איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

Summary

הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.

Abstract

תגובת הנזק לדנ"א מנצלת את תיקון נגעי הדנ"א המתרחשים באופן ספונטני, נגרמת על ידי לחץ גנוטוקסי, או מופיעים בהקשר של הפסקות DNA מתוכנות בלימפוציטים. הטכנולוגיות של קינאז מוטאקס (ATM-ATM) ו- Ataxia-Telangiectasia מוטציות (ATM), ATM ו- Rad3-Related קינאז (ATR) ומקטע קטליטי של פרוטאין קינאז (DNA-PKcs) תלויי DNA, הם בין הראשונים המופעלים על גבי אינדוקציה של נזק ל- DNA, והם רגולטורים מרכזיים של רשת השולטת בתיקון דנ"א, אפופטוזיס והישרדות תאים. במסגרת מסלול מדכא גידול, כספומט ו- ATR מפעילים את p53 דרך זרחון, ובכך מסדירים את הפעילות התעתיקית של p53. נזקי דנ"א גורמים גם להיווצרות של מוקדי קרינה מייננת (IRIF) המייצגים קומפלקסים של חיישן נזקי דנ"א וחלבוני תיקון המצטברים באתרים של נזק ל- DNA, אשר מדמיינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיתוף לוקליזציה של חלבונים ב- IRIFs, לעומת זאת, לא בהכרח אומר dאינטראקציה חלבונים אינטראקציה חלבון, כמו ברזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוגבל.

באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) היא טכניקה חדשה המאפשרת הדמיה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים בתאים ורקמות עם סגוליות ורגישות חסרות תקדים. טכניקה זו מבוססת על הקרבה המרחבית של נוגדנים ספציפיים המחייבים את החלבונים המעניינים. כאשר החלבונים הנחקרים הם בתוך ~ 40 ננומטר תגובת הגברה מופעלת על ידי oligonucleotides כי הם מצומדות לנוגדנים, ואת המוצר הגברה הוא דמיינו על ידי תיוג פלורסנט, מניב אות המתאים למיקום subcellular של חלבונים אינטראקציה. באמצעות אינטראקציה תפקודית הוקמה בין כספומט p53 כדוגמה, הוא הוכיח כאן כיצד PLA ניתן להשתמש בתרבויות תא ההשעיה כדי לחקור את האינטראקציות הישירות בין חלבונים שהם חלקים בלתי נפרד של התגובה נזק DNA.

Introduction

נזק ל- DNA גורם לסדרת אירועים מבוקרת ביותר, הקשורים לאינטראקציות בין חלבונים לחלבון ולשינויים שלאחר טרנסלוציוניים המבטיחים תיקון יעיל ומהיר של ה- DNA, ובכך שומרים על שלמות גנומית. בדרך כלל, תיקון דנ"א נחקר בתאים שנחשפו לקרינה מיננת על ידי ניטור היווצרות של מה שמכונה קרינה מיננת- fuci המושרה (IRIF) על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תיקון DNA רבים ו DNA חישה חלבונים חישה IRIFs, המייצגים קומפלקסים חלבונים כי נוקלאט באתרי הכרומטין נזק DNA ^{2 , 3} . המיקום והרזולוציה של IRIFs לאורך זמן מעניקים תובנה חשובה לארגון spatiotemporal של תיקון DNA, ועשויים להצביע על מעורבותם של מסלולי תיקון דנ"א שונים. אופי הנזק לדנ"א ושלב מחזור התא שבו מתקבל הנזק קובע איזה מסלול תיקון דנ"א מופעל. Fo R), בתאים המעורבים באופן פעיל בשכפול דנ"א (S-phase), רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מסלול תיקון דנ"א דומיננטי, ואילו בתאים בשלב G1 או G2 / M של מחזור התא, הומולוגיים end-joining (NHEJ) מסלול תיקון שולטת. אחד האירועים המוקדמים ביותר בעקבות נזק ל- DNA הוא ההפעלה של ה- DNA חישה נזק קינאזות Ataxia Telangiectasia- מוטציה חלבון (ATM), אשר פעיל בעיקר G1 ו- G2 / M- שלבי מחזור התא מסדיר NHEJ, ו Ataxia Telangiectasia ו Rad3 הקשורות חלבון (ATR), אשר פועל בשלב S על ידי הפעלת HR. שניהם ATM ו ATR הם קינאזות pleiotropic מאוד כי phosphorylate חלבונים רבים המעורבים תיקון דנ"א, מוות תאים הישרדות ⁴ . שני קינאזות הוכחו phosphorylate ולהפעיל את חלבון מדכאי הגידול p53 בעקבות החשיפה ללחץ genotoxic, המציין כי קינאזות אלה הם מתווכים במעלה של ציר מרכזי דיכוי איתות מדכא"Xref"> 5 ^{, 6} .

