיצוי של שומנים באמצעות שלבים הראשונים chloroform החילוץ של שיטת Bligh ו Dyer שונה, ולאחר מכן Saponification ולהמיר FAMEs. זה מספק דרך איתנה לזהות מבנה הקהילה מיקרוביאלית תוך הכללת הרבה רעש רקע מחומר לא מיקרוביאלי ^{5 , 14} . שיטה זו פותחה כדי להשיג איזון בין שני פרוטוקולי PLFA ו- MIDI-FA, כלומר, לשמור על רוב הדיוק תוך הגדלת התפוקה כדי לעשות את זה מבחינה לוגיסטית וכלכלית אפשרי לנתח שומנים ממחקרים בקנה מידה גדול עם דוגמאות רבות ¹⁵ . על ידי ביצוע החילוץ הראשוני ובידוד המרכיבים מסיסים אורגניים ( כגון שומנים) לפני ביצוע MIDI-FA, והשלמתם בשלב טיהור, הפרוטוקול מספק איזון בין מהירות ודיוק.

Protocol

הערה: יש ללבוש תמיד ציוד מגן אישי מתאים (PPE) לאורך כל התהליך. כדי למנוע זיהום מדגם פוטנציאלי, אין לגעת בכלי זכוכית בידיים חשופות. ללבוש כפפות מתאימות בעת הפעלת צעדים פרוטוקול הדורשים טיפול של כלורופורם.

1. ההכנות (2 ימים עבור ~ 40 דוגמאות)

1. איסוף אדמה לשקיות סטריליות התחבורה מהשדה במקרר המכיל קרח. אם לא ניתן לסנן אדמה טרי להקפיא יבש מיד, לאחסן את הדגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד מוכן להתחיל את הניתוח.
2. הכן קרקע על ידי homogenizing. הסר שורשים ואבנים ולשבור את הגושים על ידי סנון גס ( למשל 2 מ"מ).
3. היכונו להקפאת ההקפאה על ידי הצבת תת - מיכלים במיכל מתאים בהתאם להוראות של ידית ההקפאה והקפאה יבשה בהקדם האפשרי. לאחר קרקעות להקפיא מיובשים, לאחסן במיכל אטום עם desiccant עד החילוץ. עדיף sקרע להקפיא אדמה יבשה במינימום של -20 מעלות צלזיוס אבל רצוי ב -80 מעלות צלזיוס.
4. לקראת החילוץ, להסיר להקפיא קרקעות יבשים מן האחסון לטחון עד עקביות כמו קמח. שיטות שחיקה כוללים טחנת הכדור, מקצף הכדור, ואת מרגמה העלי. לאחר טחינה אדמה, לאחסן במקפיא (ראה 1.3).
   הערה: כמות המדגם המשמש להפקת החומר תלויה בתכולת החומר האורגני שלו. הנחיה כללית היא להשתמש 0.5-1 גרם של אדמה כי הוא 12 עד 18% פחמן לפי משקל, ו 3 ל 5 גרם לקרקע 1 עד 3% פחמן לפי משקל.
5. טרום לשטוף 30 צינורות צנטריפוגה מ"ל עם הקסאן. הוסף כ 2 עד 3 מ"ל של הקסאן צינורות ו מערבולת במשך 5 שניות. הקסאן דשן לצינור אחר, ו מערבולת. הקסאן (2 עד 3 מ"ל) ניתן להשתמש כדי לשטוף שש ברציפות צינורות. חנות hexane שטיפות צינורות הפוך על מכסה המנוע קטר ולהשליך הקסאן משומש במיכל פסולת המתאים.
6. לעטוף את כלי זכוכית ב 2 עד 3 שכבות של רדיד אלומיניום במקום תנור muffle. לֶאֱפוֹת(Muffle) כלי זכוכית ב 450 מעלות צלזיוס במשך 4.5 שעות.
7. הכינו ריאגנטים.
   1. עבור כמות הקרקע המשמשים, להוסיף כימיקלים יחס 0.8: 1: 2 נפח עבור חיץ פוספט (P-Buffer): CHCl ₃ : MeOH.
   2. הכן פתרון P-Buffer: מאגר פוספט: 0.1 M, pH 7.0.
      1. הוסף 61 מ"ל של 1M K ₂ HPO ₄ מניות, סטרילית (כימית צריכה להיות ACS מוסמך בכיתה או יותר). הוסף 39 מ"ל של 1 M KH ₂ פו ₄ מניות, סטרילי (כימי צריך להיות ACS מוסמך בכיתה או יותר). ממלאים 1000 מ"ל עם מים סוג 1. התאמת pH ל 7.0 עם NaOH או HCl. אחסן פתרון שאינו בשימוש עד 7 ד בטמפרטורת הסביבה או 30 יום במקרר.
      2. לחלופין, לשקול את 10.62 גרם של K ₂ HPO ₄ ו 5.31 גרם של KH ₂ PO ₄ ; לדלל ל 1 עם מים סוג 1. בדוק את pH, כוונן במידת הצורך.
   3. הכן מגיב 1, מגיב Saponification.
      1. לוותר 300 מ"ל של מים סוג 1.הוסף 300 מ"ל של CH ₃ OH (כיתה HPLC או גבוה יותר). הוסף 90.00 גרם של NaOH (ACS מוסמך או יותר). מוסיפים את כדורי NaOH לפתרון תוך ערבוב. מערבבים עד לפרקים להתמוסס. מומלץ לאחסן פתרון זה לא יותר מ 30 ד.
   4. הכן מגיב 2, מגיב מתילציה.
      1. לוותר 275 מ"ל של CH ₃ OH (כיתה HPLC או גבוה יותר). הוסף 325 מ"ל של מאושר 6.00 N HCL תוך ערבוב. מומלץ לאחסן פתרון זה לא יותר מ 30 ד.
   5. הכן מגיב 3, מיצוי חילוץ: 50% C ₆ H ₁₄ (הקסאן), 50% C ₅ H ₁₂ O (MTBE).
      1. במנדף קטר, לשלב 200 מ"ל של C ₆ H ₁₄ (כיתה HPLC או גבוה יותר) ו 200 מ"ל של C ₅ H ₁₂ O (כיתה HPLC או גבוה יותר). לערבב היטב; כובע בחוזקה. חנות ב דליקות ארון או מכסה המנוע קטר לא יותר מ 1 שנה.
   6. הכן מגיב 4, בסיס לשטוף מגיב.
      1. לוותר על 900מ"ל של סוג 1 מים כוס. הוסף 10.80 גרם של NaOH (ACS מוסמך או יותר) תוך ערבוב. מערבבים עד לפרקים להתמוסס. מומלץ לאחסן פתרון זה לא יותר מ 30 ד.
   7. הכן פתרון המניות של תקן פנימי.
      1. לשקול את 100 מ"ג של 19: 0 תקן EE. מוסיפים 50 מ"ל של הקסאן שטיפה בקבוק שטיפה. הוסף ~ 15 מ"ל של פתרון Hexane-MTBE (מגיב 3) כדי בקבוק, מערבולת להתמוסס. למעלה מ 50 מ"ל עם פתרון Hexane-MTBE (מגיב 3). כובע מערבולת לערבב. העברה צינורות זכוכית שטוף הקסאן עם כובעים PTFE בשורה ואת החנות ב -20 מעלות צלזיוס.

2. יום 1 - מיצוי של חומצות שומן מן הקרקע (4 עד 5 שעות עבור ~ 40 דוגמאות)

