Automated Análise contração do Coração Humano engenharia de tecidos para Screening Cardiac Drug Safety

Resumo

Aqui, mostramos a geração de tecido do coração humano manipulado a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) derivada de cardiomiócitos. Apresenta-se um método para analisar a força de contração e alteração exemplar de padrão de contracção pelo hERG inibidor do canal de E-4031. Este método apresenta elevado nível de robustez e de aptidão para o rastreio de drogas cardíaca.

Resumo

engenharia de tecido cardíaco descreve técnicas para constituir três tecidos de engenharia geradores de força dimensional. Para a implementação destes procedimentos em pesquisa básica e desenvolvimento de medicamentos pré-clínico, é importante desenvolver protocolos para geração e análise automatizada sob condições padronizadas. Aqui, apresentam-se de uma técnica para gerar tecido do coração Engineered (EHT) de cardiomiócitos de espécies diferentes (rato, ratinho, humano). A técnica baseia-se na montagem de uma fibrina-gel contendo cardiomiócitos dissociadas entre polidimetilsiloxano elástico (PDMS) postos em um formato de 24 poços. Tridimensionais, EHTs geradores de força constituem dentro de duas semanas após a fundição. Este procedimento permite a geração de várias centenas de EHTs por semana e é tecnicamente limitado apenas pela disponibilidade de cardiomiócitos (0,4-1,0 x 10 ⁶ / EHT). Avaliação das contracções musculares auxotonic é executada numa câmara de incubação modificado com um mechanintertravamento ical para placas de 24 poços e uma câmara colocada no topo desta câmara. Um software controla uma câmara moveu-se sobre um sistema de eixos XYZ para cada EHT. EHT contracções são detectadas por um algoritmo figura reconhecimento automatizado, e força é calculada com base no encurtamento do EHT e a propensão elástica e geometria dos postes PDMS. Este procedimento permite a análise automática de um número elevado de EHT sob condições padronizadas e estéreis. A detecção confiável de efeitos de drogas sobre a contração dos cardiomiócitos é crucial para o desenvolvimento de drogas cardíaca e farmacologia de segurança. Demonstramos, com o exemplo do hERG inibidor do canal de E-4031, de que o sistema EHT humano replica de respostas ao fármaco sobre a cinética de contracção do coração humano, indicando que ele seja uma ferramenta promissora para o rastreio de segurança de medicamentos cardíaca.

Introdução

efeitos colaterais cardíacos, tais como a síndrome do QT longo induzido por drogas levaram a retiradas do mercado ao longo dos últimos anos. As estatísticas indicam que cerca de 45% de todas as retiradas são devido a efeitos indesejáveis sobre o sistema cardiovascular ^1. Esta falha de drogas após o processo de desenvolvimento caro e aprovação é o pior cenário para as empresas farmacêuticas. departamentos de pesquisa e desenvolvimento, portanto, concentrar-se na detecção de tais efeitos cardiovasculares indesejáveis ​​logo no início. Para preocupações econômicas e éticas, os esforços para reduzir as experiências com animais e substituí-los com novos testes de rastreio in vitro estão em andamento.