היווצרות והרכב של IRIFs מוערכת בדרך כלל על ידי קביעת שיתוף לוקליזציה של חלבונים שונים באמצעות צבע כפול immunofluorescence מכתים מיקרוסקופיה, עם זאת, לא כל החלבונים שהם חלק ממתקני חלבון לתקן טופס IRIFs, אשר מגביל את תחולתה של גישה זו. יתר על כן, מיקרוסקופיה immunocalluorescence (confocal) immunofluorescence מוגבל על ידי תכונות עקיפה של האור, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית גרועה למדי של כ 200-300 ננומטר, עולה על גודל של מבנים תת ביותר, אשר למעשה אוסר על חקירה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים ב ברמה המולקולרית. ככזה, שיתוף לוקליזציה של דפוסים מכתים immunofluorescence כפי שזוהו על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו בהכרח אינדיקציה אינטראקציות חלבונים ישיר. לאחרונה, פיתחו טכנולוגיות חדשות ברזולוציה גבוהה, כגון תלת מימדי struc(3D-SIM) ⁷ , אשר שימש בהצלחה ללמוד 53BP1 ו BRCA1 IRIF היווצרות בקנה מידה ננו בקנה מידה, חושפים את המאפיינים ההפצה המרחבית של חלבונים אלה שלא ניתן לזהות ידי מיקרוסקופ לייזר confocal ⁸ סריקה.

שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון חלבון in vivo , כגון שיתוף immunoprecipitation, משיכה שיטות ושמרים שתי היברידית גישות ההקרנה. עם זאת, טכניקות אלה הם מסורבלים למדי, דורשים כמויות גדולות של תאים או חלבונים או לערב overexpression של חלבונים, אשר מציג חפצים ניסיוניים. לאחרונה, פותחה טכניקה חדשה המאפשרת להדמיה וכימות של אינטראקציות חלבונים-חלבון באתרו ( כלומר בתאים וברקמות), אשר נקראת Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} . יחסי ציבורנוגדנים אימריים המזהים שני חלבונים בעלי עניין מזוהים על ידי נוגדנים משניים המצמידים לאוליגונוקליוטידים (מה שמכונה בדיקות PLA). אם שני נוגדנים משני שונים קרובים מספיק בשל אינטראקציות בין החלבונים המוכרים על ידי נוגדנים ראשוניים, oligonucleotides מצומדות הכלאה יכול להיות ligated כדי ליצור מצע דנ"א סגור עגול. זה המצע העגול מוגבר לאחר מכן על ידי הגברה מעגל מתגלגל, ו דמיינו עם oligonucleotides fluorochrome- מצומדות מצומדות. באמצעות PLA, לוקליזציה subcellular של אינטראקציה חלבון חלבון נשמר כמו fluorescently שכותרתו מתגלגל מעגל הגברה המוצר נשאר מחובר בדיקות PLA. הפתרון של assay זה הוא <50 ננומטר, על פי הממצא כי קוטר של נוגדנים הוא כ 7-10 ננומטר ¹¹ . הגברה מעגל מתגלגל יכול להתרחש רק במקרה שני זוגות של נוגדנים (ראשוני + seconDary) אינטראקציה פיזית בתוך ההיקף המוגדר על ידי גודלם (10 + 10 + 10 + 10 = 40 ננומטר). צעד הגברה האות מגביר את הרגישות של assay PLA ומאפשר זיהוי של אינטראקציות של חלבונים לידי ביטוי בקושי. PLA מייצר דפוסי אותות הדוקים, דמויי foci שניתן לכמת על בסיס לכל תא, שבאמצעותם ניתן להעריך את השונות בין-תאית ובין-תאית באינטראקציות בין חלבונים לחלבון.

