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要約

細胞のイオン輸送は細胞内 pH モニタリングによってしばしば評価される(pH私)。遺伝子 Encoded pH 指示薬(GEpHIs)は、そのまま細胞内 pH の光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞前のヴィヴォライブ イメージング pHerry とキイロショウジョウバエのマルピギー氏管の細胞内 pH の定量化の詳細については、擬似レシオ メトリック遺伝子にエンコードされた pH インジケーター。

要約

上皮膜イオン輸送は本質的な細胞の電気化学勾配の維持と同様、全身のイオンの恒常性に不可欠です。多くのイオン輸送体 (pH私) 細胞内 pH の影響を受けて、トランスポーター活性を評価するための便利なツールは、このように pH は私を監視します。モダンな遺伝子にエンコードされた pH-指標 (GEpHIs) は細胞および細胞内の規模で pH私そのままなセルの光学的定量化を提供します。このプロトコルは細胞 pH私の規制のキイロショウジョウバエのマルピギー氏管 (MTs) で前のヴィヴォライブ イメージングによる pHerry、pKで擬似レシオ メトリック GEpHI リアルタイム定量化をについて説明します、細胞質の pH 変化を追跡に適しています。抽出された大人のフライ MTs は単一細胞層上皮の形態学的、機能的に独立したセクションで構成され、上皮の輸送の調査のためのアクセス可能で、遺伝的に扱いやすいモデルとして利用できます。GEpHIs は、従来の pH に敏感な蛍光染料とイオン選択性電極上のいくつかの利点を提供しています。GEpHIs 適切な促進者の要素が使用異なる細胞集団にラベルを付けることができます。この方、前のヴィヴォ体内、および本質的に不均一であるその場で準備に便利です。GEpHIs もそのままティッシュで繰り返される色素の治療や組織の外部化を必要とせず時間をかけて pHiの定量化を許可します。現在の GEpHIs の主な欠点は、組織の損傷の応答のゾル性細胞質包有物の集約し、過剰発現を構築する傾向です。抽出されたフライ MTs の機能的に異なるプリンシパルと星状細胞に基底プロトン (H+) 輸送の評価を通じて、この議定書では、これらの欠点、彼らのソリューション、および GEpHIs の固有の利点を示した。技術と説明する分析が容易に適応できる幅広い脊椎動物と無脊椎動物の準備と特定のトランスポーターを介してイオン流束の複雑な測定の演習を教えるからアッセイの洗練されたことができます。

概要

このプロトコルの目的は、遺伝子にコードされた pH インジケーター (GEpHI) を用いた細胞内 pH (pHi) の定量化と基底モデル昆虫 (+ H+輸送を評価するためのこのメソッドの使用方法を示すキイロショウジョウバエ) 腎構造のマルピギー氏管 (MT)。MTs は、ショウジョウバエの排泄器官として、いくつかのキーの点1に哺乳類のネフロンに機能的に似ています。MTs は、胸郭、ハエの腹部の (前部と後部) の尿細管の 2 組として配置されます。各 MT の単一細胞上皮管が根尖を明確なの代謝活性の主細胞から成る (内腔) 介在の星状細胞と同様、基底 (hemocoel) 極性と。発達個別のセグメント、特に初期拡張尿管2に結合分泌の主要なセグメント、経過セグメントは、セグメントおよび形態学的、機能的には、3 前方 MTs が構成されます。携帯電話のスケールで内腔の上皮細胞のイオン輸送、頂端膜 V-atpase3アルカリ金属/H+交換と基底 Na+K+で実現-atp アーゼの4、チャンネル5、Na+は、内向き整流性 K+ -Cl−/HCO3−交換 (NDAE1)6、および Na+K+を駆動-2 Cl−共輸送 (NKCC;Ncc69)7、星状細胞仲介 Cl- 、水輸送8,9。この複雑なアクセス可能な生理学的システムは、ショウジョウバエの遺伝学的および行動の多様なツールセットと組み合わせた場合の内因性イオン伝導機構の調査のための優秀な機会を提供します。