Um conjunto de ensaios estabelecidos estão incluídas nos Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) e da Agência Europeia de Medicamentos (EMA) diretrizes para a avaliação pré-clínica de efeitos de drogas pró-arrítmicos ^2. A tecnologia de reprogramação de células somáticas seguido por diferenciação dehumanas induzidas células estaminais pluripotentes (hiPSC) impulsionado a investigação neste campo ^3. Ele agora oferece a possibilidade de filtrar candidatos a novos fármacos em cardiomiócitos humanos in vitro e evita problemas com diferenças inter-espécies. Protocolos de diferenciação cardíacos recentes ^{4, 5} fornecem suprimento ilimitado de cardiomiócitos, sem preocupação ética. No entanto, a medição da força contráctil, o mais importante e mais bem caracterizado no parâmetro vivo de cardiomiócitos, não está bem estabelecida. Isto está relacionado com a relativa imaturidade ⁶ de cardiomiócitos humanos induzida estaminais pluripotentes derivadas de células (hiPSC-CM), em comparação com o cardiomiócito adulto. Um avanço possível é para a engenharia de tecidos do coração 3-dimensional a partir de células individuais ⁷ (tecido cardíaco engenharia, EHT). O protocolo EHT é baseado sobre a incorporação de murino único ou cardiomiócitos humanos ⁸ sup>, ^{9, 10} em hidrogel de fibrina entre dois polidimetilsiloxano flexível (PDMS) ¹¹ mensagens no formato de 24 poços. Dentro de poucos dias os cardiomiócitos começar a se contrair espontaneamente como células individuais e começam a se formar redes celulares. Depois de 7-10 dias, as contracções macroscópicas de todo o tecido são visíveis. Durante este processo, a matriz extracelular é remodelado, o que leva a uma diminuição do diâmetro e comprimento. O encurtamento dos resultados EHT em flexão do PDMS deixar mesmo durante o repouso, submetendo o composto EHT cardiomiócitos em desenvolvimento a carga contínua. EHTs continuar a realizar contrações musculares auxotonic longo de várias semanas. EHTs humanos mostram respostas à estimulação fisiológica e farmacológica que indicam a sua adequação para o rastreio de drogas e doença modelar ^7.

Neste manuscrito apresentamos um protocolo robusto e fácil para os geraçãno do composto EHT humano, e a análise da contractilidade automatizado de alterações dependentes da concentração do padrão de contracção na presença de inibidores do canal hERG.

Protocolo

NOTA: Os passos seguintes descrevem um protocolo de cultura de células. Por favor realizar sob condições estéreis e usar meios de pré-aquecido.

1. cardíaca Diferenciação de hiPSC

1. Cultivar a hiPSC
   1. Revestir placas de 6 poços (1 ml / cavidade) ou frascos T75 (7 ml / frasco) com matriz de membrana basal reduzida do factor de crescimento (por exemplo geltrex, 1: 200; ver tabela de materiais) diluída em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) para 30 min a 37 ° C. Preparar o meio FTDA ¹² através da mistura de DMEM básico / meio F-12 com 2 mM de L-glutamina, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 5 mg / L de transferrina, 5 mg / L de selénio, 0,1% de albumina de soro humano, 1x lípido de mistura, 5 mg / L de insulina, 50 nM dorsomorphin, TGFß1 2,5 ng / ml de activina A, 0,5 ng / ml humano e 30 ng / mL de FGF2.
   2. HiPSC semente (~ 3 x 10 ^5/10 cm) em FTDA meio e cultura a 37 ° C, 5% de _CO2, 21% _O2, com mudança de meio dia (Figura 1A). A 80% de conflucia, passagem (1: 2-1: 6) com etileno-diamina tetra-acético (EDTA; 0,5 mM; tempo de incubação ~ 4 min).
2. Formação de corpos embrióides (EB)
   1. Cultivar hiPSC em frascos T75 a alta densidade.
      1. Lavar frascos com células confluentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (PBS) e incuba-se em EDTA 0,5 mM durante ~ 10 min. Certifique-se as células não destacar do fundo do frasco.
      2. Remover EDTA com pipeta de vidro, lavar as células com 10 ml de PBS, toque em frascos no banco para separar células.
         NOTA: Use raspador de células, se necessário.
      3. Recolher as células em 50 ml de tubo cónica, adicionar ¼ do volume (por exemplo, 10 mL de RPMI a 40 mL de suspens celular) meio RPMI 1640 (ou qualquer outro meio convencional contendo cálcio 1,8 mM) e centrifugar a 250 xg durante 5 min.
   2. Ressuspender o sedimento de células em meio FTDA suplementado com 4 mg / mL de álcool polivinílico (PVA) e10 uM Y27632 e contar as células numa câmara de Neubauer.
   3. Encher o balão rotativo com a suspensão de células (30 x 10 ⁶ culas / 100 ml de meio suplementado com FTDA PVA e Y-27632; ver passo 1.2.2) e iniciar a formação de EB em frascos rotativos (ajustar a velocidade do rotor de um agitador magnético a 40 rpm ) na incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO _2, 5% _{de O2)} durante a noite.
3. diferenciação mesodérmica
   1. Durante a formação EB, cultura de células de revestimento apropriado para frascos de cultura em suspensão com surfactante não iónico (14 mL / T175) durante a noite a 37 ° C.
   2. Na manhã seguinte, lavar frascos revestidos com tensioactivo duas vezes com PBS (30 ml / T175). Adicionar PBS novamente e manter na incubadora até que seja necessário.
   3. Retirar o frasco de rotação a partir do incubador.
      NOTA: A suspensão de células deve ser claro com pequenas EBs macroscopicamente visíveis (Figura 1B).
   4. Transferir 50 ml de suspensão de uma banheira cónico de 50 mle e permitem resolver EBs para 5-20 min.
   5. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 7 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 2% de PVA e 10? M Y-27632. suspensão de transferência para um graduado tubo de 15 ml e a estimativa do volume EB (~ 50-100 mL).
   6. Transferir o conteúdo dos frascos rotativos para frascos T175 não revestidos e deixar este no bastidor em forma de V para sedimentação durante até 20 min. Remover o sobrenadante e lavar corpos embrióides como indicado acima. Não encha o frasco T175 com mais de 200 mL como sedimentação levaria muito tempo. Se o volume inicial frasco de rotação superior a 200 mL, dividido suspensão EB para vários frascos T175 e combinar EBs novamente após a lavagem.
   7. Remover o meio de lavagem e ressuspender em meio de diferenciação da mesoderme, que é meio RPMI suplementado com 4 mg / ml de PVA, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), 0,05% de soro humano albumina, 5 ug / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenito de sódio, 0,1% de mistura de lípidos, 250 uM fosfo-ascorbato, 10? M Y-27632, de 10 ng / mL de proteína morfogénica do osso-4 (BMP-4), e 3 ng / ml de activina A, 5 ng / mL de FGF2 estável.
   8. Remover PBS a partir de frascos T175 revestidos com tensioactivo e encher com suspensão de células (200 uL EBs em 40 mL). Use frascos menores para menor volume de EB.
   9. Cultivar EBs em suspensão durante três dias (37 ° C, 5% CO _2, 5% _{de O2).} Troca de 50% do meio (mesma composição que no passo 1.3.7) todos os dias (rack de sedimentação em forma de V uso). Prepare meio fresco a cada dia antes da alimentação.
4. diferenciação cardíaca
   1. Preparar novos vasos revestidos com tensioactivo antes do dia e manusear como indicado acima (1.3.2).
   2. Depois de três dias de indução mesodérmica, deixar EBs contentar com até 5 minutos na cremalheira de sedimentação. Remover a maior parte do meio e lava-se com RPMI 1640 suplementado com 0,5% de penicilina / estreptomicina e HEPES 10 mM.
   3. Transferem-se 10 ml de suspensão de EB formou15 mL tubo e a estimativa do volume EB após sedimentação.
   4. Ressuspender EBs cuidadosamente em meio de diferenciação cardíaca que consiste em meio RPMI 1640 suplementado com 0,5% de penicilina / estreptomicina, HEPES 10 mM, 0,05% de albumina de soro humano, 5 ug / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenito de sódio, 0,1% de mistura de lípidos, 250 uM fosfo ascorbato, 1? M Y-27632, 100 nM de inibidor de Wnt-DS-I-7 ^13.
   5. Transferir EBS para novos frascos de cultura de células revestidas com surfactante (~ 200 mL EBs em 46 mL / T175).
   6. Incuba-se durante três dias (37 ° C, 5% de CO _2, 21% de O ₂₎ com 50% de variação média (composição do meio veja passo 1.4.4) sobre o segundo e terceiro dias. Não mude o meio nas primeiras 48 h.
   7. Incubar em meio consistindo em meio RPMI 1640 suplementado com 500? M 1-tioglicerol, HEPES 10 mM, 0,5% de penicilina / estreptomicina, 1? M Y-27632, 2% de suplemento de cultura de células neurais isento de soro (por exemplo B27) com insulina, 100 nM de Wnt -inhibitor DS-I-7 com troca de meio por dia 50% para os quatro dias seguintes. EBs deve começar a bater dentro deste período.
   8. Após uma semana de diferenciação cardíaca, mudar para o mesmo meio, sem a inibição de Wnt e com suplemento de cultura de células neurais isento de soro. Mudar 50% do meio todos os dias, exceto para o primeiro dia.
5. Dissociação de cardiomiócitos humanos
   NOTA: Depois de duas semanas de protocolo de diferenciação, EBs deve mostrar contracções espontâneas (Figura 1C). Se assim for, começar a dissociação e preparar solução de colagenase.
   1. Preparar a soluo de colagenase por pesagem e solução de 200 U / mL em solução de sal equilibrada isenta de cálcio de Hank sem cálcio / magnésio (HBSS) e adicionar HEPES 1 mM, 10? M Y-27632, de 30 uM sulfonamida-N-benzil-p-tolueno ( BTS). Esterilizar por filtração (filtro de 0,2 um) e alíquotas armazenar a -20 ° C. Descongelar alíquotas a 4 ° C durante a noite.
   2. Settle EBS em rack de sedimentação,meio aspirado e substituir com HBSS 20-25 mL de pré-aquecido. Repetir esta etapa de lavagem mais uma vez.
   3. Aspirar HBSS e substituir com solução de colagenase pré-aquecido (15 mL / T175). Incuba-se durante 4 horas na incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% de _CO2, 21% _{de O2).}
   4. Preparar tampão de bloqueio com DMEM suplementado com 1% de penicilina / estreptomicina e ADNase (12 ug / mL).
   5. Toque nos frascos de cultura celular no banco, dissociada EBs deve desintegrar-se e cair (se não, aumentar o tempo de incubação). suspensão de células suavemente triturado e transferência para um tubo cónico de 50 mL. Lavar frascos com tampão (15 mL / T175) de bloqueio e transferir para o tubo.
   6. Centrifugar durante 10 minutos a 100 x g. Ressuspender as células em DMEM quente, triturar e contagem de células.

2. Geração de Engineered coração Tissue (EHT)

1. Autoclave cremalheiras PDMS comercialmente disponíveis e politetrafluoretileno (PTFE) espaçadores (ver Materiais ePlanilha equipamentos; Figura 2) e preparar as seguintes soluções sob condições de esterilidade, um dia antes da geração EHT.
   1. Preparar 2% de agarose por pesagem e dissolução num volume apropriado de PBS, autoclave, armazenar imediatamente a 60 ° C.
   2. Prepare aprotinina (33 mg / mL) por pesagem e dissolução num volume apropriado de Aqua ad iniectabilia, filtro estéril (filtro de 0,22 um), alíquota e armazenar a -20 ° C.
   3. Preparar fibrinogénio (200 mg / ml) por dissolução de fibrinogénio estéril num volume apropriado de 0,9% de NaCl (morna), alíquota e armazenar a -20 ° C.
   4. Prepare de trombina (100 U / ml) por dissolução de trombina estéril em três partes de PBS estéril e 2 partes iniectabilia ad aqua, partes alíquotas de 3 mL em tubos pequenos e armazenar a -20 ° C.
   5. Prepare 10x DMEM por dissolução de 670 mg de 10x DMEM em pó em 5 mL de anúncios iniectabilia aqua, filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
   6. Prepare 2x DMEMpor mistura de 2 ml de 10x DMEM com 2 ml de soro de cavalo inactivado pelo calor, 0,2 ml de penicilina / estreptomicina e 5,8 mL iniectabilia ad aqua, filtro estéril e armazenar a 4 ° C.
   7. Prepare EHT de fundição de forma (ECM) por mistura de DMEM com 10% de soro inactivado por calor fetal de vitelo, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de L-glutamina (200 mM), armazenar a 4 ° C.
2. Preparar moldes de vazamento em placas de 24 poços, pipetando 1,6 mL de agarose quente (2%, PBS) e colocando o PTFE espaçador (Figura 2A) para os poços.
   NOTA: Coloque espaçador imediatamente após pipetagem para um máximo de 8 poços - agarose solidifica muito rápido. Não deixar a agarose à temperatura ambiente durante mais de 5 min.
3. Após a solidificação de agarose (~ 10 min, agarose girará opaco), remover os espaçadores de PTFE (Figura 2C) e colocar os PDMS cremalheiras (Figura 2B) para dentro dos moldes de fundição de modo a que pares de postes de PDMS atingir em cada um dos moldes (Figura 2D).
4. Ressuspender as cardiomiócitos em ECM com uma concentração mínima de 15 x 10 ⁶ culas / mL.
5. Preparar 110% do volume estimado de mistura reconstituição num tubo de fundo redondo de 15 ml em 24 ice.For EHTs, pipetar a mistura reconstituição listados na Tabela 1 para humanos, rato ou ratinho cardiomiócitos, respectivamente (10% extra está incluído).
   NOTA: A concentração celular da mistura de reconstituição é diferente de (6,8 x 10 ⁶ culas / mL) EHTs humano (10 x 10 ⁶ culas / mL), de rato (4,1 x 10 ⁶ culas / mL) e de ratinho. Dependendo da concentração da suspensão de células, adicionar ECM adicional para um volume final de 2640 uL. Fibrinogênio tem que ser morna por pipetagem. Lentamente encher a ponta da pipeta e não toque a superfície da mistura de reconstituição frio com a pipeta contendo fibrinogénio fibrinogénio ao adicionar à mistura reconstituição - a viscosidade do fibrinogénio na ponta da pipeta aumentaria imediatamente.
6. Tritura-se a mistura de reconstituição 10 - 15 vezes com uma pipeta serológica até que o coágulo de fibrinogénio é dissolvido. Verifique a mistura reconstituição na pipeta de homogeneidade.
7. Para cada composto EHT, pipeta 100 uL mistura reconstituição em uma aliquota de trombina (3 uL em 200 uL de tubo), misturar e pipetar a mistura em agarose-intervalos tão rapidamente quanto possível (Figura 2E). Utilize uma nova ponta de filtro para cada EHT. Ressuspender a mistura reconstituição (trituração com pipeta serológica 5-10 vezes) depois de cada 8 EHTs.
8. Uma vez que todas as ranhuras são cheias com uma mistura de reconstituição, fechar a tampa do prato de cultura de células e incubar a 37 ° C, 7% de CO ₂ durante 2 h.
9. Remova a placa do incubador e coloca-se sob uma cobertura estéril. Cobrir cada poço com uma pequena quantidade de meio (por exemplo, DMEM, aproximadamente 200-500 mL), agitar a placa suavemente e incuba-se novamente a 37 ° C durante pelo menos 10 min. A adição de DMEM irá facilitar a remoção a partir de geles de fibrina a partir de moldes de fundição de agarose.
10. Prepara-se uma nova placa de 24 pos com 1,5 mL EHT-meio por cavidade que consiste em DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo inactivado termicamente, 1% de penicilina / estreptomicina, 10 pg / ml de insulina, 33 ^ g / mL aprotinina.
11. Cuidadosamente remover as prateleiras de PDMS a partir dos moldes de fundição de agarose e transferi-los para a placa de 24 poços cheios com meio (Figura 2F). Colocar o prato de volta na incubadora (37 ° C, 7% de _CO2, 40% de O ₂ para EHTs humanos e de rato, 21% de O ₂ para EHTs rato) e alimentação segundas, quartas e sextas-feiras com EHT-meio preparado de fresco. EHTs deve mostrar as contracções espontâneas de desvio aos pilares das cremalheiras PDMS 7-10 dias após a fundição (Figura 1D, 2G).
    1. Para rato EHTs adicionar 25? G / mL de βDarabinofuranoside 5-citosina para meio de cultura durante 48 h para limitar a proliferação de fibroblastos.

Análise 3. Contração

NOTA: A análise de contração é baseado emvídeo-óptico de gravação em um instrumento de análise EHT disponível comercialmente (ver Tabela de materiais). A unidade central deste aparelho é uma câmara de incubação (Figura 3A). O software fornecido com o instrumento calcula a força de contração com base na deflexão das mensagens de PDMS com módulo de elasticidade conhecido e geometria ¹¹ (Recurso Figura 1).

1. Ligar o dispositivo de aquecimento da máquina de 2 h antes da medição. Ligue o fornecimento de gás de alimentação e electrónico do sistema de eixos imediatamente antes da análise contracção.
2. Para a gravação da linha de base (ponto de referência para a análise), colocar a poços de placa 24 com as EHTs em EHT-forma para o instrumento de análise EHT e iniciar o software de análise de contracção de acordo com o manual do fornecedor.
   1. Clique na guia "Protocolo" no painel da direita e digite as informações pertinentes relativas nome estudo, usuário, espécie, ceTipo II, idade, tempo de gravação e observações adicionais.
   2. Clique na guia "view Camera" no painel esquerdo e iniciar o modo de viver câmera com modo de detecção figura automático. Clique na guia "Setup" no painel da direita andadjust a posição da câmera com o xyz coordenadas para cada poço na 24 bem-prato. Verifique se o EHT está no centro da janela e no foco da câmera.
      1. Verifique se a tampa da placa de cultura de células não é nebuloso pois isso irá prejudicar o reconhecimento figura e análise de contração.
         NOTA: O algoritmo figura reconhecimento é baseado na detecção de áreas de alto contraste e monitorizar a sua mudança de posição. No software estas áreas de reconhecimento figura será marcado com uma cruz azul que se move com as contrações do EHT.
      2. Certifique-se de que as posições das cruzes azuis são em ambas as extremidades superior e inferior das EHTs e movendo-se apenas verticalmente correspondentes as contracções dos EHTs (Figura 3B). Sposições de instalação ave de cada bem, pressionando o botão "posição ok".
   3. Em seguida, clique na guia "Parâmetros" no painel esquerdo. Os parâmetros exibidos aqui definir os critérios pelos quais o software identifica um pico de contração e marca-lo com um quadrado verde. Estes valores são muito importantes para a identificação correcta de picos de contracção (Figura 3C) e não há pontos de dados falsos (Figura 3E-F).
      NOTA: uma lista de espécies parâmetros dependentes e exemplos está representado na Figura 3H. Para mais detalhes, consulte o manual do software.
   4. Clique na guia "Automatic" no painel da direita e iniciar a análise, ativando o botão "Iniciar". O software irá mover sequencialmente de um bem para os próximos, ficha contrações EHT e calcular a força durante a gravação (exibida na guia "tempo real" no painel esquerdo). Ao final da análise, um relatório pdf summariXing, os resultados serão gerados automaticamente.
3. Guardar e analisar o pdf denunciar o sistema gerado para resumir os resultados.
4. Monitorar os parâmetros contráteis por medição repetida ao longo de vários dias. O composto EHT irá aumentar em força de contracção até que tenha atingido um patamar (normalmente por volta do dia 15 de cultura).
5. o rastreio de drogas
   1. Preparar a solução de Tyrode livre de proteína no dia anterior à medição e equilibrar em placas de 24 poços (2 ml / po) numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 7% de _CO2, 40% _{de O2)} durante a noite: 120 mM de NaCl, KCl 5,4 mM, MgCl ₂ 1 mM, CaCl ₂ 0,1-5, 0,4 mM de NaH ₂ PO _4, 22,6 mM _{de NaHCO3,} 5 mM de glucose, 0,05 mM Na ₂ EDTA, 25 mM de HEPES. Adicionar cálcio até 1,8 mM ou o previamente determinado _[EC50] para investigar os efeitos inotrópicos positivos.
   2. Pesar e dissolve-se o fármaco em DMSO e filtrar esterilizado, se necessário.Prepare soluções diferentes 6 1000x-sub-banco (em DMSO) dos concentração de trabalho (por exemplo, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 ^ M para o respectivo gama nanomolar).
   3. Dilui-se a respectiva estoque em placas de Tyrode (2 uL em cada poço 2 ml) e misturar bem. Colocar as placas de novo na incubadora até ser necessário.
   4. Inicie a medição da linha de base, tendo o primeiro de 24 poços de placa cheia de Tyrode sob os eléctrodos de capuz e carbono posição estéreis nos poços. Transferir os cestos de PDMS com as EHTs colocados no topo de eléctrodos de carbono, fechar a tampa, colocar a placa de volta na incubadora e esperar por um período de equilíbrio de ~ 30 min.
   5. Transferir os EHTs da incubadora para o encravamento no instrumento de análise EHT. Fechar o instrumento e gravar contractilidade espontânea de linha de base (20 s / EHT).
   6. Ligar os eléctrodos de carbono para o cabo de estimulação e iniciar a estimulação eléctrica das EHTs (2,5 V, 4 ms de duração de impulso, humana: ~ 1 Hz, ratazana: ~ 2Hz, rato: ~ 4 Hz). Registar a linha de base "acelerado" (10 s / EHT). Assegurar que todos os EHTs estão devidamente passeado. frequência de estimulação e a tensão pode variar de linha celular para linha celular.
   7. Após a gravação da linha de base, remover os EHTs do instrumento e transferir os eléctrodos com as cremalheiras PDMS em cima, para o bem-placa de 24 com a primeira concentração de droga. Transferir a EHTs de volta para o encravamento do instrumento de análise EHT imediatamente e incubar lá (padrão de incubação da droga o tempo, por exemplo 20 minutos).
   8. Ligar os cabos de estimulação, ajustar reconhecimento figura e gravar contracções EHT respondendo à primeira concentração do fármaco.
   9. Para as seguintes concentrações de droga, repetir o passo 3.5.7 e 3.5.8 com o 24-well-placas contendo concentrações mais elevadas da droga.
   10. Salve todas as gravações pdf. Verificar cada gravação para reconhecimento figura, o posicionamento correcto dos quadrados verde identificar picos da contração e artefactos (ver 3.2.1 e Figura 3 ).
   11. Realizar análise offline adicionais, se necessário.
       1. Escolha o respectivo prazo do banco de dados "Funciona" no painel esquerdo, clicando em "Select run". Na aba "parâmetro", à esquerda, alterar o parâmetro para a análise de contração. Agora escolha "análise off-line" no separador "off-line" no painel direito de reanalisar os vídeos.
       2. Para ajustar o reconhecimento figura e, portanto, gravar um novo arquivo de vídeo, escolha "revisão Sample" depois de ajustar o reconhecimento figura na guia "em tempo real". NOTA: revisão Amostra só pode reanalisar um poço de cada vez, enquanto que a análise offline pode aplicar novo parâmetro para todos os poços clicando no botão "Use parâmetro em todos os poços" botão no painel "Parâmetro" na esquerda. Ambos os tipos de análises off-line irá criar automaticamente novos arquivos de dados e pdf exibindo os resultados.
   12. Analisar o experimento, combinando os resultados da biological replica e resumir os dados em curvas de resposta à concentração para a frequência, a força de contração, tempo de contração e tempo de relaxação (Figura 5D) e de exibição / ou gráfico de picos de contracção média (Figura 5C).
       NOTA: As cremalheiras do PDMS e PTFE espaçador pode ser usado repetidamente (PDMS prateleiras no máximo 5 vezes, e PTFE espaçador indefinidamente.). Após a utilização, limpá-los manualmente com água, ferver duas vezes em água desmineralizada e autoclave. Estar ciente dos potenciais efeitos de transferência, quando re-utilizando as prateleiras, como drogas pode ser absorvido pelos PDMS.

Resultados

Diferenciação cardíaca e Preparação do composto EHT

HiPSC foram expandidas na matriz de membrana basal factor de crescimento reduzida, dissociadas com EDTA e corpos embrióides (EBS) formadas em frascos rotativos durante a noite. Após a indução mesodérmica durante três dias, a diferenciação cardíaca foi iniciado com o inibidor de Wnt. Depois de ~ 17 dias de protocolo de diferenciação, EBs batendo foram dissociadas ...

Discussão

tecido do coração Engineered oferece uma opção valiosa para a caixa de ferramenta de pesquisa cardiovascular. EHTs no formato de 24 poços provaram valiosa para a modelagem de doença ^{8, 14,} o rastreio de segurança de medicamentos ^{7, 8, 10, 11, 15,} ou de investigação cardiovascular básica

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EHT analysis intrument	EHT Technologies GmbH	A0001	Software is included
EHT PDMS rack	EHT Technologies GmbH	C0001
EHT PTFE spacer	EHT Technologies GmbH	C0002
EHT electrode	EHT Technologies GmbH	P0001
EHT pacing adapter/cable	EHT Technologies GmbH	P0002
24-well-plate	Nunc	144530
6 well-cell culture plate	Nunc	140675
15 ml falcon tube, graduated	Sarstedt	62,554,502
Cell scraper	Sarstedt	831,830
Spinner flask	Integra	182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct	Thermo scientific	70101	Adjust rotor speed to 40 rpm
T175 cell culture flask	Sarstedt	831,812,002
V-shaped sedimentation rack	Custom made at UKE Hamburg	na
10× DMEM	Gibco	52100
1-Thioglycerol	Sigma Aldrich	M6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt	Sigma Aldrich	49752
Activin-A	R&D systems	338-AC
Agarose	Invitrogen	15510-019
Aprotinin	Sigma Aldrich	A1153
Aqua ad injectabilia	Baxter GmbH	1428
B27 PLUS insulin	Gibco	17504-044
BMP-4	R&D systems	314-BP
Collagenase II	Worthington	LS004176
DMEM	Biochrom	F0415
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
DNase II, type V (from bovine spleen)	Sigma	D8764
Dorsomorphin	abcam	ab120843
EDTA	Roth	8043.2
Fetal calf serum	Gibco	10437028
FGF2	Miltenyi Biotec	130-104-921
Fibrinogen (bovine)	Sigma Aldrich	F8630
Geltrex	Gibco	A1413302	For coating: 1:200 dilution
HBSS w/o Ca2+/Mg2+	Gibco	14175-053
HEPES	Roth	9105.4
Horse serum	Life technologies	26050088
Human serum albumin	Biological Industries	05-720-1B
Insulin, human	Sigma Aldrich	I9278
L-Glutamin	Gibco	25030-024
Lipidmix	Sigma Aldrich	L5146
Matrigel	BD Biosciences	354234	For EHT reconsitutionmix.
N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide	TCI	B3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2	Biochrom	14190
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
Polyvinyl alcohol	Sigma Aldrich	P8136
RPMI 1640	Gibco	21875
Sodium selenite	Sigma Aldrich	S5261
TGFß1	Peprotech	100-21
Thrombin	Sigma Aldrich	T7513
Transferrin	Sigma Aldrich	T8158
Y-27632	Biorbyt	orb6014
hiPSC	Custom made at UKE hamburg	na
iCell cardiomyocytes kit	Cellular Dynamics International	CMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kit	Pluriomics	PCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit	Axiogenesis AG	Ax-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytes	Takara Bio USA, Inc.	Y10075