היווצרות והרכב של מתחמי תיקון דנ"א ו- IRIFs נחקרת בעיקר בקווים תאיים חסידים כגון עצם העצם האוסטלית של העצם אוסטיארקומה U2OS, קו תאי הכליה האנושי HEK293 וקו תא אפיתל פיגמנט ברשתית RPE-1, גדל וקל transfect. ההשעיה תא תרבויות כגון לימפה וקווים תא מיאלואידי נמצאים בשימוש בתדירות נמוכה יותר, שכן אלה פחות מקובל transfection ובדרך כלל לא לדבוק coverslips, ובכך דורש רחוב נוסף / אלטרנטיביEps עבור הדמיה. עם זאת, הרזולוציה של הנזק לדנ"א היא רלוונטית מאוד בהקשר של לימפה ומיאלואיד ממאירות, שכן תגובת הנזק לדנ"א מושפעת לעיתים קרובות מהפרעות גנומיות (נהגים) בגידולים אלה, וממלא תפקיד מרכזי בהפיכה הממאירה של לימפואיד ומיאלואיד ( בת) ^{12 , 13 , 14} .

פרוטוקול זה מתאר כיצד PLA ניתן להשתמש כדי להעריך לכמת אינטראקציות חלבון חלבון בעקבות אינדוקציה של נזק דנ"א בתרביות תאים ההשעיה. כאן, PLA מבוצעת כדי לקבוע ולדמיין את האינטראקציות בין כספומט p53 על נזק ל- DNA בתאי לוקמיה תאי B תאים אנושיים, כי הם המושרה לעבור מעגל מחזור תא שלב G1. שים לב, הפרוטוקול המוצג כאן אינו מוגבל ללימוד אינטראקציות כספומט ו- p53 בתאים לוקמיה G1, אבל יכול לשמש גם כדי לדמיין אחרים חלבון חלבון interacTions סוגי תאים שונים ותרבויות תאים ההשעיה.

Protocol

1. טיפול בתאי הנזק של דנ"א

1. תרבות האדם BCR-ABL + B- תאים תא תאים לימובלסטיים חריפים BV173 או SUP-B15 ב IMDM בתוספת FCS 20%, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / מ"ל ​​פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO ₂ . ספירת תאים צלחת ב 2 x 10 ⁶ תא / מ"ל ​​ב 6 בארות צלחות, ב 5 מ"ל / טוב.
   הערה: אופציונלי, שורות תאים ההשעיה ממוצא שונים יכולים לשמש.
2. כדי לעצור את BCR-ABL + B-ALL תאים בשלב G1 של מחזור התא, להוסיף 5 מיקרומטר של imatinib methanesulfonate (STI571), ו דגירה לילה.
   1. לחלופין, להשמיט את הצעד הזה כאשר לומדים אינטראקציות חלבון חלבונים לאורך מחזור התא או סוגי תאים שליליים BCR-ABL.
3. לעורר נזק ל- DNA על ידי הוספת 50 ng / mL neocarzinostatin (NCS) לתרבות, ו דגירה של 2 שעות.
   1. לחלופין,לגרום נזק לדנ"א על ​​ידי הקרנת התאים באמצעות מקור רדיואקטיבי [ ¹³⁷ Cs] ב 0.5 Gy / min, במינון של 5 Gy. לאחר הקרנה, לתת התא להתאושש במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO ₂ .
4. לחלופין, כדי להעריך את המעורבות של פעילות kinase כספומט בתגובה נזק DNA, להוסיף 5 מיקרומטר של מעכב kinase כספומט KU55933 לפני תוספת של NCS או טיפול הקרנה.
5. הכן 1x PBS + 10% BSA ידי שכבת 5 גרם של VSA חלק V-V על גבי 50 מ"ל של 1x PBS בכוס או בקבוק Erlenmeyer, ולתת לשבת ב RT עד BSA הוא מומס. אין לנער או לעורר כמו זה יגרום קצף נרחב. לאט מסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולשמור על הקרח.
6. קציר תאים לשטוף פעמיים עם קרח 1x קר PBS. ספירת התאים resuspend ב 2 x 10 ⁶ / mL ב 1x PBS + 10% BSA. שמור תאים על הקרח.

