PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Summary

תחבורה יון הסלולר לעתים קרובות יכול להיות מוערך על ידי ניטור pH תאיים (pH_אני). גנטית Encoded pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק אופטי כימות תאיים pH בתאים ללא פגע. פרוטוקול זה פרטים כימות של החומציות תאיים באמצעות הסלולר שמחוץ לחיות-הדמיה של בקוריאנית Malpighian של דרוזופילה melanogaster עם pHerry, פסאודו-רציומטרי גנטית מקודד ה-pH-מחוון.

Abstract

יון אפיתל תחבורה חיוני יון מערכתית הומאוסטזיס, כמו גם התחזוקה של מעברי צבע אלקטרוכימי הסלולר חיוני. החומציות תאיים (pH_אני) מושפע על ידי מובילי יון רבים, ובכך ניטור pH_אני כלי שימושי עבור הערכת פעילות המשלח. מודרני גנטית מקודד ה-pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק כימות אופטי של pH_אני בתאים שלמים בסולם סלולרית ו- subcellular. פרוטוקול זה מתאר כימות בזמן אמת של pH הסלולר_אני תקנה ב Malpighian בקוריאנית (MTs) של דרוזופילה melanogaster דרך שמחוץ לחיות הדמיה של pHerry, GEpHI פסאודו-רציומטרי עם pK מתאים היטב כדי לעקוב אחר שינויים pH ציטוזול. לעוף למבוגרים שחולצו MTs מורכבים חלקים נפרדים מורפולוגית והן מבחינה תפקודית של שכבה חד-תא epithelia, ו יכול לשמש מודל נגיש, צייתן גנטית לחקירה התחבורה אפיתל. GEpHIs מציעים כמה יתרונות על פני צבעי פלורסנט קונבנציונלי רגיש pH ואלקטרודות יון סלקטיבי. GEpHIs יכול תווית אוכלוסיות תאים נפרדים בתנאי מקדם המתאים רכיבים זמינים. תיוג זה שימושי במיוחד ב- ex-vivo ויוו, בחיי עיר ההכנות, אשר מטבעו הטרוגנית. GEpHIs גם היתר כימות של pH_i ברקמות תקין לאורך זמן ללא צורך לצבוע חוזרות טיפול או רקמות הוצאתו. החיסרון העיקרי של GEpHIs הנוכחי הוא נטייה לצבור ב תכלילים cytosolic בתגובה נזק לרקמות ולבנות ביטוי יתר. חסרונות אלה הפתרונות שלהם, את היתרונות של GEpHIs הם הפגינו את פרוטוקול זה דרך הערכת התחבורה פרוטון (H.⁺) basolateral בתאי stellate ועקרוני נפרדים פונקציונלית של זבוב שחולצו MTs. טכניקות וניתוח תיאר בקלות להתאמה למגוון רחב של חוליות, הגעה ההכנות, ניתן לשנות את התחכום של וזמינותו של מעבדות להגדרה הסבוך של יון השטף דרך שנאים ספציפי.

Introduction

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את כימות של החומציות תאיים (pH_i) שימוש בקידוד גנטית pH-מחוון (GEpHI), להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך basolateral H⁺ תחבורה חרק מודל (נפטר ב- melanogaster) מבנה הכליות, צנורית Malpighian (MT). MTs לשמש הריקון של זבוב הפירות, דומים מבחינה תפקודית נפרון בתרבית של כבוד מפתח מספר¹. MTs מסודרים 2 זוגות של בקוריאנית (anterior ואת אחורי) בית החזה, הבטן של הזבוב. הצינור אפיתל בתא יחיד של כל הר מורכב סמויה הפעיל העיקרי תאים עם ברורים הפסגה (luminal), basolateral (hemocoel) קוטביות, כמו גם תאי stellate intercalated. MTs הקדמי מורכבות 3 מורפולוגית, פונקציונלי, ומורחבים מקטעים נפרדים נכה, ובייחוד הראשונית קטע, קטע המעבר ואת הפרשה קטע הראשי, אשר מצטרף שופכן² את המשקל הסלולר תחבורה טרנס-אפיתל יון לתוך לומן מושגת על ידי של קרום פלזמה הפסגה V-ATPase³ ו מחליף אלקלי-מתכת/H⁺ , כמו גם של basolateral Na⁺-K⁺-ATPase⁴, K פנימה-יישור⁺ ערוצי⁵, Na⁺-מונע Cl⁻/HCO₃⁻ מחליף (NDAE1)⁶ו- Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, ואילו תאי stellate לתווך Cl^– ולהעביר מים^8,9. מערכת הפיזיולוגיות זו מורכבת אך נגיש מספקת הזדמנויות מצוינות עבור חקירת מנגנוני הובלה יון אנדוגני בשילוב עם toolsets גנטיות והתנהגותיות מגוונות של דרוזופילה.

הרציונל עבור פרוטוקול זה היה לתאר מערכת גנטית חמרן ללמוד יון אפיתל תחבורה עם פוטנציאל לשילוב מתא כדי התנהגות וייצוא של כלים למערכות אחרות מודל. הביטוי של pHerry¹⁰GEpHI נגזר מן שילוב של ירוק מישור המילקה סופר רגיש pH pHluorin^11,12 (ע) ו אדום mCherry pH-רגישות¹³, ב- MTs מאפשרת כימות של תחבורה H⁺ תאים בודדים MT דרך גבוהה K⁺/nigericin כיול טכניקה¹⁴. מובילי יון רבים עובר H⁺ מקבילות, כימות של החומציות תאיים_אני משמש ייצוג פונקציונלי של יון תנועה באמצעות מגוון רחב של שנאים. מערכת מודל דרוזופילה MT מציע גם כלים רבי-עוצמה גנטי רקמות ספציפיות transgene¹⁵ ו RNA הפרעה (RNAi)¹⁶ הביטוי, אשר יכול להיות משולב עם הדמיה הסלולר ואת מבחני כולו אורגן^{17 , 18 , 19} של פונקציה צנורית כדי ליצור ערכת כלים חזקים עם אינטגרציה אנכית ממולקולות להתנהגות. זה סתירותיה מציבה ניגוד לחיים פרוטוקולים רבים אחרים עבור הערכת ביולוגיה אפיתל, כמו מדידות היסטורית כאלה צריכים לסמוך על מורכבות, מרתיעה אלקטרודות יון סלקטיבי ניתוח מיקרו, מתוחכם^20,21, רגיש pH יקר צבענים²² עם דרישות הטעינה מגבילות וספציפיות הסלולר המסכן ברקמות הטרוגנית. GEpHIs היו בשימוש נרחב למדידת pH_אני במגוון סוגי תאים²³. בתחילת העבודה מנוצלת הגלום pH-הרגישות של ירוק ניאון חלבון (GFP) כדי לפקח על pH_אני בתרבית תאים אפיתל²⁴ , אבל בשני העשורים לראות GEpHIs משמש נוירונים²⁵, עכשיו, דונלד²⁶, פטריות²⁷ , צמח תאי²⁸. השילוב של הפוטנציאל של פילוח הסלולר של מבנים גנטיים באמצעות המערכת את הביטוי GAL4/UAS¹⁵ הנגישות הפיזיולוגיות של דרוזופילה MT שזה הכנה אידיאלית של חקירות של pH_אני תקנה ותעבורה יון אפיתל.

pH_אני תקנה נחקר במשך עשרות שנים, והוא חיוני לחיים. הכנת MT מציע מודל חזקים כדי ללמד את הפיזיולוגיה של pH_אני רגולציה, אבל גם לבצע מתוחכם חקירות של pH_i לתקנה ex-vivo ו vivo בתוך. פרוטוקול זה מתאר כימות של H⁺ תנועה על פני קרום basolateral של תאי אפיתל של דרוזופילה MT באמצעות ה NH₄Cl הדופק חומצה טעינה טכניקה²¹, אבל כמו מחוון ה-pH היא גנטית מקודד, שיטות אלה ומסגרת תיאורטית שלהם ניתן ליישם כל הכנה נוטה transgenesis, הדמיה לחיות.

Protocol

כל השלבים פרוטוקול זה לעמוד בהנחיות שימוש בבעלי חיים מאיו קליניק (רוצ'סטר, MN).

1. גידול לעוף

1. העלאה זבובים, ערכת צלבים על פי בעלי תקן²⁹.
   הערה: הביטוי פלורסנט כתב על ידי מערכת GAL4/UAS פרופורציונליים לטמפרטורה, ובכך לגידול טמפרטורה יכול להיות מותאם כדי לשנות את רמת הביטוי. ואילו רמות הביטוי גבוהה לעיתים קרובות להוביל יחס אות לרעש טוב יותר במצב זה קשורה גם אגרגטים cytosolic, אבחון מוגבר כאשר משתמש GFP כדי פיוז'ן חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) בונה כגון pHerry^{10, 30,31}. אם צבירת הוא בלתי נמנע, כימות היא עדיין אפשרי על ידי ביצוע הצבע ולידציות כל נתוני הניסוי, נורמליזציה כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pH_אני 7.0 (ראה שלב 7.4 הערה על כיול להלן).
2. סט חוצה של הזכרים³² homozygous capaR-GAL4homozygous UAS-pHerry¹⁰ בתולה נקבות וזכרים homozygous c724-GAL4² homozygous לנשים בתולה UAS-pHerry להתיר הדמיה של pH_אני תאים עיקריים, תאי stellate MT, בהתאמה. מניחים 6 נקבות UAS-pHerry עם 3 זכרים GAL4 טריים צלוחיות של מזון ולהשאיר להזדווג ב 28 º C.
   הערה: הזחלים צריך להיות בולט בתוך 4 d, מבוגרים יתחיל eclose סביב יום 10.
3. לאסוף זבובים הנשי על וגיחתו, להפריש גיל 10 י ב 28 º C.
   הערה: העיתוי של ניסויים יכול להיות מותאם כדי שיתאימו בכל מבחני התנהגות מגבילים (כגון רמזי הפרשת assay^17,19) אשר יקושרו ל pH בשידור חי תאיים הדמיה. זבובים זכרים יכולים לשמש אך בקוריאנית מן הנקבות לעיתים גדול ועוצמתי יותר.

2. הכנת שקופיות פולי-L-ליזין.

1. צייר גבול 40 x 20 מ מ עם עט PAP הידרופובי סביב החלק העליון של שקופיות תקן 75 x 25 ממ, מניחים בצד לייבוש למשך 15 דקות על coverslips גדול RT. שימוש אם השקופיות אינן תואמות הדמיה אופטיקה.
2. העברת 2 מ"ל של 0.01% מניות פולי-L-ליזין (PLL) פתרון על גבי כל שקופית, להפריש עבור 1 h-RT.
3. להסיר את עודף PLL עם פיפטה. שמור את הפתרון בקבוקון חרוט 50 מ ל לשימוש עתידי. חנות ב 4 º C.
4. תשאף כל פתרון הנותרים עם קו ואקום. הפעל את שורת ואקום על פני כל השקופית כדי להבטיח שאין פתרון יישאר בשקופיות.
5. להגדיר את השקופיות בצד לשעה נוספת RT לפני השימוש. לאחסן את השקופיות יבש ב RT במשך עד חודש בספר שקופית רגילה.

3. הכנת לנתח מאכל ומוטות זכוכית

1. להוסיף 0.5 מ של הסוכן ריפוי elastomer 4.5 מ של אלסטומר מהבסיס פוליסטירן 35 x 10 מ"מ פטרי-RT לייצר לעומק של 5 מ מ. מערבבים עם טיפ פיפטה חד פעמיות. לאפשר elastomer לרפא O/N-RT.
   הערה: Elastomer צריך להיות ברור, ללא בועות. חישוף של בועות עשוי להקל על ידי שמירה על צלחות elastomer בתוך צנצנת ואקום למשך 10-15 דקות לאחר שמזג.
2. להחזיק מוט זכוכית בקוטר 5 מ מ בין הידיים, להמיס את המרכז של המוט מעל מבער בונזן מואר תוך משיכת לגזרים את הקצוות. כמו הכוס נמס למשוך יותר מהר כדי לייצר דק (0.1 מ מ) בעלת מחודדות פיר (איור 1).
   הערה: בזווית של 45 °-הדוקרן לעיתים קרובות שימושי בטיפול בקוריאנית. זו יכולה להיות מושגת על-ידי הורדת יד אחת כמו הסכין נמשך (ראה איור 1).
3. לשבור את מוט דק באמצע עם הצד הקהה של תער סיף פחמן פלדה. לבדוק את הסוף דק של המוט תחת טווח ויבתר כדי להבטיח שמעבר נקי.

איור 1: בדיית זכוכית מוטות לטיפול Malpighian בקוריאנית.
A - E. תהליך של חימום ומושך מוט זכוכית לייצר להתחדד, זווית מתאימה לטיפול MTs. חצים מציינות כיוון ובהיקף של כוח כדי להחיל. F. צילום של כלי זכוכית כראוי מפוברק. סרגל קנה מידה = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. הכנת פתרונות ומערכת זלוף

הערה: מערכות זלוף שונים על-ידי יצרן. פרוטוקול זה בנויה סביב הכבידה-fed 8 ערוצים פתוחים מאגר עם הרגולטור קצב זרימה קלט, יצוא מונחה ואקום, אבל השיטה של הרכבה ש-mts כפי שמתואר כאן יכול להיות מותאם לעבודה עם כל מערכת זלוף.

1. הכן את הפתרונות הבאים:
   1. בינונית (40 מ"ל לתוך מבחנות חרוט 50 מ ל) של שניידר aliquot וחנות ב 4 º C.
   2. להכין פתרונות (קרי חרק מלוחים Phosphate-Buffered (iPBS), iPBS עם NH₄Cl) ב RT כנדרש על פי טבלה 1). פתרונות חמים RT לפני השימוש ביום של הניסוי.
      הערה: iPBS ו- iPBS עם 40 מ מ NH₄Cl ניתן להכין בכמויות גדולות (1 ליטר או יותר), המאוחסנים ב 4 º C.
   3. להכין פתרונות כיול 8 כרכים 500 מ"ל ב- pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 ו- 9.0 כמצוין בטבלה 1 , חנות ב 4 º C. להתאים את ה-pH של כל פתרון באמצעות טיטור עם N-מתיל-D-glucamine (NMDG) ו- HCl.
   4. ביום של ניסויים, לחמם aliquots מ של פתרונות כיול RT ולהוסיף nigericin מניות פתרון (20 מ"מ דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) כדי לייצר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
      התראה: לטפל nigericin עם כפפות. פנקו את כל הציוד שבא במגע עם nigericin כמו חד פעמיות. Nigericin נשאר על זכוכית ופלסטיק, תסכן את ההכנות ביולוגי אם ציוד שימוש חוזר.
2. זלוף מערכת:
   1. ראש מערכת זלוף על-ידי מילוי כל המאגרים ב- ddH₂O (איור 2). לפתוח את הערוצים אחד בכל פעם כדי לאפשר את כל הקווים מקורב אל המתקן קצב זרימה כדי למלא.
      הערה: זה עשוי להיות נחוץ לנקות את האוויר שורות על-ידי פתיחת הערוץ מושבת ושימוש פומפה לזרימה נסיעה מן המאגר.
   2. לפתוח 2 ערוצים ולאפשר ddH₂O לנקז. ברגע המאגרים הם כמעט ריק מאדם, למלא המאגר הראשון iPBS, המאגר השני עם NH₄iPBS פעמו Cl. להגדיר קצב הזרימה למקסימום עם הרגולטור קצב זרימה לאפשר פתרון לזרום עבור 1 דקות למלא את השורות הדיסטלי, ולאחר מכן לעצור את הזרם (איור 2).
   3. מיקום 2 ערכות של הלחמה מלחציים "עזרה ידיים" על הבמה מיקרוסקופ הדמיה. מניחים מהדק אחד בכל צד של פלטפורמת הדמיה.
   4. בזהירות לחמם את 0.5 אינצי'ם דיסטלי של פיסת זכוכית נימי (הקוטר הפנימי 1.5 מ מ, הקוטר החיצוני 0.86 מ מ, אורך 100 מ מ) מעל מבער בונזן. ליצור עיקול 45 ° על-ידי ומאפשר הסוף דיסטלי לכופף המשיכה והסרה הזכוכית מהאש ברגע הזווית הרצויה מושגת. חזור על תהליך זה עם חתיכת זכוכית נימי השני.
   5. הכנס הנימים זכוכית כיפוף בזרימה קו, קו יצוא המחוברים ואקום, בהתאמה והר אותם בידיו"עוזר" כדי ליישר אותם עם השלב הדמיה של המיקרוסקופ (איור 3).

איור 2: מערכת זלוף והדמיה של תצורה.
הרכיבים הנחוצים פיזיולוגיים להערכת תפקוד התחבורה basolateral MT דרך בו זמנית חיים פלורסצנטיות הדמיה ומהירה פתרון exchange. קווי הגז המוצגות הן אופציונליות ו היתר הרחבת סדרת ניסויים ההערכה התחבורה HCO₃^– . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: זרימה סכמטית זלוף מכשירי NH₄Cl הדופק ניסויים.
חצים מתארים זרימת והנתיב שסתום מיתוג נקודות. פתרון עובר מן המאגר הדגימה על ידי זרימת הכבידה, מצויר מן החדר הדגימה הבקבוקון פסולת ביניקה ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. ניתוח למבוגרים דרוזופילה Anterior Malpighian בקוריאנית.

1. לאסוף את המנה הקרע משך זכוכית רוד ממקטע 3, שקופית מצופים PLL מהסעיף 2, קו מפריד דבק של זלוף-. טוב, גריז ואקום, 4 x 2" רצועת אטימה סרט, 2 זוגות #5 משובחים מלקחיים, aliquots 40 מ"ל של שניידר כקרח בינוני ו RT iPBS.
2. מורחים משחה ואקום בקלטת איטום והקש על המפריד זלוף-ובכן דבק על גבי הקלטת. מעיל התחתון עם גריז. לקלף את המפריד זלוף-ובכן דבק ולמקם אותו גריז לצד השני על גבי שקופית PLL מצופה. הסרה של הקו המפריד זלוף-טוב לעזוב את הדגימה בודדים בארות איתרו בגריז הידרופובי.
3. במקום 200 µL של iPBS RT ב כיתרו גריז. ובכן בשקופית מצופה PLL ולהעביר השקופית תחת סטריאוסקופ.
4. המקום UAS-pHerry/capaR-GAL4 זבובים זבוב ריק בקבוקון, עזים ומתנגד אותם על קרח למשך 10 דקות.
   הערה: שיטה זו של הרדמה, בניגוד CO₂, מבטיחה הזבובים לא מייבשים.
5. שופכים את המדיום של שניידר קר כקרח לתוך המנה ויבתר ולהשתמש מלקחיים בסדר להעביר זבוב אחד נקבה anesthetized לתוך המנה תחת סטריאוסקופ ויבתר.
6. להחזיק את הזבוב על ידי בית החזה עם סט של מלקחיים ולהשתמש השני כדי לאחוז בעדינות. הצד האחורי של הבטן. מושכים. הצד האחורי של הזבוב עם המלקחיים בקיצור, תנועות מכוונות. לאחר hindgut גלוי, לאחוז בקצה הדיסטלי, לשחרר את הבטן ואת MTs tracheoles הבסיסית על ידי משיכת את hindgut מן הגוף דרך גוררות חוזרים, קצר.
   הערה: MTs anterior ואת אחורי יהיה גלוי הם נפגשים בצומת של פיתול, hindgut דרך השופכן. זוג הנעליים הראשון של MTs להיות רצון חופשי סביר להיות בקוריאנית האחוריים הם להקיף את hindgut. אלה ניתן להתעלם (איור 4A).
7. לצבוט את MTs הקדמי על השופכן עם מלקחיים בסדר, ברגע הסט השני של MTs חינם של הבטן. זה להפריד את MTs הקדמי מהמעיים וסגור השופכן.
8. לאסוף את MTs הקדמי חינם עם מוט זכוכית משך על-ידי הזזת המוט מתחת השופכן כך בקוריאנית ליפול לצדדים. הרם את MTs ישר החוצה הפתרון.
9. הפעל את מוט זכוכית כך MTs של שופכן הם דבקו בחלקו התחתון של המוט, ורד השופכן ישר על השקופית. מוספית השופכן, חותם את הקצוות דיסטלי של MTs על ידי לחיצה על השופכן למטה על גבי השקופית זכוכית (איור 4B). לא לתמרן את MTs יותר מהדרוש. MTs אמור. לרחף למעלה בפתרון עם השופכן מעוגן לשקופית.
10. השתמש בסדר סוף מוט זכוכית בעדינות לסחוף כל צנורית פני שקופיות. הכינו את המוט נגד השקופית כדי להימנע מוחצת את צנורית והחלק את המוט מעל צנורית, העברת דיסטלי צינתור, לצרף באורך מלא של כל צנורית אל פני השטח של השקופית מצופים PLL (איור 4C).
11. מקם את המפריד זלוף-ובכן דבק בחזרה על השקופית כדי ליצור קטן מלאות נוזל גם יותר צנורית הנטען.
12. מקם את הדגימה על הבמה מיקרוסקופ. מקם מהזרימה, יצוא נימים על כניסת ועל פתיחת לשקע זלוף טוב, בהתאמה.
    הערה: המפריד טוב יכול להיות הפסקת אם תא זלוף פתוח רצוי. במקרה זה ניתן ליישר הנימים תזרים, יצוא אל צידי לדימות היטב.

6. אימות של הדמיה פרוטוקול ובריאות צנורית

הערה: פרוטוקול זה מתבצע על מיקרוסקופ פלורסנטי רחב-שדה הפוך עם GFP (ע), מערכות סינון RFP (mCherry) (470/40 ננומטר עירור (לשעבר), nm 515 longpass פליטה (em), 500 ננומטר ודיקרואיק זוהר, 546/10 ננומטר לשעבר, 590 nm longpass em, 565 nm ודיקרואיק זוהר), 10 X / 0.45 אוויר המטרה, מצלמה מונוכרומטי עבור לכידת תמונה חיה, ותוכנת הדמיה. הפרוטוקול ניתן להתאים עבור כל זקוף או הפוכה מיקרוסקופ עם מסנן אוטומטי מעבר בין GFP ו- RFP אופטיקה ותמונה רכישת תוכנה, אף פעמים חשיפה אופטימלית, עוצמת האור ופרמטרים binning משתנים. בניתוח כל, עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך להיות מנותח כמו עוצמת פיקסל רע באזור של הריבית (ROI), לאחר חיסור רקע בכל אחד מהערוצים באמצעות רועי עם מכיל אין קרינה פלואורסצנטית סמוכים לאות ROI.

1. הפעל את המיקרוסקופ, מקור אור ומערכת הדמיה.
2. תוכנת הדמיה פתוח המשויך.
3. דרך העיינית של המצלמה ולהתאים באופן ידני המוקד עד לומן של MT ברור תחת אור המשודרת.
4. לחץ על הכרטיסייה "רכישת" תוכנת ניתוח התמונה ובחר "2 x 2" בתפריט הנפתח "Binning" במדור "רכישת מצב".
5. להוסיף 5% דחיסות נייטרלית מסנן לתוך נתיב האור כדי להפחית את אור תאורה ולצמצם את photobleaching.
6. לחץ על הערוץ GFP (ע) בתפריט "ערוצים" ולאחר מכן לחץ על "לחיות" כדי לבחון את האות פלורסנט דרך המצלמה.
7. כוונן את המחוון "זמן" כדי להגדיר את זמן החשיפה כך שהערכים פיקסל המבריקים בהיסטוגרמה בעוצמה מהווים כ 40% של הערך המרבי ולאחר מכן לחץ על "Stop" כדי לעצור את ההארה.
8. חזור על השלבים 6.6-6.7 RFP (mCherry) ערוץ, לאשר הנוכחות של החלק הראשוני מורחבים של MT הקדמי וכן העדר cytosolic mCherry אגרגטים (מעידה על נזק לרקמות או ביטוי) (איור 4D).
   הערה: קטע פתיחה צריך להיות גלוי כמו זה המקטע proximal ביותר של צנורית הקוטר של לומן הפנימי של קטע זה הוא ~ 20 מיקרומטר גדול מזה של המגזר המעבר סמוכים. 2 x 2 פיקסל binning לעיתים קרובות מספיקה אך ניתן להגדיל כדי לצמצם עוד יותר את עוצמת תאורה הנדרש. פעמים חשיפה טיפוסית הם בין 150 & 800 ms/ערוץ. להשתמש אור קטן ככל האפשר כדי למזער את photobleaching. מזעור photobleaching היא חיונית לשימוש של אינדיקטורים כפול-fluorophore כגון pHerry כמו fluorophores שני יכול להלבין באופן עצמאי, ובכך לפסול כל כיול יחס.
9. להפעיל פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ על ידי לחיצה על תיבת הסימון "זמן סדרה".
10. להתאים את "משך" בתפריט הנפתח במדור "זמן סדרה" 10 דקות, את המחוון "מרווח זמן" 0 כדי לקבוע את הזמן הכולל לכידת עם קצב רכישת התמונה המרבי. קצב הרכישה הכולל של הרץ 0.2 מספיקה לעתים קרובות.
11. בדוק GFP (ע) והן RFP (mCherry) בתיבות בסעיף "ערוצים".
12. לפתוח את הקו iPBS של מערכת זלוף על ידי הפעלת הבקר שסתום מתאים ולהתחיל פרוטוקול הדמיה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי." לאחר 1 דקות, לעבור NH-₄פתרון הדופק Cl 20 s על ידי השסתום המתאים וסוגר את הקו iPBS, ואז לחזור iPBS על ידי סגירת NH₄קו Cl פותחים מחדש את השסתום iPBS. לאפשר את פרוטוקול הדמיה מלאה להשלים לפני הפסקת מערכת זלוף.
    הערה: ניתוח זמן לשגות צריך לחשוף אות mCherry יציב, אות ע אשר מגביר בנוכחות NH₄קלרנית, המרווה על שטיפה, והוא מתאושש בהדרגה.
13. לבצע כיול של 2 נקודות.
    1. הסרה של הקו המפריד היטב על ידי פילינג זה מן השקופית הבסיסית, הסר את נימי הדם זלוף ואת מלחציים ההדמיה היטב.
    2. µL 200 כיול iPBS (pH 7.4, nigericin 10 מיקרומטר) חלות על ההדמיה היטב עם פיפטה 200 µL. להסיר את הפתרון של ההדמיה היטב עם פיפטה ולאחר מכן החלף עם עוד 200 µL של כיול פתרון. חזור על תהליך זה 4 פעמים כדי להבטיח פתרון מלא exchange.
    3. דגירה הכנת תמיסת כיול למשך 30 דקות לפני הדמיה. חזור על פרוטוקול הדמיה באמצעות אותם פרמטרים נקבע בשלבים 6.6-6.11, עם השינוי של רק 1 דקות של התמונה ללכוד.
       הערה: זלוף ומערכת נימים אין צורך בשלב זה, לא צריכה להיות מחוברת אל ההדמיה היטב כדי למנוע חשיפת הנימים אל nigericin.
    4. להוסיף 200 µL כיול iPBS (pH 9.0, nigericin 10 מיקרומטר) ההדמיה היטב עם פיפטה 200 µL. להסיר את הפתרון של ההדמיה היטב עם פיפטה ולאחר מכן החלף עם עוד 200 µL של כיול פתרון. חזור על תהליך זה 4 פעמים כדי להבטיח פתרון מלא exchange.
    5. דגירה לקראת בפתרון כיול השני 10 דקות לפני הדמיה. חזור על פרוטוקול הדמיה כמו שלב 6.13.3.
    6. סקירה של אוסף התמונות שנתפסו בתוכנת ניתוח תמונה כדי לוודא כי אין פיקסלים בכל אחד מהערוצים רוויים על ידי לחיצה על "רועי אומר" גלילה למרות של אוסף התמונות בעזרת המחוון "מסגרת" תוך כדי התבוננות שדיווח ערכים בהיסטוגרמה בעוצמה להגיע לזיהוי הערך המרבי. אם לכל המסגרות מכילות פיקסלים להגיע את העוצמה המקסימלית לזיהוי, להפחית את עוצמת תאורה או חשיפה ואת החזרה סעיף 6.
       הערה: לאחר הוקם ללא שינוי פרמטרים הדמיה בין ניסויים או כיול אלא אם נקודת הכיול כדי לשמש כהכנה כל (ראה שלב 8.3).
14. ניתוח של אוסף התמונות כדי להתוות פלורסנט בעוצמה ויחס קרינה פלואורסצנטית (ע/mCherry) כפונקציה של הזמן.
    1. לחץ על "רועי אומר" ובחרו בכלי צורה חופשית. להחזיק השמאלי כדי לעקוב אחר ~ 50 מיקרומטר לאורך של הר. קליק ימני כדי לסיים ציור רועי, ולאחר מכן לחזור באזור הסמוך MT להגדרת רקע ROI (איור 5A).
    2. לחץ על "עוצמת מרושע" תחת "מדידות". ליצור טבלה של ערכי העוצמה על-ידי לחיצה על "ייצוא > טבלת נתונים > יצירה."
    3. לחץ על סמל גלגל השיניים התצורה ובחר מבטל את כל הפרמטרים חוץ "זמן" ואת "מתכוון בעוצמה". באמצעות לחצן העכבר הימני על הכרטיסיה עבור טבלת הנתונים החדש שנוצר, בחר "שמירה בשם" ולאחר לייצא את הנתונים כקובץ csv.
       הערה: מדידות דומות יכולים להתבצע גם באמצעות תוכנות חינם כגון ImageJ.
    4. לפתוח טבלה גיליון אלקטרוני ולייבא את טבלת הנתונים על-ידי בחירה בכרטיסיה "נתונים" ואחריו "של טקסט".
    5. להשתמש בפונקציות בגיליון כדי להפחית את עוצמת רקע ע מ עוצמת האות ע בכל נקודה בזמן. חזור על תהליך זה עבור האות mCherry.
    6. העלילה כל עוצמת ערוץ כפונקציה של זמן על ידי בחירת העמודות המכילות את הזמן ואת מתוקן-רקע עוצמת נתונים ולאחר מכן לחיצה "הוסף > פיזור (תרשימים) > פיזור עם קווים ישרים" (איור 5B).
    7. להשתמש בפונקציות גיליון אלקטרוני לחישוב היחס פלורסצנטיות ע/mCherry בכל נקודה בזמן.
    8. מגרש יחס פלורסצנטיות כפונקציה של זמן על ידי בחירת העמודות המכילות את יחס וזמן נתונים ולאחר מכן לחיצה על "הוסף > פיזור (תרשימים) > פיזור עם קווים ישרים" (איור 5C).

7. כיול מלאה של pHerry ב Malpighian בקוריאנית Vivo לשעבר.

1. לנתח והר קבוצה חדשה של MTs הקדמי כפי שמתואר בסעיף 5.
2. חילופי iPBS עבור iPBS כיול (pH 7.4, nigericin 10 מיקרומטר) כפי שמתואר בשלב 6.13.2. תקופת דגירה של 30 דקות.
3. לאתר של MTs ולאסוף זוגות של תמונות ע/mCherry כמתואר בצעדים 6.1-6.11. החלף את הפתרון מלאי נוסף של כיול iPBS כפי שמתואר בשלב 6.13.4, המתן 10 דקות, ולאחר התמונה שוב. חזור על תהליך זה עד היחס ע/mCherry עם תמונה, כל הפתרונות. להשיג את ה-pH תמונות 9.0 להימשך כמו הדגימה והשיחזור לעיתים רחוקות pH גבוה.
4. זוממים פלורסצנטיות יחס של ע mCherry מ ולידציות ב 8 דגימות כפונקציה של pH שנכפה עליו_אני כפי שמתואר בשלב 6.14.9. להתאים את נתוני כיול עם עקומה בולצמן להשיג כיול מלא פונקציה על פי משוואה 1 (איור 5D). אם הנתונים אינם עקביים, מגרש כיול ערכות לכל דגימה מנורמל כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pH_i 7.0 ולנתח מחדש (איור 5E).
   הערה: אם התהליך האחרון הוא הכרחי ניסויים בודדים יהיה עליך משלהם ולידציות נקודה פנימית³³ (ראה כימות בהליך הבא (שלב 8.3)).
5. משוואה 1
   
   שבו R = יחס ע/mCherry,₁,₂, x_oוכן dx הם עקומת התאמה פרמטרים המייצגים יחס מינימלי פלורסצנטיות, יחס פלורסצנטיות המרבי, pKרוחב של הפונקציה בהתאמה. x_o = לכאורה pK של pHerry, אשר יכול להשתנות בין 7.1 ו- 7.4 בהתאם סוג התא והתנאים כיול מדויק.

8. כימות של חומצה Basolateral שחול מ לשעבר Vivo צנורית Malpighian Epithelia.

1. התמונה לבטא pHerry תאי stellate ומנהלת לבטא pHerry תאים בו זמנית.
   1. לנתח MTs הקדמי מחבצלת UAS-pHerry/capaR-GAL4 , כמתואר בסעיף 5, אבל לא להעביר MTs בינוני של שניידר ויבתר ההדמיה היטב.
   2. לנתח MTs הקדמי מחבצלת UAS-pHerry/c724-GAL4 בצלחת ויבתר אותם באמצעות ההליך המפורטים בסעיף 5.
   3. להעביר את 2 סטים של MTs הדמיה באותו טוב כמתואר בצעדים 5.8-5.11.
      הערה: כאשר גורף סמל MTs אל השקופית, למקם את MTs של UAS-pHerry/c724-GAL4 , את בקוריאנית UAS-pHerry/capaR-GAL4 אחד ליד השני כדי לבטא pHerry ועקרוני stellate התאים להיות visualized ב (זהה שדה איור 6A).
2. להחיל את NH₄prepulse לקלרנית כפי שמתואר בשלב 6.12.
   הערה: אם לא ניתן להשיג עקבי כיול (איור 4B), לבצע כיול של נקודות על-ידי הגדרת ה-pH_i 7.0 בסוף כל ניסוי עם כיול iPBS (pH 7.0, nigericin 10 מיקרומטר, דגירה 30 דקות) לאחר שהדבק זלוף-ובכן המפריד ואת הציוד זלוף הוסרו.
3. לכייל עקבות של תאי stellate ו העיקרי של חלקים שונים של MT (באמצעות היחס מוחלט או מנורמל בהתאם) עם 2 משוואת ולנתח את שלב ההתאוששות לאחר NH₄Cl נסיגה על-ידי החלת פונקציות דעיכה מעריכית באמצעות ניתוח סטטיסטי תוכנה, וציין את קבוע דעיכה (τ) (איור 6B).
   משוואה 2
   
   שבו R = יחס ע/mCherry,₁,₂, x_oוכן dx הם עקומת התאמה פרמטרים נקבע על ידי כיול בשלב 7.4 (משוואה 1).
   1. חישוב שיעור ההבלטה חומצה (J_{H +}, ראו משוואה 3) כפונקציה של pH_אני להביא בחשבון וריאציות של נח pH_אני וחומצה טעינה בין ההכנות³⁴. השתמש בפונקציות מעריכי נגזר בשלב 8.3 כדי לחשב את הנגזרת של pH_אני לגבי זמן בכל מרווח זמן.
      משוואה 3
      
   2. לחשב את קיבולת חציצה פנימי (β_i; משוואה 4) של ציטוזול-ה-pH_אני מנקודת ההתחלה של כל מרווח בשלב 8.3.1 בהתבסס על הספרות הקודם (ראה משוואת 4).
      הערה: דרוזופילה, אפיון מעמיק ביותר β_אני מגיע עצבים מוטוריים זחל מסופי³⁵ , נתונים אלה ניתן להניח להחזיק עבור תאים MT בהיעדר נתונים זמינים אחרים.
      משוואה 4
      
   3. לחשב את המוצר של β_T (מתוך שלב 8.3.2)_ו dpH_אני/dt (מתוך שלב 8.3.1) כדי לקבוע J_{H +} (משוואה 3).
      הערה: בתחום פתרונות נומינלית ביקרבונט-חופשית כמו אלה שתוארו ב פרוטוקול זה, ביקרבונט-derived אגירה קיבולת (β_b) ההנחה היא ~ מ מ 0. סה כ אגירה קיבולת (β_T) הוא הסכום של β_אני ו-_βb, ובכך β_{אני =} β_T בהיעדר HCO₃^–/CO₂³⁶.
   4. מגרש J_{H +} כפונקציה של ה-pH_אני בתחילתו של כל מרווח הזמן כמתואר בשלב 6.14.9.
   5. דעיכה מעריכית פונקציות חלות על החלק של כל datasets אשר חופפים ב pH_אני משתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי. להשוות בין המחירים של שינוי של הפונקציות וכתוצאה מכך להשוות מחירים ההבלטה חומצה בין התאים ואת מקטעי MT (איור 6C).
      הערה: הפונקציה המתאימה ביותר המשמש פריסטלטיות תמיד ייתכן יחיד מעריכית. . הרבה פונקציות אחרות אם הם משפרים מטיב ההתאמה.
   6. לחשב חומצה שטף (ראה משוואת 5) כפונקציה של pH_אני להביא בחשבון וריאציות תא בגודל ובצורה.
      משוואת 5
      
      הערה: תא מידות ניתן למדוד ישירות בתמונות או לקרב את ערכיהן. התאים העיקריים יכול להיות מיוצג כפי חצאי צינור חלול בעל הממדים הבאים: מיקרומטר הקוטר הפנימי 24; מיקרומטר הקוטר החיצוני 48; גובה 50 מיקרומטר. stellate תאי המעבר משתנה אבל יכול להיות מיוצג בערך כמו צילינדרים עם גבהים של 50 מיקרומטר, קטרים של 10 מיקרומטר. ראה הפיסקה האחרון של התוצאות נציג להלן.
   7. דעיכה מעריכית פונקציות חלות על החלק של כל datasets חופפים ב pH_אני משתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי. להשוות בין המחירים של שינוי של הפונקציות שנוצר כדי להשוות פלקסים חומצה בין התאים ואת מקטעי MT (6D איור).

תוצאות

רקמות בריאים וזיהוי נאותה של MTs הקדמי הכרחיים להצלחה של פרוטוקול זה. במהלך ניתוח, כדאי לשים לב למגע לא ישיר של MTs, לטפל רק אותם על ידי השופכן כמו מרתק של MTs ישירות יוביל שבירה (איור 4A– B). כאשר MTs נסחפים השטוח אותן לשקופית, בקוריאנית חייב להי?...

Discussion

ההצלחה של כימות של pH_אני ב- MTs דרוזופילה תלויה לגמרי הבריאות של MTs שחולצו ואיכות הרכבה, דיסקציה (איור A – C). לכן, טיפול זהיר של רקמות כמו שמתואר הכרחי. שקופיות טרי מצופה PLL באופן משמעותי סיוע MT הרכבה כפי שהם נוטים להיות דבק הרבה יותר מאשר שקופיות אשר נחשפו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.