このプロトコルのための理論的根拠は動作し、他のモデルのシステム ツールのエクスポートの統合セルからの潜在性の上皮膜イオン輸送を研究するため遺伝子組み換え可鍛性システムを記述します。PHerry10の式、グリーンの pH に敏感な超黄道 pHluorin11,12 (セフ) と赤の pH に依存しない mCherry13MTs での融合から派生した GEpHI を許可の H+輸送の定量化高 K+/nigericin 校正テクニック14を介して単一の mt 野細胞。多くのイオン輸送体は、H+同等を移動、細胞内 pH は私の定量化はさまざまなトランスポーターを介してイオン移動の関数表現として機能します。ショウジョウバエMT モデル システムはまた組織特異遺伝子15と細胞イメージング全体オルガン試金17と組み合わせて使用することができますが、RNA 干渉 (RNAi)16式の強力な遺伝的ツールを提供しています,18,分子から行動への垂直統合の堅牢なツールセットを作成する尿細管機能の19 。これは対照的に他の多くのプロトコルに歴史的にそのような測定が複雑に依存している、上皮の生物学の評価とマイクロ郭清、洗練されたイオン選択性電極20,21, を大変なの略します。高価な pH 感受性色素を22制限荷重要件と異種組織の細胞特異性悪い。GEpHIs は、広く pH私携帯型23の様々 な測定に使用されています。初期の作品は固有 pH 感受性の緑色蛍光タンパク質 (GFP) pH私培養上皮細胞24を監視するを悪用されるが、過去 20 年を見た使用ニューロンで25、グリア26、菌類27 GEpHIs、植物細胞28。GAL4/UA 式システム15とショウジョウバエMT の生理ユーザー補助の遺伝的構造の細胞ターゲットの可能性の組み合わせはこの pHの調査のための理想的な準備をする私規制と上皮膜イオン輸送。

pH私規制は何十年も研究されている、生活に不可欠です。MT の準備では、pH私の調節の生理学を教えるが、また実行する堅牢なモデル洗練された pHi規制前のヴィヴォとin vivoの調査を提供しています。このプロトコルはショウジョウバエNH4Cl パルス酸法21の読み込みを使用して MT の上皮細胞の基底膜で H+運動の定量化をについて説明しますが、pH 指示薬としては遺伝子エンコードすると、任意の影響を受けやすい遺伝子導入とライブ イメージングの準備にこれらのメソッドとその理論的枠組みを適用できます。

プロトコル

このプロトコルのすべてのステップはメイヨー クリニック (ロチェスター、ミネソタ) の動物の使用に関するガイドラインを遵守します。

1. 飼育をフライします。

  1. 昇給が飛んできて、標準飼育29によると交差するセット。
    注: GAL4/UAS システムによって蛍光レポーター式は温度に比例して、発現レベルを変更するため飼育温度を調整できます。この状態は、pHerry10などコンストラクトの赤色けい光たんぱく質 (RFP) 融合する GFP を使用も増加のゾル性細胞質と核の集計に関連付けられても高発現レベルは、しばしばより良い信号対雑音比につながる 30,31。実行することによって定量化はまだ可能な集約を避けられない場合 pH私7.0 に対応する蛍光比 1.0 のような各実験と正規化データの校正をポイント (ステップ 7.4 を参照してください以下のキャリブレーションに関する注意)。
  2. ホモUA pHerry10処女女性とホモc724 GAL4ホモ画像を許可するUA pHerry処女女性2男性ホモcapaR GAL432男性の交差に設定します。pH私主細胞と、MT の星状細胞のそれぞれ。食品の 28 ° C でチームメイトに残す新鮮なバイアルに 3 GAL4 男性と UA pHerry 女性 6 名を配置します。
    注: 幼虫は 4 d 以内に明らかにする必要があります、10 日目の周り eclose を大人が始まります。
  3. 羽化時にメスの成虫を収集し、脇に 28 ° C で 10 d の時代へ
    注: 実験のタイミングは、生きている細胞内の pH イメージングに関連付けられる (ラムゼイ分泌の試金17,19) などの任意の制限行動アッセイに対応する調整することができます。男性のハエを使用できますが、女性から尿細管より大きくより強力です。

2. ポリ L リジン スライドの準備。

  1. 標準 75 × 25 mm スライドの上のまわりの疎水性 PAP ペンで 40 × 20 mm の境界線を描画して、乾燥した使用大きい coverslips で 15 分スライドはイメージング光学系と互換性がない場合におきます。
  2. 各スライドに 0.01% ポリ L リジン (PLL) の原液 2 mL を転送し、室温 1 時間脇
  3. ピペットと過剰な PLL を削除します。将来使用するため 50 mL コニカル バイアルでソリューションを保存します。4 ° C でのストア
  4. 真空ラインに残った溶液を吸引します。スライドにソリューションが残っていないことを確認するスライド全体の表面に真空ラインを実行します。
  5. 使用する前に RT でさらに 1 時間のためにスライドを設定します。標準スライド本で 1 ヶ月常温乾燥のスライドを保存します。

3. 解剖皿とガラス棒の準備

  1. エラストマー、奥行きの 5 mm ミックス使い捨てピペット チップとを生成する RT でシャーレ 35 x 10 mm ポリスチレンで基本の 4.5 mL にエラストマー硬化剤 0.5 mL を追加します。O/N 室温を治すためにエラストマーを許可します。
    注: エラストマーは、はっきりと泡の無料する必要があります。バブルの清算はこと注入後 10-15 分のための真空瓶にエラストマー板を保つことによって促進されます。
  2. 手の間 5 mm 径のガラス棒を押しながら離れての両端を引っ張りながら点灯ブンゼン バーナーでロッドの中心を溶かします。ガラスと溶ける引いてすぐに薄い (0.1 mm) とテーパー シャフト (図 1) を生産します。
    注: シャンクに 45 ° の角度の尿細管の処理に便利です。これはシャンクを引く (図 1を参照)、1 つの手を下げることによって達成することができます。
  3. 炭素鋼片刃かみそりの刃の鈍側と真ん中に薄いシャフトを破る。休憩がきれいなことを確認に切り裂くスコープ下ロッドの薄い端を検査します。

figure-protocol-2324
図 1: キイロショウジョウバエマルピギー管を処理するためガラス棒を製造します。
A ~ E。冷暖房山地矢印を処理に適したテーパーを生産し、角度にガラス棒を引いてのプロセスは適用される力の方向と大きさを示します。F. 適切に加工ガラス ツールの写真。スケール バー = 10 mmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

4. ソリューションおよび灌流システムの準備

注: 灌流システムは、メーカーによって異なります。このプロトコルは、入力フロー率調整器と真空駆動の流出がここで説明されているように MTs を任意の灌流システムで動作するように合わせることができる取付方法重力供給 8 チャンネル オープン タンクに基づいています。

  1. 以下のソリューションを準備します。
    1. 因数のシュナイダーの媒体 (50 mL コニカル バイアルに 40 mL) と 4 ° C でストア
    2. ソリューションを準備 (すなわち昆虫 Phosphate-Buffered 生理食塩水 (iPBS) および NH4Cl iPBS) 常温、表 1に基づいて、必要に応じて)。実験の日に使用する前に RT に暖かいソリューション。
      注: iPBS と iPBS 40 mM NH4Cl を大量 (1 L 以上) の準備、4 ° C で保存
    3. PH で 500 mL の容積 8 の校正ソリューションを準備表 1と 4 ° C でストアに示されているように、5.0、6.0、6.5、7.0、7.3、7.6、8.0 および 9.0 を =N-メチル-D-glucamine (NMDG) と塩酸を滴定法による各溶液の pH を調整します。
    4. 実験の日、RT に校正ソリューションの 5 mL 因数を暖かく、10 μ M の最終濃度を生成するストック nigericin ソリューション (ジメチルスルホキシド (DMSO) 20 mM) を追加します。
      注意: は、手袋で nigericin を処理します。使い捨てとして nigericin と接触するすべての機器を扱います。Nigericin は、機器が再利用される場合、生物学的製剤を妥協は、ガラスとプラスチックに残ります。
  2. 灌流システム:
    1. プライム ddH2O すべて貯水池 (図 2) を記入することによって灌流システム。フロー速度レギュレータを埋めるために近位のすべての行を許可する時に 1 つのチャネルを開きます。
      注: 場合によっては、失速のチャネルを開き、貯水池からドライブ流れにプランジャーを使用してライン内の空気をオフにする必要があります。
    2. 2 チャンネルを開き、ddH2O を排出するを許可します。貯水池は空に近いが、リザーバー、最初 iPBS と NH4Cl パルス iPBS 2 番目の貯水池。最大流量レート制御と流量を設定し、遠行を 1 分間流する各ソリューションを許可する (図 2) の流れを停止します。
    3. イメージング顕微鏡ステージに「救いの手」クランプをはんだ付けの 2 番目の位置を設定します。イメージング プラットフォームの各側に 1 つのクランプを配置します。
    4. 慎重に熱毛細管ガラスの部分の遠位 0.5 インチ (内径 1.5 mm、外径 0.86 mm、長さ 100 mm) ブンゼン バーナーの上。45 ° ベンドを作成するには、重力によって曲げに遠位端ができ、目的の角度が達成されれば、炎からガラスを削除します。毛細管ガラスの 2 番目の部分と、このプロセスを繰り返します。
    5. それぞれの流れと真空接続流出線曲がったガラス管を挿入し、「救いの手」でそれらをマウント (図 3) 顕微鏡のイメージングの段階でそれらを整列します。

figure-protocol-4613
図 2: 灌流システムと構成をイメージングします。
同時を介して MT 基底トランスポート機能の生理学的評価のために必要なコンポーネントは、蛍光イメージングかつ迅速なソリューションの交換を住んでいます。示されているガス行は省略可能で、HCO3-輸送の評価実験の拡張を許可します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-protocol-5068
図 3: NH4Cl パルス灌流装置のフロー図の実験します。
矢印には、フロー パス、バルブ切り替えポイントが描かれています。ソリューションは、貯水池から標本に重力流による移動し、真空吸引による廃棄物のフラスコに試料室から描画します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

5. 大人のショウジョウバエ前方のマルピギー氏管の解剖。

  1. 解剖皿を収集セクション 3 からガラス棒、セクション 2 から PLL コート スライド、接着剤の灌流も分配器、真空グリース、フィルム シールの 4 x 2"ストリップを引っ張って、#5 の 2 ペア微細鉗子と冷たいシュナイダーの中の RT iPBS 40 mL 因数と。
  2. シーリング テープの真空グリースを普及し、油でコートの下にテープに接着剤灌流もディバイダーを押します。接着剤の灌流もディバイダーをはがし、グリース側ダウン PLL コート スライド上に配置。個々 の標本井戸疎水性グリースのトレースを残して血流よく仕切りを削除します。
  3. 場所 200 μ L グリース包囲で RT iPBS の PLL コート スライドと株分け業の下でスライドを移動します。
  4. 空飛ぶ場所UA pHerry/capaR GAL4ハエはバイアルし、10 分間氷の上それらの麻酔。
    メモ: この CO2とは異なり、麻酔の方法は、ハエはステータス退避を行いませんことを確認します。
  5. 解離性の皿に冷たいシュナイダーの媒体を注ぎし、解離万国実体写真下皿に 1 つの麻酔をかけられた女性フライを転送する微細鉗子を使用します。
  6. 鉗子のセットを持つ胸部で、フライを保持し、他を使用してやさしく腹部の後部をグリップします。要するに、鉗子を使用してフライ、意図的な運動の後方に引いて開きます。腸が目に見えると、遠位端をつかんで、基になる tracheoles から離れてを繰り返し、簡単なタグボートの体腸を引いて腸と MTs を無料.
    注: 前部と後部の MTs 表示されます中腸と後腸、尿管を通してのジャンクションを満たす彼ら。彼らは腸を取り囲むように後方の細管をする自由意志の可能性が高いに MTs の最初のペア。これらをすることができます (図 4 a) を無視します。
  7. MTs の 2 番目のセットが腹部の無料微細鉗子で尿管の前方の MTs をオフにピンチします。これは腸から前方の MTs を分離し、尿管を閉じます。
  8. 細管はどちら側に落ちるように尿管の下でロッドをスライドで引っ張られたガラス棒で無料前方 MTs を拾います。ソリューションからまっすぐに MTs を持ち上げます。
  9. MTs および尿管ロッドの裏側に付着した、まっすぐスライドに尿管を下げるようにガラス棒をオンにします。尿管を貼付し、(図 4 b) スライド ガラスに尿管を押し込んで、MTs の遠位端をシールします。必要以上の MTs を操作できません。MTs は、スライドに固定する尿管とソリューションで浮上する必要があります。
  10. 軽くスライド表面で各々 の細管を掃引するのにガラス棒の良い終わりを使用します。管を粉砕避けるために、尿細管は、近位、PLL コート スライド (図 4) の表面に各管の全長をアタッチするに遠位に移動の上にロッドをスライド スライドに対してロッドを引き締めます。
  11. スライド マウントされている尿細管にも液体で満たされた小を形成するために接着剤の灌流も分配器を配置します。
  12. 顕微鏡ステージ上の試料を配置します。流入を置き、それぞれ入口と出口開口も、血流の毛細血管を流出します。
    注: オープン灌流チャンバーが必要な場合も仕切りが左できます。この場合も画像処理の反対側に管の流入、流出を配置できます。

6. イメージング プロトコルと尿細管健康の検証

メモ: このプロトコルは GFP (セフ) と RFP (mCherry) フィルター セット逆広視野 epifluorescent 顕微鏡で実行されます (470/40 nm 励起 (ex)、515 nm longpass 放出 (em)、ex、500 nm の二色性と 546/10 nm、590 nm longpass em、565 nm 二色性)、10 X/0.45 空気目的、ライブ イメージ キャプチャ、およびイメージ投射ソフトウェア単色カメラ。プロトコルは任意の直立に適応することができますか、または倒立顕微鏡を GFP と RFP 光学系と画像集録ソフトウェア、切り替える自動フィルターで最適な露出時間、光の強さとビニング パラメーター異なります。すべての分析、蛍光強度は、後の投資収益率を使用して各チャネルの背景差分が含まれていない蛍光信号の投資収益率に隣接する利益率 (ROI) の地域の平均のピクセルの輝度を分析して必要があります。

  1. 顕微鏡、光源とイメージング システムを入れます。
  2. 開くには、イメージング ソフトウェアが関連付けられています。
  3. 接眼レンズに目を通すし、MT のルーメンが透過光の下で明確に表示されるまで、手動でフォーカスを調整します。
  4. 画像解析ソフトで取得する」タブをクリックし、「アクイジション ・ モード」セクションで「ビン」プルダウン ・ メニューで「2 x 2」を選択します。
  5. 照明光を減らすし、退色を最小限に抑えるために光路に 5% 中性密度フィルターを挿入します。
  6. 「チャンネル」メニューで GFP (セフ) チャンネルのカメラを介して蛍光信号を観察する「ライブ」をクリックします。
  7. 輝度ヒストグラムの最も明るいピクセル値が最大値の約 40% をされるよう、露光時間を設定する「時間」スライダーを調整し照明を停止するには、"停止"をクリックしますします。
  8. RFP (mCherry) の手順 6.6 6.7 チャネルし、前歯の MT の拡張の最初のセグメントの存在を確認し、ゾル性細胞質 mCherry の不在を集計 (組織の損傷や過剰発現を示すもの) を繰り返します (図 4)。
    注: 拡張セグメントは、尿細管の最も近位のセグメントは、このセグメントの内部ルーメンの直径は 〜 20 μ m 以上隣接する遷移セグメントの明らかでなければなりません。2 x 2 ピクセルビニング通常で十分ですが、必要な照度をさらに減らすために増やすことができます。典型的な露光時間は 150 & 800 ms/チャンネルの間です。退色を最小限に抑えるため可能な限り小さな光として使用します。退色を最小限に抑えることは、2 つの同時ことができます漂白しない独立して、したがって任意の比校正を無効としてデュアル fluorophore 指標 pHerry などの使用に不可欠です。
  9. 「時系列」チェック ボックスをクリックしてタイムラプス イメージング プロトコル有効にします。
  10. 期間を調整」「10 分に、"間隔"スライダー"時系列"セクションのプルダウン メニューで 0 に最大画像集録レートと全体的なキャプチャ時間を設定します。0.2 Hz の合計レート通常十分です。
  11. GFP (セフ) と「チャンネル」セクションに RFP (mCherry)] の両方をチェックしてください。
  12. 適切なバルブ コント ローラーをアクティブにして灌流システムの iPBS 行を開き、「実験を開始」をクリックして画像プロトコルを開始1 分後、NH420 Cl パルス ソリューションに切り替える適切なバルブを開閉、iPBS ラインの s によって NH4Cl ラインを終了および再開 iPBS バルブ iPBS に戻る。灌流システムを停止する前に完了する完全なイメージング プロトコルを許可します。
    注: 時系列解析、安定した mCherry と NH4Cl の存在下で増加、ウォッシュに消光し徐々 に回復セフ信号が表示されます。
  13. 2 点校正を実行します。
    1. 基になるスライドから剥離しても分配器、よくイメージングから灌流毛細血管とクランプを取り外します。
    2. 200 μ L ピペットとイメージングに 200 μ L 校正 iPBS (pH 7.4 では、10 μ M nigericin) を適用します。ピペット、イメージングからソリューションを削除し、校正溶液 200 μ L 別に置き換えます。完全なソリューションの交換のため 4 回この手順を繰り返します。
    3. イメージングの前に 30 分の校正ソリューションの準備を孵化させなさい。6.6 6.11 の手順で同じパラメーターを使用してイメージング プロトコルを繰り返し、イメージのわずか 1 分の変更をキャプチャします。
      注: 灌流システムと毛細血管はこの手順で不要し、イメージングに接続されていない必要があります nigericin に毛細血管をさらすことを避けるためにも。
    4. 200 μ L ピペットとイメージングに 200 μ L 校正 iPBS (pH 9.0、10 μ M nigericin) を追加します。ピペット、イメージングからソリューションを削除し、校正溶液 200 μ L 別に置き換えます。完全なソリューションの交換のため 4 回この手順を繰り返します。
    5. イメージングの前に 10 分第 2 校正ソリューションの準備を孵化させなさい。6.13.3 のステップのように撮像プロトコルを繰り返します。
    6. 「投資収益率を意味する」をクリックしてスクロールが輝度のヒストグラムの値は報告されませんを観察しながら「フレーム」スライダーで画像のスタックによっていずれかチャンネル ピクセルが飽和してないいることを確認する画像解析ソフトウェアでキャプチャした画像スタックを確認最大検出値に達する。すべてのフレームは、最大検出可能な強度に達するピクセルを含む場合、露出時間や照射強度と繰り返しセクション 6 を減らします。
      注:ポイント校正が各準備で使用される、実験や校正間撮像パラメーターを変更しないことを確立される (手順 8.3 を参照してください)。
  14. 蛍光強度や蛍光比 (セフ/mCherry) を時間の関数としてプロットする画像のスタックを分析します。
    1. 「投資収益率を意味する」をクリックし、パス変形ツールを選択します。山の ~ 50 μ m 長さをトレースする左クリックを押したままROI の描画を完了するを右クリックし、投資収益率 (図 5 a) 背景を定義する MT に隣接地に繰り返します。
    2. 「測定」の下で「平均強度」をクリックします。クリックして強度の値の表を作成「エクスポート > データ テーブル > 作成します。」
    3. 構成の歯車アイコンをクリックし、「時間」と「強度を意味します」を除くすべてのパラメーターの選択を解除新しく作成したデータ テーブルのタブを右クリックし、「名前を付けて保存」を選択、データを .csv ファイルとしてエクスポートします。
      注: 同様の測定が可能 ImageJ などの無料のソフトウェアを使用しています。
    4. スプレッドシートのテーブルを開き、"From Text"に続いて「データ」タブを選択してデータ テーブルをインポートします。
    5. スプレッドシートの機能を使用して、各時点でセフ信号強度からセフ バック グラウンド強度を減算します。MCherry 信号にこのプロセスを繰り返します。
    6. 時間とバック グラウンド補正強度データと、クリックを含む列を選択することによって時間の関数として各チャネルの強度をプロット「挿入 > 散布図 (グラフ) > 直線付き散布図」(図 5 b)。
    7. 各時点でセフ/mCherry 蛍光比を計算するのにスプレッドシート関数を使用します。
    8. 時間と比のデータと、クリックを含む列を選択することによって時間の関数としてプロット蛍光比「挿入 > 散布図 (グラフ) > 直線付き散布図」(図 5).

7. キイロショウジョウバエマルピギー管Ex Vivoで pHerry の校正。

  1. 解剖、セクション 5 で説明されているように前方の MTs の新鮮なセットをマウントします。
  2. 6.13.2 の手順で説明するように校正 iPBS (pH 7.4 では、10 μ M nigericin) の iPBS を交換します。30 分間インキュベートします。
  3. MTs を見つける手順 6.1 6.11 でセフ/mCherry 画像のペアを収集しています。校正 iPBS 6.13.4 の手順で説明するよう 10 分を待ってから、もう一度画像の別の在庫とソリューションを交換してください。セフ/mCherry 比は、すべてのソリューションでイメージされているまで、このプロセスを繰り返します。PH 9.0 イメージを取得する最後の標本はほとんど高い pH から回復するようです。
  4. セフの蛍光比 mCherry に 8 標本の校正から関数としてプロット課された pH は私の 6.14.9 のステップで説明したよう。ボルツマン曲線方程式 1 (図 5) によると完全なキャリブレーション関数を取得するとキャリブレーション データに合います。データの整合性がない場合 pHi 7.0 に対応する蛍光比 1.0 のような正規化検体からキャリブレーション セットをプロットし、(図 5 e) を再分析します。
    注意: 後者のプロセスが必要な場合個々 の実験必要があります独自の内部ポイント校正33 (定量化手順 (手順 8.3) を参照してください)。
  5. 式 1
    figure-protocol-11937
    R = セフ/mCherry 比と1、2 xo、およびdx継ぎ手パラメーター最小蛍光比、最大蛍光比、pKと幅を表す関数の曲線は、それぞれ。xo = 見かけ上 pK、 pHerry、7.1 と 7.4 細胞型と正確な校正条件に応じて変えることができるのです。

8. Ex Vivoマルピギー氏管上皮から基底酸押出の定量化。

  1. 同時に細胞画像 pHerry を表現する星状細胞と pHerry を表現するプリンシパル。
    1. 、5 章で説明したようにUA pHerry/capaR GAL4飛ぶから前方の MTs を解剖がよくイメージングへ解離シュナイダーの中から MTs は転送しないでください。
    2. セクション 5 に記載されている手順を使用して同じ解剖皿のUA pHerry/c724 GAL4飛ぶから前方の MTs を分析します。
    3. 5.8 5.11 の手順の説明に従っても同じ画像に MTs の 2 セットを転送します。
      注: スライドまで MTs の腕の中を掃くとき配置UAS pHerry/c724 GAL4と互いに近くUA pHerry/capaR GAL4細管の MTs pHerry 発現のプリンシパルと星状細胞は同じフィールド (視覚化できますので図 6A)。
  2. NH4Cl プレパルス 6.12 の手順で説明されているように適用します。
    注: 一貫性のあるキャリブレーション (図 4 b) を達成できなかった、接着後校正 iPBS (pH 7.0, 10 μ M nigericin 30 分インキュベーション) の各実験の終わりに 7.0 に pHiに設定点校正を実行します。灌流もディバイダーおよび灌流装置が削除されました。
  3. 方程式 2 (必要に応じて絶対または標準化された比率を使用して) さまざまな MT の星状とプリンシパルのセルからのトレースを調整し、指数関数的減衰機能を使用を適用して NH4Cl 撤退後回復フェーズの分析統計解析ソフトウェアと減衰定数 (τ) (図 6 b) に注意します。
    方程式 2
    figure-protocol-13285
    R = セフ/mCherry 比と1、2 xo、およびdx校正手順 7.4 (式 1) によって決定された継ぎ手パラメーター曲線は。
    1. PH私私の pH と酸製剤34間の読み込みを安静時のバリエーションの関数として酸押出率 (H +J は、方程式 3を参照) を計算します。PH私時間に関して各時間間隔での微分を計算するのに手順 8.3 で派生した指数関数を使用します。
      式 3
      figure-protocol-13727
    2. (Βi; 組み込みバッファー容量を計算します。式 4)細胞質の pH の 8.3.1 の手順で各間隔の開始から私は以前文献に基づいて (方程式 4参照)。
      注:ショウジョウバエβ は私の最も完全な特性から来る幼虫モーター神経ターミナル35と mt 野細胞がない場合は他の利用可能なデータを保持するためにこれらのデータが想定される場合します。
      方程式 4
      figure-protocol-14108
    3. JH + (式 3) を決定する β (ステップ 8.3.2) からT と dpH私/dt (ステップ 8.3.1) からの積を計算します。
      メモ: このプロトコルで説明したよう、名目上炭酸無料ソリューションで炭酸由来の緩衝能力 (βb) は仮定する 〜 0 mM。私β とβb、およびこうして β の合計ですバッファキャパシティ (βT)私 = HCO3-/CO236の不在で βT 。
    4. 6.14.9 のステップで説明したように各時間間隔の初めに pH は私の関数として JH +をプロットします。
    5. 指数関数的減衰関数を pH私統計解析ソフトウェアを使用して重複するすべてのデータセットの部分に適用されます。セルと MT セグメント (図 6) の間の酸押出率を比較する結果の機能の変更の率を比較します。
      注意: カーブ フィットに使用する最も適切な関数可能性がありますいない常に単一指数。彼らはフィット感の良さを向上させるなら、他の機能を置き換えることができます。
    6. 酸を計算 (式 5参照) をフラックス pH私セル サイズと形状の変化を考慮しての機能として。
      式 5
      figure-protocol-15030
      注: セルの大きさが画像で直接測定したり近似。主細胞は次の次元を持つ中空管の半分として表現できる: 内径 24 μ m;外径 48 μ m;高さ 50 μ m 移行星状細胞は変数が、約 50 μ m の高さと 10 μ m の直径の円筒で表すことができます。以下の代表の結果の最後の段落を参照してください。
    7. 指数関数的減衰関数を pH私統計解析ソフトウェアを使用して重複するすべてのデータセットの部分に適用されます。細胞と MT セグメント (図 6) と酸系フラックスを比較する結果の機能の変更の率を比較します。

結果

健康な組織や前方の MTs を適切に識別、このプロトコルの成功に不可欠です。解剖時に注意が必要なく、直接タッチする MTs とだけハンドルに直接 MTs をグリップとして尿管によってそれらは (図 4 a- B) の破損に 。MTs はスライドにフラットを掃引、細管を可能な限り少し触れられなければならないし、これを回避余分な?...

ディスカッション

ショウジョウバエMTs で pH は私の定量化の成功は健康抽出された MTs と取り付けと郭清 (図 A - C) の質によってまったく異なります。したがって、組織としての慎重な取り扱いは説明が不可欠です。新鮮な PLL でコーティング スライド大幅にソリューションにさらされて以前のスライド援助 MT マウントよりもはるかに多くの接着剤をする傾...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

MFR. AJR を DK100227 は、T32 DK007013 によって支えられ、この仕事は、NIH の DK092408 によって支えられました。著者は、CapaR GAL4 と c724 GAL4 博士ジュリアン A.T. ダウを感謝したいショウジョウバエ株。我々 はまた実験飛ぶ十字架を維持支援のためヤコブ B のアンダーソン氏を感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly-L-Lysine (PLL) SolutionSigma-AldrichP4832Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium SaltSigma-AldrichN7143CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mmSigma-AldrichGBL622105Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitEllsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGAvailable from multiple vendors.
Helping Hands Soldering StandsHarbor Freight Tools60501Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and ReserviorsBioscience ToolsPS-8SAny comparable perfusion system can be used.
Flow RegulatorWarner Instruments64-0221Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's MediumFisher Scientific21720024Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel ForcepsFine Science Tools11252-20Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dishCorning Life SciencesFisher Scientific 08-757-100AExact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope SlidesCorning Life Sciences2949-75X25Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mmWarner Instruments64-0796Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"Fisher Scientific14-171-129Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone GreaseSigma-AldrichZ273554Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control ClampFisher Scientific05-869Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameterdelphiglass.com9198Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic PenSigma-AldrichZ377821Available from multiple vendors.
Sealing FilmSigma-AldrichP7668Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tubeBD Falcon352096Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tubeBD Falcon352070Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acidSigma-AldrichH3375Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrateSigma-Aldrich69892Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acidSigma-AldrichT5130Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air ObjectiveZeiss000000-1063-139Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting StereoscopeZeissDiscovery.V8Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogasterAvailable from Romero LabFirst published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogasterAvailable from Romero LabFirst published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogasterAvailable from Romero LabFirst published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital CameraZeissAxiocam 506 monoExact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroicChromaCZ909Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroicChromaCZ915Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent MicroscopeZeissAxio Observer Z.1Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis SoftwareMicrocalOrigin 6.0Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis SoftwareNational Institutes of HealthImageJ 1.50iAny software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition SoftwareZeissZen 1.1.2.0Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor BladeElectron Microscopy Sciences71960Available from multiple vendors.
Microscopy Slide FolderFisher Scientific16-04Available from multiple vendors.
Bunsen BurnerFisher Scientific50-110-1231Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with FlugsGenesee Scientific32-109BFComparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice BucketFisher Scientific07-210-129Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamineSigma-AldrichM2004Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tipsMidSciAV200Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipetteGilson IncorporatedPIPETMAN P200Available from multiple vendors.

参考文献

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

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