2. Cytocentrifugugation, קיבוע Permeabilization

1. הכן את4% paraformaldehyde פתרון 1x PBS טרי. הוסף 2 גרם של PFA ל 50 מ"ל של 1x PBS ו דגירה ב 55 מעלות צלזיוס רועד מים אמבטיה עד הפתרון ברור. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב- RT עד לשימוש.
   הערה: לחלופין, 4% מקבע PFA ניתן לאחסן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר הקפאה, להפשיר רק פעם אחת לשימוש. אחרת, 4% PFA פתרון PBS ניתן לרכוש ישירות.
2. בזהירות ללטש 76 מ"מ x 26 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ עם רקמה ללא מוך ו degrease אותם על ידי הנחת באתנול 96% בצנצנת קופלין במשך 5 דקות. בואו מיקרוסקופית שקופיות אוויר יבש במשך 10 דקות.
3. להרכיב שקופיות מיקרוסקופית לתוך משפכי cytospin / cytology עם שטח של 6 מ"מ. מראש מעיל שקופיות ידי pipetting 50 μL של 1x PBS + 10% BSA לתוך משפך ו צנטריפוגות דקות 1 בסל"ד 500.
4. הוסף 100 μL של ההשעיה התא (שווה 0.2 x 10 ⁶ תאים) לכל משפך צנטריפוגה במשך 5 דקות בסל"ד 500. עבור כל שילוב נוגדנים, ב leיש צורך בהכנות ל -4 אסט (ניסוי כפול נוגדנים, שני בקרות של נוגדנים בודדים, ללא בקרת נוגדנים).
5. בזהירות לפרק את המשפכים, ולוודא שלא לגעת כתמים. המשך לקביעת קיבוע מיד.
   1. לחלופין, תן שקופיות אוויר יבש במשך 30 דקות לפחות. לאחר ייבוש האוויר, גלישת גלישת בנפרד רדיד אלומיניום לאחסן ב -20 ° C עד השימוש. בעת שימוש בהכנות קפואות, הקפד להפשיר את השקופיות עטוף במגבת נייר כדי למנוע התעבות גלויה על השקופיות.
6. צייר מעגל (קוטר משוער 15-20 מ"מ) סביב המקום באמצעות PAP עט נוזל חוסם (5 מ"מ קצה).
7. הוסף 50 μL של פתרון קיבוע PFA 4% לכל נקודה ו דגירה במשך 30 דקות ב RT.
8. שטפו את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה.
9. יבש את השקופיות סביב כתמים עם רקמה ללא מוך ולהסיר נוזל הרבה מן המקום ככל האפשר באמצעות piחיית המחמד בלי לגעת במקום, או על ידי הטיה של השקופית. הוסף 50 μL של 0.25% Triton-X ב 1x PBS לכל נקודה ו דגירה של 10 דקות ב RT ללא תסיסה.
10. לשטוף את השקופיות 3 פעמים במשך 5 דקות ב ~ 50-60 מ"ל של 0.05% Tween-20 ב TBS (TBS-T) בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה. 10 שקפים ניתן לעבד בו זמנית באופן זה.

3. חסימת הדגירה נוגדן ראשוני

1. הקש על TBS-T וייבש את השקופיות סביב הנקודות באמצעות רקמה נטולת מוך. הסר נוזלים רבים מן המקום ככל האפשר באמצעות פיפטה בלי לגעת במקום, או על ידי הטיית השקופית. בקרוב מערבולת פתרון חסימה ולהוסיף טיפה אחת (~ 40 μL) לכל נקודה. לדגור על 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס בחדר טרום humidified מראש.
2. הכן את הקוקטייל נוגדנים על ידי ערבוב עז נגד כספומט ב 1: 1000 ואת ארנב נגד פוספו, Ser53-p53 ב 1: 100 בדילול נוגדן מסחרי, דיכאון נוגדנים מערבולת לפני השימוש. לניסויי בקרהTs, להכין דילולים נוגדנים המכילים רק את העז נגד כספומט רק את ארנב אנטי פוספו- Ser15-p53 נוגדן (בודד נוגדנים שולטת).
3. הקש את הפתרון חסימה אבל להיזהר לא לתת לתאים להתייבש לפני הוספת דילולים נוגדן. הוסף 30 μL של דילול קוקטייל כל נוגדנים ו דגירה בחדר humidified לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
4. להתכונן באתרו לשטוף הצפת ולשטוף מאגר B על ידי המסת את התוכן של שקיק אחד של הצפת A ו B מאגר צרף בנפח סופי של 1,000 מ"ל של מים כל אחד.
   1. לחלופין, להכין לשטוף חיץ על ידי המסת 8.8 גרם של NaCl, 1.2 גרם של בסיס טריס 0.5 מ"ל של Tween-20 ב 800 מ"ל מים. התאמת pH 7.4 באמצעות HCl ולהוסיף נפח סופי של 1,000 מ"ל.
   2. לחלופין, להכין לשטוף את מאגר B על ידי המסת 5.84 גרם של NaCl, 4.24 של בסיס Tris ו 26.0 גרם של Tris-HCl ב 500 מ"ל של מים. התאמת pH 7.5 באמצעות HCl. מוסיפים מים לנפח סופי של 1,000 מ"ל.
   3. לְסַנֵןשני הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
5. שטפו את השקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם חיץ 1x לשטוף באתרה A בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה.

4. בדיקות PLA, קשירת והגברה

1. הכינו בדיקות PLA על ידי דילול PLUS נגד עיזים נגד ארנב MINUS הן 1: 5 בדילול נוגדן מסחרי. הקש 1x לשטוף חיץ באתרו מן השקופיות ולהוסיף 30 μL של תערובת PLA תערובת לכל נקודה. דגירה 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס בחדר טרום humidified מראש.
   הערה: כל שילוב של נוגדנים משניים PLUS ו- MINUS PLA יכול לשמש (אנטי עכבר, אנטי ארנב, אנטי עז), כל עוד הנוגדנים העיקריים מוחלטים במינים שונים, והשילוב של בדיקות PLA צריך תמיד להכיל בדיקה PLUS ו MINUS בדיקה.
2. לשטוף שקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם ~ 50-60 מ"ל 1x ב חיץ לשטוף באתרה בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה./ Li>
3. הכן את הפתרון קשירת ליגאז על הקרח על ידי הוספת 1 μL של ליגאז ל 39 μL של פתרון קשירת ולהוסיף 40 μL של פתרון ליגאז ליגאז לכל נקודה. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחדר מחומם מראש humidified.
4. לשטוף את השקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם ~ 50-60 מ"ל 1x ב חיץ לשטוף באתרה A בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה.
5. הכן את הגברה-פולימראז תערובת על הקרח על ידי דילול פתרון המניות הגברה 1: 5 במים. ואז להוסיף 0.5 μL של פולימראז ל 39.5 μL של פתרון הגברה 1x עבור כל נקודה.
   הערה: ריאגנטים ההגברה הם רגישים לאור צריך להיות מוגן מפני חשיפה ישירה לאור. מגבר הגברה בארבעה צבעים שונים (אדום: עירור 594 ננומטר, פליטה 624 ננומטר, FarRED: עירור 644 ננומטר, פליטה 669 ננומטר, תפוזים: עירור 554 ננומטר, פליטה 576 ננומטר, ירוק: עירור 501 ננומטר, פליטה 523 ננומטר) ודא כי הגדרת מיקרוסקופ זמין יש sתכונות עירור ומסננים לתמונות אלה צבעים.
6. הקש את 1x לשטוף לשטוף באתרו ולהוסיף 40 μL של הגברה-פולימראז תערובת לכל נקודה. לדגור על 100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחדר מראש humidified מחומם.

5. הרכבה והדמיה

1. הכן 0.01x באתרו לשטוף חיץ B על ידי הוספת 1 מ"ל של 1x לשטוף מאגר B ל 99 מ"ל של מים.
2. הקש את תערובת הגברה-פולימראז לשטוף שקופיות 2 פעמים במשך 10 דקות עם 1x חיץ לשטוף באתרו B בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה.
3. לשטוף את השקופיות 1 דקות ב 0.01x לשטוף חיץ ב.
4. הקש על עודף 0.01x לשטוף חיץ B ויבש את השקופיות סביב כתמים עם רקמה ללא מוך. הסר נוזלים רבים מן המקום ככל האפשר באמצעות פיפטה בלי לגעת במקום, או על ידי הטיית השקופית.
5. מדולל DAPI המכיל בינוני הרכבה 1: 5 במדיום הרכבה ללא DAPI, כדי למנוע overstaining של גרעינים.
6. הוסף 25-30 μL של 1: 5 DAPI המכילים בינוני הרכבה על 24 מ"מ x 24 מ"מ coverslip ו להרים את להחליק להחליק עם השקופית, להפעיל לחץ קל כדי להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים. חותם את coverslip עם לק ציפור לחכות לפחות 15 דקות לפני הדמיה.
7. לנתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (confocal).
   1. לספור את מספר אותות PLA לדקלם לכל תא לפחות 4 שדות תמונה שנרכשו (מטרה 20x, לספור לפחות 20 תאים לכל מצב או שילוב נוגדנים, בהתבסס על חישוב כוח באמצעות ממוצע הצפוי של 7 ± 5 אותות בתאים שטופלו, ו 2 ± 2 אותות בתאים מטופלים, עם הסתברות של טעות מסוג I של 0.05, וכוח של 80%, כפי שדווח בעבר ¹⁵ ).
      הערה: הפתרון הטוב ביותר מושגת על ידי רכישת Z-stack ו deconvolution באמצעות חבילות תוכנה ( למשל , ImageJ, Leica רכישת Suite (LAS)). הסימןיש להבחין בקלות בתוך שטח הגרעין, כפי שהוגדר על ידי מכתים DAPI.
   2. אין לספור אותות המופיעים בבירור מחוץ לגרעינים. בדרך כלל, טיפול NCS או γ- הקרנה תוצאות כ 5-10 phosho-p53 / ATM PLA אותות לכל תא. את 'נוגדנים בודדים' שולטת עשוי לתת קצת רקע, אבל זה לא צריך לחרוג 1-2 אותות PLA לכל 1 מתוך כל 20 תאים.
   3. למטרות פרסום והצגה, ללכוד תמונות באמצעות 40X או 63X שמן טבילה המטרה. שקופיות ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס צריך להיות מוגן מפני חשיפה לאור.

תוצאות

זרחון של p53 ב שאריות Ser15 הוצגה להיות תלויה בפעילות כספומט כספומט ¹⁶ . כדי להדגים ולאשר את הספציפיות של טכניקת PLA על ההכנות cytospin של תרבויות תאים ההשעיה, הוא הראה כי אינדוקציה של נזק ל- DNA על ידי טיפול 2 שעות NCS של BCR-ABL + B- תאים ALL נעצר בשלב G1 של מח?...

Discussion

בדו"ח זה, הוא הוכיח כי PLA ניתן להשתמש כדי לקבוע לדמיין את האינטראקציה הספציפית בין חלבונים בתרבויות תא ההשעיה. ראוי לציין, הפרוטוקול המתואר כאן אינו מוגבל ללימוד מתחמי תיקון דנ"א, אלא גם חל על לדמיין לכמת אינטראקציות חלבונים אחרים חלבון בתרביות תאים ההשעיה. זה הו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors