Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.

Abstract

הנדסת רקמות לב מתארת ​​טכניקות להוות שלוש רקמות מהונדסות מניב כוח ממדים. לשם יישום הנהלים אלה במחקר בסיסי ופיתוח תרופות פרה-קליני, חשוב לפתח פרוטוקולים עבור דור אוטומטי וניתוחים בתנאים סטנדרטיים. כאן, אנו מציגים טכניקה ליצירת רקמת לב Engineered (EHT) מ cardiomyocytes של מינים שונים (חולדה, עכבר, אדם). הטכניקה מתבססת על מכלול של א-ג'ל הפיברין המכיל cardiomyocytes ניתק בין polydimethylsiloxane אלסטי (PDMS) הודעות בפורמט 24-היטב. שלוש ממדי, מניב כוח EHTs מהווה בתוך שבועות אחרי הליהוק. הליך זה מאפשר לדור של כמה מאות EHTs בשבוע מוגבל מבחינה טכנית רק על ידי הזמינות של שריר הלב (0.4-1.0 x 10 6 / EHT). הערכת התכווצויות שרירי auxotonic מתבצעת בתא דגירה שונה עם mechanמשתלב iCal עבור צלחות 24-היטב ומצלמה ממוקמת על גבי תא זה. תוכנה שולטת במצלמה עבר על מערכת צירים XYZ לכל EHT. התכווצויות EHT מזוהות על ידי אלגוריתם זיהוי דמות אוטומטי, וכוח מחושב על בסיס קיצור של EHT ואת הנטייה אלסטי וגיאומטריה של הודעות PDMS. הליך זה מאפשר ניתוח אוטומטי של מספרים גבוהים של EHT בתנאים סטנדרטיים סטרילי. זיהוי האמין של שפעות תרופה על התכווצות cardiomyocyte הוא קריטי להתפתחות ופרמקולוגיה בטיחות תרופת לב. אנו מדגימים, עם הדוגמא של E-4031 מעכב ערוץ hERG, שמערכת EHT האנושית משכפלת תגובות תרופה על קינטיקה התכווצות של הלב האנושי, המציין שזה יהיה כלי מבטיח עבור הקרנת בטיחות תרופת לב.

Introduction

תופעות לוואי לב כגון תסמונת QT-induced סמים הארוכה הובילו משייכות שוק לאורך השנים האחרונות. הסטטיסטיקה מצביעה על כך כ -45% מכלל משיכות הן בשל השפעות לא רצויות על מערכת הלב וכלי הדם 1. כישלון התרופה הזו לאחר התהליך ואישור התפתחותי היקר הוא התרחיש הגרוע ביותר עבור חברות תרופות. מחלקות מחקר ופיתוח ולפיכך להתמקד זיהוי של תופעות קרדיווסקולריות רצויות כגון מוקדם. אם יש לך חששות כלכליים ואתיים, המאמצים לצמצום ניסויים בבעלי החיים ולהחליפם מבחני מיון חדשים במבחנה נמשכת.

סט של מבחנים הוקמו כלולים מנהל המזון והתרופות בארה"ב (FDA) סוכנות תרופות האירופית (EMA) הנחיות להערכת פרה-קלינית של שפעות תרופת proarrhythmic 2. הטכנולוגיה של תכנות מחדש תאים סומטיים ואחריו בידול שלתאי גזע אנושיים מושרים (hiPSC) שפרו שדה מחקר זה 3. כעת הוא מציע את האפשרות לסנן מועמדי תרופה חדשים על שריר לב אנושי במבחנה ונמנע בעיות עם הבדלים-מיני שאר. פרוטוקולי בידול לב אחרונים 4, 5 לספק היצע בלתי מוגבל של שריר לב בלי חשש אתי. עם זאת, המדידה של כוח ההתכווצות, החשוב ביותר המאופיין ביותר בפרמטר vivo של שריר לב, אינה מבוססת דיו. זה קשור הבגרות היחסית 6 של שריר לב הנגזרות תא גזע מושר האנושי (hiPSC-CM) בהשוואת cardiomyocyte המבוגר. התקדמות אפשרית היא להנדס רקמת לב 3 ממדים ממשפחות חד תאי 7 (רקמה לב מהונדס, EHT). פרוטוקול EHT מבוסס על הטבעה בעכברים יחידים או שריר לב אנושי 8 sup>, 9, 10 ב הידרוג'ל הפיברין בין שני polydimethylsiloxane הגמיש (PDMS) הודעות 11 בפורמט 24-היטב. תוך כמה ימים cardiomyocytes להתחיל להתכווץ באופן ספונטני כמו תאים בודדים ולהתחיל להקים רשתות סלולריות. לאחר 7-10 ימים, התכווצויות מקרוסקופית של הרקמה כולה גלויות. במהלך תהליך זה מטריקס היא שופצה, אשר מובילה לירידה של קוטר ואורך. קיצור של תוצאות EHT כיפוף של PDMS לפרסם אפילו במנוחה, העמדת cardiomyocytes בתוך EHT בפיתוח עומס מתמשך. EHTs ממשיך לבצע התכווצויות שרירי auxotonic פני מספר שבועות. EHTs האדם להראות תגובות לגירויים פיסיולוגיים תרופתיים מציין התאמת הקרנה ומחלות תרופת דוגמנות 7.

בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול חזק וקל עבור generatiעל של EHT האנושית, ואת ניתוח התכווצות אוטומטית של שינויים תלויי ריכוז של דפוס כיווץ בנוכחות מעכבי ערוץ hERG.

Protocol

הערה: השלבים הבאים מתארים פרוטוקול תרבית תאים. אנא לבצע בתנאים סטריליים והשתמש במדיה מחומם מראש.

1. בידול הלב של hiPSC

  1. לטפח את hiPSC
    1. מעיל צלחות 6-היטב (1 מ"ל / טוב) או T75 צלוחיות (7 מ"ל / בקבוק) עם מטריצה קרום במרתף גורם צמיחה מופחתת (למשל geltrex, 1: 200; ראו טבלה של חומרים) מדולל בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עבור 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הכן בינוני FTDA 12 על ידי ערבוב DMEM בסיסי / F-12 בינוני עם 2 מ"מ L- גלוטמין, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ג / transferrin L, 5 מיקרוגרם / ליטר סלניום, 0.1% אלבומין אנושי, 1x-תערובת שומנים, 5 מ"ג / L אינסולין, 50 ננומטר dorsomorphin, 2.5 ננוגרם / מ"ל ​​Activin א ', 0.5 ng / mL אנושי TGFß1 ו 30 ng / mL FGF2.
    2. HiPSC Seed (~ 3 x 10 5/10 סמ"ר) במדיום ותרבות FTDA ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 21% O 2 עם שינוי המדיום יומי (איור 1A). בשעה 80% confluency, מעבר (1: 2-1: 6) עם חומצה tetraacetic diamine אתילן (EDTA; 0.5 מ"מ; הדגירה זמן ~ 4 דקות).
  2. הקמת גופים embryoid (EB)
    1. טפח hiPSC ב T75 צלוחיות צפיפות גבוהה.
      1. לשטוף צלוחיות עם תאים ומחוברות פעמיים עם בופר פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS) דגירה 0.5 EDTA מ"מ ~ 10 דק '. ודא תאים לא להתנתק התחתון של הבקבוק.
      2. הסר EDTA עם טפטפת זכוכית, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל PBS, צלוחיות ברז בבית הספסל לנתק תאים.
        הערה: מגרד תא השתמש במידת הצורך.
      3. איסוף התאים ב 50 צינור חרוטי מ"ל, להוסיף ¼ נפח (למשל 10 מ"ל RMPI כדי 40 מ"ל תרחיף תאים) RPMI בינוני 1640 (או בכל מדיום סטנדרטיים אחרים המכילים סידן 1.8 מ"מ) צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות.
    2. גלולה תא גלולה במדיום FTDA בתוספת 4 מ"ג / מ"ל ​​פוליוויניל אלכוהול (PVA) ו10 מיקרומטר Y27632 ולספור את התאים בתא נויבאואר.
    3. למלא את הבקבוק טווה עם ההשעיה תא (30 x 10 6 תאים / 100 מ"ל בינוני FTDA בתוספת PVA ו- Y-27,632; ראה שלב 1.2.2) וליזום EB היווצרות צלוחיות טווה (להתאים את מהירות הרוטור של בוחש מגנטי 40 סל"ד ) בחממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, CO 2 5%, 5% O 2) במשך הלילה.
  3. בידול mesodermal
    1. במהלך היווצרות EB, תרבית תאים מעיל צלוחיות מתאים לתרבות ההשעיה עם פעילי שטח בלתי יוניים (14 מ"ל / T175) מעל בלילה 37 מעלות צלזיוס.
    2. למחרת בבוקר, לשטוף צלוחיות מצופות-סורפקטנט פעמים עם PBS (30 מיליליטר / T175). להוסיף PBS שוב ולשמור בחממה עד הצורך.
    3. הסר את הבקבוק טווה מן החממה.
      הערה: השעית תא צריכה להיות ברורה עם EBS הגלוי macroscopically הקטן (איור 1B).
    4. העבר 50 מ"ל השעיה אל גיגית חרוטי 50 מ"לEBS דואר ולתת להסתפק 5-20 דקות.
    5. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 7 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת PVA 2% ו 10 מיקרומטר Y-27,632. להעביר את ההשעיה עד נפח EB הצינור חרוטי 15 מ"ל סיים אומדן (~ 50-100 μL).
    6. העבר תוכן צלוחיות טווה צלוחיות T175 ללא ציפוי ולהשאיר זו על מתלה בצורת V עבור שקיעה עד 20 דקות. הסר supernatant לשטוף גופים embryoid כאמור לעיל. אין למלא את הבקבוק T175 עם יותר מ 200 מ"ל כגון שקיעה ייקח יותר מדי זמן. אם נפח בקבוק טווה ראשוני עולה 200 מיליליטר, לפצל השעית EB לכמה צלוחיות T175 ולשלב EBS שוב לאחר כביסה.