1. הכן שלושה 5-10 מ"ל מחלק טפטפות עבור חיץ P, כלורופורם, מתנול.
   הערה: חלופות פחות מסוכנות לכלורופורם הוצעו כמחליפים. אלה עשויים לגרום לשיעורי התאוששות השומנים השווה ¹⁶ , ¹⁷ , אך אינם מוערכים בפרוטוקול זה.
2. שקלול להקפיא מיובש קרקעות לתוך צינורות צנטריפוגה 30 מ"ל שיא הקרקע אדמה.
3. לעשות שני החסר לכלול תקן לבדוק (אדמה כי כבר חילוץ בעבר).
4. במנדף קטר, להוסיף את ריאגנטים לקרקע בצינור צנטריפוגות בסדר הבא: P-Buffer, CHCl ₃ , ו MeOH (טבלה 1). אפשר לקרקעות זמן רטוב לאחר תוספת P-Buffer לפני הוספת CHCl ₃ . כובע צינורות צנטריפוגה בחוזקה לכסות כדי להגן מפני האור.
5. מניחים אותם על שייקר אופקית ולוודא שהם מאובטחת היטב. עם הגדרת מהירות על 280 סל"ד, ללחוץ למשך 1 שעה ¹⁸ .
6. הכן שני 16 מ"מ x 150 מ"מ צינורות זכוכית עבור כל מדגם כדלקמן: תווית הצינור ולהוסיף את אותו נפח של CHCl ₃ נפח שווה של חיץ P.
7. הסר את צינורות צנטריפוגה מן שייקר צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1,430Xg ו 25 ° C. הפרדת השלב צריך להיות גלוי בצינור הזכוכית.
8. במנדף קטר, decant supernatant מן צינור צנטריפוגות לתוך אחד של צינורות מוכן בשלב 2.6. חזור על שלבים 2.4 עד 2.5 ו decant supernatant לתוך הצינור השני.
9. מכסים היטב את כל 16 מ"מ × 150 מ"מ צינורות זכוכית עם כובעים PTFE מרופד להפוך 10 x לערבב.
10. אפשר הדגימות לעמוד ללא הפרעה בן לילה כדי להשלים הפרדה של שני השלבים. כדי לעשות זאת, לשמור על דגימות בארון כהה / שטח או מכוסה רדיד אלומיניום בטמפרטורת החדר. זה מקובל לאפשר את תמציות להפריד במהלך סוף השבוע.
    1. לחלופין, אם אחד רוצה לעבור ישירות לשלב הבא, או אם דגימות לקבל מופרע למחרת, צנטריפוגות דגימות במשך 10 דקות ב 1000 xg ו 25 ° C.
       הערה: שים את כל הדגימות בתוך קבוצת השוואה לאותו זמן עמידה בהפרדת פאזה.

3. יום2 - בידוד של ליפידים (3 עד 4 שעות עבור ~ 40 דוגמאות)

1. הפעל את מנגנון אידוי מלכודת ממס. הגדרת מנגנון אידוי ל 33 ° C ו מחממים.
2. הגדרת aspirator ואקום על מכסה המנוע: בקבוק זרוע צד המחובר משאבת ואקום, אורך של טוהר גבוהה צינורות זכוכית.
3. לשאוב את השכבה העליונה ממשק (כ 2/3 של הדרך למטה) של שתי צינורות זכוכית, שמירה על שכבת מימית. חזור על התהליך באמצעות פיפטה נקי עבור כל מדגם.
4. שלב את שכבות מימיות של תמצית מהצינור השני עם זה בצינור הראשון על ידי decanting בזהירות. ודא כי הצינור להיות decanting ללא שריטות או סדקים.
5. לאחר תמציות CHCl ₃ משולבים, לבדוק את הנוזל - זה צריך להיות ברור. אם לא מוסיפים את MeOH עד להבהרה.
6. יבש את כל הדגימות באמצעות מנגנון אידוי ואקום. התחל עם הגדרות של טמפרטורה 33 מעלות צלזיוס, מהירות מערבולת 26%, ולחץ 400 mbar.
7. עמ 'תחרה את הדגימות במערכת אידוי ולאחר 10 דקות לאט להוריד את הלחץ 350 mbar.
8. מעקב אחר התקדמות וכאשר רמת נוזל הצינור הגיע לרמה של בלוק החימום, להקטין את הלחץ 300 mbar.
9. המשך לעקוב אחר הגובה של הנוזל הנותר וכאשר הוא כ 1 ס"מ לעומק, להקטין את הלחץ 200 mbar.
10. לאחר דגימות יבשים, להסיר דגימות ולהפעיל את המשאבה במשך 10 דקות נוספות כדי לנקות את האדים.
11. מכסה את צינורות בחוזקה לאחסן את השומנים במקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
12. השליכו את הנוזל השואף בהתאם לתקנות הבטיחות הכימיות המתאימות.

4. יום 3 - ספוניפיקציה ומתילציה (6 עד 7 שעות עבור 40 ~ דוגמאות)

1. הפעל את אמבטיות המים. הגדר אמבטיה 1 עד 95 ° C אמבטיה 2 עד 80 ° C.
2. הגדר את מכשירי פיפטה ולוודא שהם מחלקים את עוצמת הקול הנכונה.
   מגיב 1: 1 מ"ל לדגימה
   מגיב 2: 2 מ"ל לדגימה
   מגיב 3: 1.25 מ"ל לדגימה
   מגיב 4: 3 מ"ל לדגימה
   הערה: תהליך החימום יבנה לחץ בצינור. אל תשתמש בשפופים, סדוקים או סדוקים.
3. באמצעות מנפק צנרת להוסיף 1.0 מ"ל של מגיב 1 לשומנים מיובשים. כובע בחוזקה, מערבולת עבור 5 ו מקום במעמד.
4. מניחים את המדף של צינורות מדגם לתוך 95 מעלות צלזיוס אמבט מים עבור 5min. הסר את המדף של צינורות מן האמבטיה לבדוק את צינורות דליפות, מסומן על ידי בועות העולה בצינור. להדליק מחדש או להחליף את כובעי צינורות דולף, ולבדוק שוב עבור סדקים או צ 'יפס. המשך חימום צינורות באמבט מים במשך 10 דקות נוספות.
5. הסר דגימות מן האמבטיה 1 ומקום באמבטיה 2 (80 ° C) ולהמשיך הדגירה עוד 15 דקות.
6. הסר את צינורות מגניב דגימות ידי הצבת המדף לתוך מחבת מי ברז לקירור.
7. הוסף 2 מ"ל של מגיב 2 לכל מדגם. שווי בחוזקה ו מערבולת במשך 5 עד 10s.
מניחים את המדף לתוך האמבטיה 80 מעלות צלזיוס ו דגירה במשך 10 דקות.
8. הסר את המדף של צינורות מן האמבטיה במים והכניסו לתוך מחבת מי ברז לקירור. לעצב את המדף של צינורות להאיץ את תהליך הקירור.
   הערה: אל תחרוג מהזמן ומהטמפרטורה. חימום רב מדי עלול לשבש את FAME.
9. באמצעות מנפק צנרת להוסיף 1.25 מ"ל של מגיב 3 לכל צינור מדגם לחלץ את חומצות שומן מתיל אסטרים. שווי חזק ולשים את צינורות על שייקר במשך 10 דקות.
10. לאחר רועד, לאפשר את המדף של צינורות לשבת 10 דקות עבור השלבים להיפרד. מעבירים את השלב האורגני (השכבה העליונה) ל 16 מ"מ x 100 מ"מ זכוכית הבדיקה באמצעות שפופרת זכוכית.
11. חזור על החילוץ על ידי הוספת שוב מגיב 3, רועד, המאפשר שלבים נפרדים, והעברת השלב העליון.
    הערה אל תעביר את השלב התחתון. זה בסדר להשאיר כמות קטנה של השלב העליון בצינור.
12. באמצעות מתקן pipet, להוסיף 3 מ"ל של מגיב 4 ל thE 16 מ"מ x 100 מ"מ צינורות.
13. שווי מבחנות הבדיקה בחוזקה מערבולת עבור 20-30 s.
14. לאחר vortexing, צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1000 × גרם.
15. באמצעות פיפטה זכוכית נקייה, לשאוב את השלב האורגני העליון ולהעביר בקבוקון 4 אמפר אמפר.
16. הפעל את מנגנון אידוי מלכודת ממס. הגדרת מנגנון אידוי ל 30 מעלות צלזיוס, מהירות מערבולת ל -26%, את ואקום 200 mbar, ולחץ מראש.
17. עקוב אחר ההתקדמות. לאחר דגימות יבשים, להסיר דגימות ולהפעיל את המשאבה במשך 10 דקות נוספות כדי לנקות את האדים.
18. הסר פיפטה של ​​בקבוקי מגיב 1 ו 4 ו לשאוב דרך כמה חומצה לדלל ( למשל 1% HCl), ואחריו מים DI. שוטפים את הצינור המשמש מגיב 2 על ידי שאיבת מים DI. במכסה המנוע, לנקז את הממס מן הצינור המשמש מגיב 3 לתוך מיכל מתאים ולשמור אותו מכסה המנוע עד שאריות ממס התאדו.
19. חנות pipets הפוך, עם plungers הוסר כדי למנוע סטיקיןG של שסתומי הסימון.
20. השתמש פעם צינורות זכוכית ולאחר מכן להשליך במיכל המתאים.
21. במכסה המנוע, לאפשר שאריות ממס על כלי זכוכית להתאדות.
22. יש לשטוף כלי זכוכית עם מים נקיים ופתרון דטרגנט.

5. יום 4 - הכנת פתרון עבודה והעברת FAMEs לצנצנות GC (2-3 שעות עבור ~ 40 דוגמאות)

1. איסוף חומרים: 4 מ"ל בקבוקי ענבר עם דגימות מיובשות; ענבר 2 מ"ל GC צלוחיות; 400 μL שטוח שטוחה מוסיף זכוכית וכובעים; 500 מזרק זכוכית μL; 50 מ"ל volumetric בקבוק; פתרון צילומים - ethyl nonadecanoate (19: 0 EE תקן פנימי) ב 50/50 הקסאן / MTBE (מגיב 3).
2. באמצעות מזרק זכוכית, להוסיף 500 μL של אתיל nonadecanoate (19: 0 EE) פתרון המניות בקבוק 50 מ"ל וולומטרי.
3. מילוי בקבוקון כדי volumetric ציון עם מגיב 3.
4. בקבוק הבקבוק ואת להפוך 5x לערבב.
5. מעבירים 3 מ"ל ל בקבוקון נקי 4 מ"ל למאגר פתרון עבודה.
6. שימוש במזרק זכוכית e, להוסיף 300 μL של פתרון עובד לכל אחד של בקבוקי 4 מ"ל המכילים את חומצות שומן מתיל אסטרים מתיל וכובע.
7. וורטקס המדגם עבור 15 ו להפריש לעמוד במשך 15 דקות.
8. באמצעות זכוכית פסטר פיפטה, בזהירות להעביר את השמן מושעה חומצה מתיל אסטרים כדי 2 בקבוקון GC מ"ל המכיל 400 μL להוסיף.
9. חנות אטום GC צלוחיות במקפיא -20 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
10. שלח דוגמאות לניתוח GC.
    הערה: הניתוח חייב להתבצע באמצעות עמודה מסוימת GC ותנאים המתוארים קובץ משלים S1 . עדיף כי ניתוח GC יושלם בתוך 2 שבועות של מתילציה.

תוצאות

ניתן לאסוף את טבלאות הנתונים מהדוחות לגיליון אלקטרוני או למסד נתונים. לאחר התאמת גורם התגובה (גורם תיקון מנרמל את התגובה עבור אורכי שרשרת שונים), אזורי שיא ניתן להשוות עם אזור שיא של סטנדרטים חיצוניים או פנימיים להגיע ריכוז התמצית. על ידי חלוקת מסה על ידי המסה של הקרקע שחולצו, הנתונים יכולים לבוא לידי ביטוי כמו מסה של FAME לכל גרם של אדמה או, על ידי שימוש במשקל מולקולרי של כל תהילה, נפוץ יותר דיווחו לכל גרם של אדמה. סכום של FAMEs חיידקים מעיד על סך ביומסה מיקרוביאלית, וניתן להשוות בין הטיפולים ( איור 1 ). FAMEs מסוימים יכולים להיות קשורים גם עם קבוצות מיקרוביאליות מסוימות כגון חיידקים חיוביים או גראם שלילי חיידקים, actinomycetes, פטריות mycorrizal arbuscular, פטריות saprotrophic ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . יחסי המסה של ביומרקרים ספציפיים יכולים לשקף את השפע היחסי של קבוצות אלה ( איור 2 ). התבנית הכוללת של דפוסי השפע יוצרת טביעות אצבע ברמת הקהילה, המאפשרות השוואה בין הבדלים בקהילות המיקרוביאליות באמצעות טכניקות רב-משתניות כגון הסמכה ( איור 3 ). בניגוד לרוב הגישות המבוססות על דנ"א, ניתן לנתח את נתוני השומנים ברמת הקהילה ברמת השכיחות היחסית או המוחלטת. אם ביומסה כוללת שונה באופן משמעותי בין דגימות, שתי גישות אלה ייתן תוצאות שונות מאוד; השאלות האקולוגיות העומדות בבסיס הניסוי צריכות לקבוע באיזו גישה נעשה שימוש.}

F תצורה 1 : סך הכל ביומסה FAME. השוואה של ביומסה ביומסה סך הכל FAME (nmol G ^-1 אדמה) מתירס מתמשך, ערבה מופרית, ערבה unfertilized. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 : ביומסה FAME של חיידקים ופטריות. השוואת הטיפול של ביומסה ביומסה חיידקית פטרייתית חיידקים פטריית (nmol G ^-1 אדמה) מתירס מתמשך, ערבה מופרית, ערבה unfertilized.Fungal ו מסה חיידקית מ שפע מוחלט. ממוצע (סכום f / סכום ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 3 : קנה מידה מימדתי לא-ממדי של סמנים ביולוגיים של שומנים. השוואה של הקהילה מיקרוביאלית הכוללת באמצעות פרופילים שפע מוחלט מוחלט של כל ביומרקרים השומנים מיקרוביאלית FAME. בדוגמה זו, תירס מתמשך קהילות ערבה unfertilized מופרדים מרוחקים מאוד זה מזה בעוד כמה דגימות הערבה מופרות יש קהילות חיידקים הדומים אלה תירס, ואחרים דומים הערבה unerttilized. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלה 1: T h e כךסוג l Ven t, propor ti על s הוסיף g ^-1 אדמה, יר' אורד ד t h EIR o F להוסיף ITI o n. זה חשוב עבור מיצוי נכונה הפרדה של שלבים אורגניים מימיים.

Discussion

לבדיקת דגימות מרובות מניסויים עם משכפלים רבים ו / או יחידות ניסיוניות, החוקרים עשויים למצוא ניתוח חומצות שומן phospholipid (PLFA) להיות אוסרני במונחים של זמן וחומרים ²⁵ . בשיטה PLFA, פוספוליפידים של קרום התא מופקים, מטוהרים, וזיהה באמצעות Bligh שונה ו דאייר ²⁶ שני מיצוי מיצוי אורגני. זה ואחריו מוצק שלב סיליקה כרומטוגרפיה לשומנים נפרדים על ידי הקוטביות, מתילציה אלקליין של חומצות שומן phospholipid לתוך אסטרים חומצת שומן מתיל. ב PLFA פרופיל תשוקת השומנים יכול להיות נמוך אבל של טוהר גבוה מאוד. זיהוי מיקרוביאלי הציג שיטה חלופית, חומצת שומן methyl-ester הליך (MIDI-FA). בשיטת MIDI-FA, כל השומנים מופקים ישירות מתרבויות טהורות או מדגמי קרקע / משקעים ^{11 , 12 , 27} דרךסִבּוּן. בשיטה זו יש אובדן שומנים נמוך יותר, כי אין לו של ריכוז או טיהור השלבים של שיטת PLFA. עם זאת, בעוד שיטת MIDI-FA הוא מהיר וזול יותר, כי זה תוכנן במקור לזיהוי אורגניזמים בתרבות טהורה, אין הטמעה ראשונית או טיהור צעדים. לכן, זה יכול לכלול תרכובות דמויי שומנים co-extracted מחומר אורגני אדמה המעוותים את חתימת הקהילה ^{27 , 28 , 29} . בגלל הכללה זו יכולה גם לעוות ביומסה אמצעים, MIDI-FA יש בדרך כלל שימש רק גס איכותי לתאר שומנים ¹³ .

הנוהל המתואר כאן משלב את הטוב ביותר של שני הליכי הפקה נפרדים: 1) מיצוי וריכוז של שומנים בשיטת Bligh ו -Dyer ²⁶ המתוקנים, ו- 2) חומצת השומן מתיל אסתר saPonification, מתילציה, מיצוי, ואת הליך לשטוף בסיס פיתחה מסחרית. שיטה זו פותחה כדי להשיג את היתרונות של שני הפרוטוקולים הללו תוך מזעור החסרונות ¹⁵ . על ידי ביצוע החילוץ הראשוני ובידוד המרכיבים מסיסים אורגניים ( למשל שומנים) לפני ביצוע MIDI-FA, והשלמתם בשלב טיהור, פרוטוקול זה מציע איזון בין מהירות ודיוק. למרות ששיטה זו עשויה שלא להיות מתאימה כאשר נדרשת טוהר גבוהה ( כלומר , בניתוח של ¹³ C PLFA) או בעת ניתוח פוספוליפידים ושומנים נייטרליים בנפרד, במקרים רבים היא מאפשרת זיהוי של תגובות קהילתיות מיקרוביאליות לתנאים סביבתיים בעלי רגישות רבה יותר מאשר דנ"א שיטות ^{30 , 31 , 32 , 33} . שומנים ממברנה להתפרק במהירות לאחר המוות התא מאפשר להםלשקף את קהילת חיידקים שחיים בזמן הדגימה ^{5, 7,} בניגוד DNA הסביבתי שבו חלק ניכר מהמידע מגיע אורגניזמים מתים או לא פעילים ^34. בהתחשב בשיעור גבוה של תרדמת שנצפתה בין מיקרואורגניזמים קרקע ³⁵ , אפיון של ביומסה חיה ניתן להשתמש כדי להבין אינטראקציות הזמני צמח הזמני בקנה מידה טמפוררי בסדר גמור ביומרקים השומנים ניתן להשתמש כדי assay מעמד פיזיולוגי של הקהילה חיידקים ⁷ . הוכח כי שיטות תפוקה גבוהה נדרשים כדי להעריך את התגובה מיקרוביאלית בהגדרות שדה גדול ²⁵ , בעוד השיטה המוצעת כאן לא לשכפל את הדיוק של פרופיל ביומרקר PLFA, זה מגדיל את התפוקה תוך מזעור השתנות הבין עם MIDI-FA תהליך. השיטה הוכיחה להיות כלי יעיל לטפלשאלות הקשורות לדינמיקה קהילתית מיקרוביאלית על מגוון רחב של קרקעות במחקרי חקלאות ומערכות אקולוגיות גדולות ^{36 , 37 , 38 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50} .

שיעורים ליפידים משולבים עם שיטה זו וייתכן שיש אובדן של המידע הכלול באותם סוגים נפרדים ^{22 , 39} , אבל שילוב של שיעורים השומנים עשוי לחזק את הכוח לזהות את מקור הפטרייה המרקוריזה arbuscular של 16: 1 ω5c משני phospho - ו ⁴⁰ נייטרלי-ליפידים. בנוסף, בעוד tהוא מספר של חומצות שומן לא ידועות (אשר יכול להיות נגזר חומר אורגני שאינו חי) עשוי להיות גבוה יותר עם שיטה זו, הוא הראה להיות נמוך יותר מאשר MIDI-FA ומאפשר השוואה הטיפול של פרופילים שומנים ממחקרים עם דוגמאות רבות שבו מדגם קיבולת התפוקה היא דאגה ¹⁵ . השבר הנייטרלי נחשב בדרך כלל לנפח שומנים המופקים על ידי פטריות, אם כי ייתכן שיש גם תרומה קטנה יותר של חיידקי קרקע ⁴¹ . לאור זאת, השיטה המתוארת כאן עשויה להניב תוצאות המראות תרומה גדולה יותר של השומנים הפטרייתיים 18: 2 ω 6,9c ו- 18: 1 ω 9c מאשר PLFA. השומנים האחרים הנוטים להופיע בחלק הנייטרלי כוללים חלק מחומצות השומן הרוויות, למשל 16: 0, 18: 0, 20: 0.

ישנן דרכים שונות שבהן נתונים השומנים ניתן לבטא ונותחו. הייצוגים הנפוצים ביותר הם שפע (nmol g ^-1 אדמה), שומה פרקטיקהN (nmol הפרט lipid nmol ^-1 סה"כ שומנים), ואת השומה אחוז (השומה חלק * 100). מנורמל על ידי סך השומנים במדגם, חלק השומה אחוז השומה הם אמצעים של השפע היחסי של השומנים נתון. לאחר שינוי מתאים, למשל , arcsine מרובע שורש, השומה חלק מתאים לשימוש בניתוח על ידי רכיבים עיקריים או הסמכה ניתוח יתירות. השפע הוא כמות מוחלטת של השומנים נתון שחולצו לכל גרם של אדמה. בגלל כמות שומנים לכל תא הוא קבועה למדי, ואת מיצוי השומנים הוא יעיל ביותר ומקיף, שפע כולל הוא אומדן טוב של שומנים הכוללים השפע של אינדיקטורים מרכזיים משקף את ביומסה של הקבוצה האקולוגית הוא מייצגת ^17. לבסוף, דרך טובה להסתכל על הרכב הקהילה מיקרוביאלית היא להשתמש בשיטות ניתוח רב משתנים ¹⁶ , למשל , שיטות הסמכה כגון קנה מידה רב ממדי nonmetric (NMDS -אשר אינו זקוק לשינוי נתונים) או ניתוח רכיבים עיקריים (PCA), יכול להיות שימושי עבור השוואת השפע היחסי של כל ביומרקרים השומנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RapidVap	Labconco	7900000	Evaporative system
RapidVap	Labconco	7491400	Sample block
Chem-resistant vacuum pump	Labconco	7584000	Vacuum pump
Chemical trap cannister	Labconco	7815300	Trap cannister
Solvent insert	Labconco	7515200	Solvent trap insert
Diaphragm pump	Welch	7398000	DryFast vacuum pump
Water bath	Fisher	15-462-15Q	2 well water bath
Gas chromatograph	Various	N/A	For sample analysis
Centrifuge	Various	N/A	For sample separation
Freeze Dryer	Various	N/A	For sample lyophilization
Repipet (6)	BrandTech	4720440	For dispensing reagents
Vortex	Fisher	02-215-365	Analog vortex mixer
Teflon centrifuge tubes	Thermo/Nalgene	3114-0030	Teflon sample tubes
Caps	Thermo/Nalgene	DS3131-0020	Caps for teflon tubes
Test tube	Corning	9825-16	16x100mm tubes
Test tube	Corning	9825-16xx	16x150mm tubes
Caps	Corning	9998-15	15-415 thread black phenolic caps w/PTFE liner
Pasteur pipets	Fisher	13-678-20B	14.6cm
500 uL glass syringe	Fisher	13684106LC	Hamilton 81217
Amber vials	Agilent	5182-0716	4mL Amber vials
Caps	Agilent	5182-0717	Blue screw caps
Inserts	Agilent	5181-3377	400uL flat bottom glass inserts
Standards
19:0 ethyl nonadecanoate (Ethyl nonadecanoate)	VWR	TCN0459-5G	Analytical standard
Chemicals
Dipotassium phosphate (K2HPO4 - ACS grade or better)	Various	N/A	For making Phosphate-Buffer
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4 - ACS grade or better)	Various	N/A	For making Phosphate-Buffer
Methanol (CH3OH - HPLC grade or better)	Various	N/A	For making Reagents 1 & 2
Sodium hydroxide (NaOH - ACS grade or better)	Various	N/A	For making Reagents 1 & 4
Hydrochloric acid (6N HCL)	Various	N/A	For making Reagent 2
Hexane (HPLC grade or better)	Various	N/A	For making Reagent 3
MTBE (Methyl tert-butyl ether - HPLC grade or better)	Various	N/A	For making Reagent 3