    7. הסר בינוני כביסה גלולה במדיום לבידול mesodermal, כי הוא RPMI השלימו עם 4 מ"ג / מ"ל ​​PVA, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 0.05% בסרום אדם אלבומין, 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​transferrin, 5 ng / mL סלניט נתרן, תערובת שומנים 0.1%, 250 מיקרומטר-ascorbate phospho, 10 מיקרומטר Y-27,632, 10 ng / morphogenic העצם מ"ל חלבון-4 (BMP-4), ו 3 ng / A Activin מ"ל, 5 ng / mL FGF2 יציבה.
    8. הסר PBS צלוחיות T175 מצופים פעילי שטח ולמלא עם ההשעיה תא (200 μL EBS ב 40 מ"ל). השתמש בקבוקונים קטנים עבור נפח קטן EB.
    9. טפחו את EBS ב השעיה למשך שלושה ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 5% O 2). המרת 50% של המדיום (באותו הרכב כמו בשלב 1.3.7) כל יום (שימוש בצורת V מתלה שקיעה). כן בינוני טרי כל יום לפני ההאכלה.
  4. בידול לב
    1. הכן כלי חדש מצופים פעילי שטח יום לפני ולטפל כאמור לעיל (1.3.2).
    2. אחרי שלושה ימים של אינדוקציה mesodermal, בואו EBS להסתפק עד 5 דק 'על מתלה שקיעה. הסר ביותר של המדיום ולשטוף עם RPMI 1640 בתוספת 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין ו 10 HEPES מ"מ.
    3. העברת 10 מ"ל של השעיה EB כדי בוגר15 מ"ל צינור ואומדן נפח EB אחרי שקיעה.
    4. גלולה EBS בזהירות במדיום בידול הלב המורכב RPMI 1640 בתוספת 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 HEPES מ"מ, 0.05% אלבומין אנושי, 5 מיקרוגרם / transferrin מ"ל, 5 ng / סלניט נתרן מ"ל, תערובת שומנים 0.1%, 250 phospho מיקרומטר -ascorbate, 1 מיקרומטר Y-27,632, 100 ננומטר Wnt-מעכב DS-I-7 13.
    5. העבר EBS צלוחיות תרבית תאים חדשים מצופים פעילי שטח (~ 200 μL EBS ב 46 מ"ל / T175).
    6. דגירה במשך שלושה ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 21% O 2) עם שינוי בינוני 50% (הרכב בינוני ראה שלב 1.4.4) ביום השני והשלישי. אין לשנות את המדיום בתוך 48 h הראשון.
    7. דגירה במדיום המורכב RPMI 1640 בתוספת 500 מיקרומטר 1-Thioglycerol, 10 HEPES מ"מ, 0.5% פניצילין / סטרפטומיצין, 1 מיקרומטר Y-27,632, 2% תוספת תרבית תאים עצביים סרום ללא (B27 למשל) עם אינסולין, 100 ננומטר Wnt -inhibitor DS-I-7 עם חליפין יומיים של מדיום 50% בארבעה הימים הקרובים. EBS צריך להתחיל להכות בתוך תקופה זו.
    8. בתום שבוע של בידול הלב, לעבור לאותו מדיום ללא Wnt עיכוב ועם תוספת תרבית תאים עצביים סרום ללא. שנת 50% של המדיום כל יום, למעט יום ראשון.
  5. דיסוציאציה של שריר הלב האנושי
    הערה: לאחר שבועות של פרוטוקול בידול, EBS צריך להראות התכווצויות ספונטניות (איור 1C). אם כן, להתחיל ניתוק ולהכין תמיסת collagenase.
    1. הכן פתרון collagenase ידי שקילת ופתרון 200 U / mL תמיסת מלח מאוזן סידן חופשי הנקס ללא סידן / מגנזיום (HBSS) ולהוסיף 1 HEPES מ"מ, 10 מיקרומטר Y-27,632, 30 מיקרומטר sulphonamide N-בנזיל-p-טולואן ( BTS). לעקר ידי סינון (מסנן 0.2 מיקרומטר) ו aliquots חנות ב -20 מעלות צלזיוס. הפשרת aliquots ב 4 ° C במשך הלילה.
    2. Settle EBS על מתלה שקיעה,לשאוב בינוני ולהחליף מ"ל 20-25 מחומם מראש HBSS. חזור על שלב זה כביסה שוב.
    3. לשאוב HBSS ולהחליף עם פתרון collagenase מחומם מראש (15 מ"ל / T175). דגירה של 4 שעות ב חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% 2 CO, 21% O 2).
    4. הכן חיץ חסימת עם DMEM בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו DNase (12 מיקרוגרם / מ"ל).
    5. הקש צלוחיות תרבית תאים על הספסל, ניתק EBS צריך להתפרק ו להתפרק (אם לא, להגדיל את זמן הדגירה). השעית תא triturate בעדינות ולהעביר צינור 50 מיליליטר חרוטים. לשטוף צלוחיות עם חסימת חיץ (15 מ"ל / T175) ולהעביר את הצינור.
    6. צנטריפוגה 10 דקות ב g 100 x. Resuspend התאים DMEM, triturate חמה לספור תאים.

2. דור של רקמת לב ההנדסי (EHT)

  1. חיטוי זמין מסחרי מתלה PDMS ו polytetrafluorethylene (PTFE) מפרידים (ראה חומריםגיליון אלקטרוני ציוד; 2 איור) ולהכין את הפתרונות הבאים בתנאים סטריליים, יום אחד לפני דור EHT.
    1. כן 2% agarose ידי שקילה והמסה בנפח המתאים של PBS, חיטוי, לאחסן מייד 60 ° C.
    2. הכן aprotinin (33 מ"ג / מ"ל) על ידי שקילת והמסה בנפח המתאים iniectabilia מודעה אקווה, לסנן סטרילי (פילטר 0.22 מיקרומטר), aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    3. הכן פיברינוגן (200 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת פיברינוגן סטרילית בנפח המתאים של 0.9% NaCl סטרילי (פושרים), aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    4. הכן תרומבין (100 U / mL) על ידי המסת תרומבין סטרילי בשלושה חלקים סטרילית חלקים PBS ו 2 iniectabilia מודעה אקווה, מנות aliquot של 3 μL צינורות קטנים ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    5. הכן 10x DMEM ידי המסת 670 מ"ג 10x אבקת DMEM ב 5 iniectabilia מודעה אקווה מ"ל, לסנן סטרילי ולאחסן ב 4 °.
    6. כן 2x DMEMעל ידי ערבוב 2 מ"ל 10x DMEM עם 2 סרום סוס מ"ל חום מומת, 0.2 פניצילין מ"ל / סטרפטומיצין 5.8 iniectabilia מודעה אקווה מ"ל, לסנן סטרילי ולאחסן ב 4 °.
    7. כן בינוני EHT-יציקה (ECM) על ידי ערבוב DMEM עם 10% נסיוב עגל העוברי מומת חום, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו 1% L- גלוטמין (200 מ"מ), חנות ב 4 °.
  2. הכן תבניות יציקה צלחות 24-היטב על ידי pipetting 1.6 מ"ל agarose חם (2%, PBS), הטלת spacer PTFE (איור 2 א) לתוך בארות.
    הערה: spacer מקום מיד לאחר pipetting לתוך למקסימום של 8 בארות - agarose מבצרת מהר מאוד. אל תשאיר את agarose בטמפרטורת החדר למשך זמן רב יותר מאשר 5 דקות.
  3. לאחר מיצוק agarose (~ 10 דקות, agarose יהפוך אטום), להסיר את מפרידי PTFE (איור 2C) והמקום מתלים PDMS (2B איור) לתוך תבניות יציקה כך זוגות ההודעות PDMS להגיע אל כל עובש (2D איור).
  4. Resuspend את שריר הלב ב ECM עם ריכוז מינימלי של 15 x 10 6 תאים / מ"ל.
  5. הכן 110% מנפח מוערך של תערובת הכינון מחדש בתוך שפופרת 15 מ"ל תחתית עגולה על EHTs 24 ice.For, פיפטה תערובת הכינון מחדש המפורטים בטבלה 1 עבור האדם, cardiomyocytes עכברוש או העכבר, בהתאמה (10% תוספת כלול).
    הערה: ריכוז Cell של תמהיל הכינון שונה עבור האדם (10 x 10 6 תאים / מ"ל), חולדה (4.1 x 10 6 תאים / מ"ל) ועכבר (6.8 x 10 6 תאים / מ"ל) EHTs. תלוי בריכוז של תרחיף תאים, להוסיף ECM נוספות לנפח סופי של 2640 μL. יש Fibrinogen להיות פושרים במשך בפיפטה. לאט לאט למלא את קצה pipet ואל תיגע במשטח של תמהיל הכינון קר עם pipet המכילים פיברינוגן בעת ​​הוספת פיברינוגן לתערובת הכינון מחדש - את הצמיגות של פיברינוגן ב קצה פיפטה יגדיל באופן מיידי.
  6. Triturate תמהיל הכינון 10 - 15 פעמים עם טפטפת סרולוגיות עד קריש פיברינוגן נמס. בדוק את תמהיל הכינון מחדש ב פיפטה עבור הומוגניות.
  7. עבור כל תערובת הכינון מחדש EHT, pipet 100 μL ב aliquot תרומבין אחד (3 μL ב 200 צינור μL), לערבב pipet את התערובת לתוך החריצים-agarose מהר ככל האפשר (איור 2E). השתמש טיפ מסנן חדש עבור כל EHT. Resuspend תמהיל הכינון (טחינה דקה עם פעמים 5-10 פיפטה סרולוגיות) אחרי כל 8 EHTs.
  8. לאחר כל המשבצות מלאות תערובת כינון מחדש, לסגור את המכסה של צלחת תרבית תאי דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 7% CO 2 עבור 2 h.
  9. הסר את צלחת מן החממה מקום מתחת למכסה המנוע סטרילית. מכסים היטב עם כל כמות קטנה של המדיום (למשל DMEM, כ -200 - 500 μL), לנער את הצלחת בעדינות דגירה שוב 37 מעלות צלזיוס למשך דקות 10 לפחות. הוספת DMEM תקל על הסרת מן ג'לים הפיברין מ תבניות יציקה agarose.
  10. כן צלחת 24-היטב חדשה עם 1.5 מיליליטר EHT-בינוני לכל היטב מורכב DMEM בתוספת 10% בסרום סוס חום מומת, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 10 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 33 מיקרוגרם / מיליליטר aprotinin.
  11. מוציאים בזהירות את מדפי PDMS מן תבניות יציקה agarose ולהעביר אותם לצלחת בינוני-מלא 24-היטב (איור 2F). מניחים את המנה בחזרה בחממה (37 ° C, 7% CO 2, 40% O 2 עבור EHTs האדם חולדה, 21% O 2 עבור EHTs העכבר) והעדכון שני, רביעי ושישי עם-בינוני EHT מוכן טרי. EHTs צריך להראות התכווצויות ספונטניות להסיט את הבליטות שעל מדפי PDMS 7-10 ימים לאחר השלכת (איור 1D, 2G).
    1. לעכבר EHTs להוסיף 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​של βDarabinofuranoside 5-ציטוזין עד בינוני תרבות עבור 48 שעות כדי להגביל התפשטות פיברובלסטים.

3. ניתוח התכווצות

הערה: ניתוח ההתכווצות מבוסס עלוידאו-אופטי הקלטת מכשיר לניתוח EHT זמין מסחרי (ראה טבלה של חומרים). היחידה המרכזית של מכשיר זה הוא תא הדגירה (איור 3A). התוכנה המסופקת עם המכשיר מחשבת בכוח התכווצות מבוסס על סטיה של הודעות PDMS עם מודולוס אלסטיות ידוע וגיאומטריה 11 (משלים איור 1).

  1. הפעל את מכשיר החימום של h מכונה 2 לפני המדידה. הפעל אספקת גז אספקה ​​אלקטרונית של מערכת הצירים מייד לפני ניתוח ההתכווצות.
  2. להקלטת הבסיס (נקודת התייחסות בניתוח), למקם את 24-היטב צלחת עם EHTs ב EHT-בינוני לתוך מכשיר לניתוח EHT ולהתחיל את תוכנת ניתוח התכווצות בהתאם למדריך הספק.
    1. לחץ על כרטיסיית "הפרוטוקול" בלוח התקין ולהזין מידע רלוונטי לגבי שם מחקר, משתמשים, מינים, CEסוג ll, גיל, אורך ההקלטה והערות נוספות.
    2. לחץ על כרטיסיית "מצלמת הנוף" בלוח השמאלי ולהתחיל מצב מצלמה חי עם מצב זיהוי דמות אוטומטי. לחץ על הכרטיסייה "הגדרות" בלוח תקין andadjust למיקום המצלמה עם XYZ קואורדינטות לכל היטב צלחת 24-היטב. ודא EHT הוא במרכז החלון בפוקוס של המצלמה.
      1. ודא את המכסה של צלחת תרבית תאים אינה מעורפלת כמו זה יפגע הכרת דמות וניתוח התכווצות.
        הערה: אלגוריתם זיהוי הדמות מבוסס על זיהוי אזורי ניגודיות גבוהים וניטור שינוי עמדתם. בשנת התוכנה באזורים אלה של הכרת דמות יסומנו צלב כחול שזז עם ההתכווצויות של EHT.
      2. ודא כי העמדות של הצלבים הכחולים נמצאות שניהם הקצוות העליונים ותחתונים של EHTs והתזוזה רק אנכי התאמת ההתכווצויות של EHTs (איור 3B). Sעמדות התקנת Ave של כל אחד גם על ידי לחיצה על הכפתור "עמדה בסדר".
    3. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה "פרמטרים" בלוח השמאלי. הפרמטרים המוצגים כאן להגדיר את הקריטריונים שלפיהם התוכנה מזהה לשיא להתכווצות ומסמנת אותו עם ריבוע ירוק. ערכים אלה חשובים מאוד עבור זיהוי נכון של פסגות התכווצות (איור 3 ג) ואין נקודות נתונים כוזבים (איור 3E-F).
      הערה: רשימה של פרמטרי מינים תלויים ודוגמאות מתוארות באיור 3H. לפרטים נוספים, נא עיין במדריך התוכנה.
    4. לחץ על הכרטיסייה "האוטומטית" בלוח התקין וליזום את הניתוח על ידי הפעלת הכפתור "התחל". התוכנה תעבור ברצף מן היטב אחד את התכווצויות EHT הבאות, שיא ולחשב בכוח במהלך ההקלטה (מוצג בלשונית "בזמן האמת" על הלוח השמאלי). בתום הניתוח, דו"ח pdf summariזיע התוצאות יופק באופן אוטומטי.
  3. שמור ולנתח את דו"ח PDF המערכת יוצרת לסכם את התוצאות.
  4. מעקב אחר פרמטרי ההתכווצות ידי מדידה חוזרת על פני כמה ימים. EHT יגדל ב כוח כיווץ עד שהוא הגיע רמה (בדרך כלל סביב יום 15 של התרבות).
  5. הקרנת סמים
    1. הכן פתרון Tyrode בחינם חלבון יום אחד לפני מדידה לאזן צלחות 24-היטב (2 מ"ל / גם) בחממה תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 7% CO 2, 40% O 2) במשך הלילה: 120 מ"מ NaCl, 5.4 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 0.1-5 מ"מ CaCl 2, 0.4 מ"מ לאא 2 PO 4, 22.6 מ"מ NaHCO 3, 5 גלוקוז מ"מ, 0.05 מ"מ Na 2 EDTA, 25 HEPES מ"מ. להוסיף עד סידן 1.8 מ"מ או נקבע בעבר [EC 50] לחקור תופעות אינוטרופיות חיוביות.
    2. לשקול לפרק את התרופה ב DMSO ולסנן סטרילי, במידת הצורך.כן 6 פתרונות 1000x-תת-מניות שונות (DMSO) של ריכוז העבודה (למשל 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 מיקרומטר עבור מגוון nanomolar בהתאמה).
    3. לדלל את המניות בהתאמה הצלחות Tyrode (2 μL בכל 2 מ"ל היטב) ומערבבים היטב. מניחים את הצלחות בחזרה בחממה עד הצורך.
    4. התחל את המדידה הבסיסית ידי לקיחת Tyrode המלאה 24-היטב הצלחת הראשונה תחת אלקטרודות ברדס ואת מיקום פחמן סטרילי בתוך הבארות. העברת מתלים PDMS עם EHTs להציב על גבי אלקטרודות פחמן, לסגור את המכסה, לשים את הצלחת בחזרה בחממה ולהמתין לתקופה איזון של ~ 30 דק '.
    5. העברת EHTs מן החממה עד משתלבים במכשיר ניתוח EHT. סגור את המכשיר ולהקליט התכווצות בסיס ספונטנית (20 s / EHT).
    6. חברו את האלקטרודות פחמן לכבל צעדה ולהתחיל גירוי חשמלי של EHTs (2.5 V, משך הדחף 4 ms, אדם: ~ 1 הרץ, עכברוש: ​​~ 2רץ, עכבר: ~ 4 רץ). רשום את הבסיס "בקצב" (10 s / EHT). ודא שכל EHTs גדושה כראוי. תדירות מתח גירוי עלולה להשתנות מן שורת תא קו תא.
    7. לאחר הקלטת בסיס, להסיר את EHTs מהמכשיר ולהעביר את האלקטרודות עם מתלי PDMS על גבי, אל 24-היטב הצלחת עם ריכוז התרופה הראשון. העברת EHTs חזרה אל המשתלבים של מכשיר ניתוח EHT מייד לדגור שם (דקות 20 למשל זמן דגירת תרופה סטנדרטית).
    8. חבר מחדש כבלי צעדה, להתאים הכרת דמות ולהקליט התכווצויות EHT להגיב ריכוז התרופה הראשון.
    9. עבור ריכוזי התרופה הבאים, לחזור על שלב 3.5.7 ו 3.5.8 עם המכילות צלחות 24-היטב ריכוז תרופה גבוהה.
    10. שמור את כל הקלטות pdf. בדוק כל הקלטה להכרת דמות, מיקום נכון של ריבועים ירוקים זיהוי פסגות להתכווצות וממצאים (ראה 3.2.1 והאיור 3 ).
    11. ביצוע ניתוח מחובר נוספות במידת הצורך.
      1. בחר בטווח בהתאמה ממסד הנתונים "פועל" על הלוח השמאלי על ידי לחיצה על "ריצה בוחרת". בלשונית "פרמטר" בצד שמאל, לשנות פרמטר לניתוח התכווצות. עכשיו לבחור "ניתוח לא מקוון" בלשונית "המנותקת" בלוח הזכות לנתח מחדש את קטעי הווידאו.
      2. כדי להתאים הכרת דמות ולכן להקליט קובץ וידאו חדש, לבחור "סקירה לדוגמא" לאחר התאמת הכרת הדמות בלשונית "בזמן האמת". הערה: סקירה לדוגמא יכולה רק ולנתח מחדש גם אחד בכל פעם, ואילו ניתוח מחובר יכול להחיל פרמטר חדש עבור כל הבארות ידי לחיצה על "הפרמטר השתמש על כל הבארות" כפתור בלוח "הפרמטר" בצד השמאל. שני הסוגים של ניתוחים מחוברים ייצרו קבצי נתונים חדשים באופן אוטומטי pdf מוצגים התוצאות.
    12. לנתח את הניסוי על ידי שילוב התוצאות של biological משכפל ולסכם את הנתונים עקומים תגובת ריכוז עבור תדר, כוח התכווצות, זמן התכווצות זמן הרפיה (איור 5D) ו / או תצוגה גרפית של פסגות להתכווצות ממוצעות (איור 5 ג).
      הערה: מתלים PDMS ו spacer PTFE ניתן להשתמש שוב ושוב (PDMS עמדות מקסימום 5 פעמים, ו PTFE spacer בלי סוף.). לאחר השימוש, לנקות אותם באופן ידני עם מים, להרתיח פעמיים במים demineralized החיטוי. להיות מודע לתופעות שנשארו לו פוטנציאל, כאשר מחדש באמצעות המתלים, כמו תרופות עלולות להיספג על ידי PDMS.

תוצאות

בידול לב הכנת EHT

HiPSC הורחב על מטריצה ​​הממברנה במרתף מופחת צמיחת גורם, ניתק עם EDTA וגופי Embryoid (EBS) נוצרו צלוחיות טווים לילה. לאחר אינדוקצית mesodermal במשך שלושה ימים, בידול לב החל עם מעכב Wnt. לאחר ~ 17 ימים...

Discussion

רקמת לב מהונדסים מציעה אפשרות רבת ערך בתיבת כלי מחקר לב וכלי דם. EHTs בפורמט 24-היטב הוכיח יקר עבור מודלי מחלה 8, 14, הקרנת בטיחות תרופת 7, 8, 10, 11, 15, או למ...

Disclosures

IM, TE ו AH הם מהמייסדים של GmbH טכנולוגיות EHT, גרמניה.

Acknowledgements

המחברים מודים אלסנדרה מורטי דניס ושאדה עבור תרומה של חומר מסוגם. אנו מכירים את התמיכה הגדולה של קבוצת עבודה שב"ס EHT במחלקה לפרמקולוגיה ניסיוני טוקסיקולוגיה של צעידה נמרצת. עבודתם של המחברים נתמך על ידי תרומות של DZHK (מרכז גרמנית למחקר קרדיו) ומשרד הגרמנית לחינוך ולמחקר (BMBF), קרן המחקר הגרמנית (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), המרכז הלאומי הבריטי עבור החלפת חידוד & הפחתת בבעלי חיים למחקר (סדק IT NC3Rs להעניק 35,911-259,146), קרן הלב הבריטית RM / 13 / 30,157, המועצה האירופית למחקר (Advanced Grant IndivuHeart), קרן הלב גרמנית ואת פרייה und Hansestadt המבורג.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
EHT analysis intrumentEHT Technologies GmbHA0001Software is included
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT electrodeEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adapter/cableEHT Technologies GmbHP0002
24-well-plateNunc144530
6 well-cell culture plateNunc140675
15 ml falcon tube, graduated Sarstedt62,554,502
Cell scraperSarstedt831,830
Spinner flaskIntegra182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask Sarstedt 831,812,002
V-shaped sedimentation rack Custom made at UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Thioglycerol Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R&D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulin Gibco17504-044
BMP-4R&D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (from bovine spleen)Sigma D8764
Dorsomorphin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal calf serumGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogen (bovine)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Horse serumLife technologies26050088
Human serum albumin Biological Industries05-720-1B
Insulin, humanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polyvinyl alcohol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodium seleniteSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

References

  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  4. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  5. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  6. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  7. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
  8. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  9. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
  10. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  11. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
  12. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  13. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  14. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
  15. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  16. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
  17. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  18. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  19. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  20. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
  21. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  22. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  23. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bioengineering122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved