近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

要約

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。

要約

DNA損傷応答は、自発的に起こる、遺伝毒性ストレスに起因する、またはリンパ球におけるプログラムされたDNA切断の状況で現れるDNA損傷の修復を調整する。 Ataxia-Telangiectasia突然変異キナーゼ（ATM）、ATMおよびRad3関連キナーゼ（ATR）およびDNA依存性プロテインキナーゼ（DNA-PKcs）の触媒サブユニットは、DNA損傷の誘導時に活性化される最初のものであり、 DNA修復、アポトーシスおよび細胞生存を制御するネットワークの中央調節因子である。腫瘍抑制経路の一部として、ATMおよびATRはリン酸化を介してp53を活性化し、それによってp53の転写活性を調節する。 DNA損傷はまた、DNA損傷センサの複合体を表す、いわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をもたらし、蛍光顕微鏡検査によって視覚化されるDNA損傷部位に蓄積する。しかし、IRIFにおけるタンパク質の共局在は、必ずしもd蛍光顕微鏡法の分解能が限られているため、直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用が必要である。

その場での近接性ライゲーションアッセイ（PLA）は、前例のない特異性および感度を有する細胞および組織におけるタンパク質 - タンパク質相互作用の直接的な可視化を可能にする新規技術である。この技術は、目的のタンパク質に結合する特異的抗体の空間的近接性に基づいている。調べられたタンパク質が約40nm以内にある場合、増幅反応は、抗体にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドによって誘発され、増幅産物は、蛍光標識によって視覚化され、相互作用タンパク質の細胞下の位置に対応するシグナルを生じる。 ATMとp53との間の確立された機能的相互作用を例として、ここでは、DNA損傷応答の不可欠な部分であるタンパク質間の直接的相互作用を研究するために、浮遊細胞培養においてPLAがどのように使用され得るかが実証される。

概要

DNA損傷は、タンパク質 - タンパク質相互作用、およびDNAの効率的かつ迅速な修復を確実にする翻訳後修飾を含む高度に制御された一連の事象を誘発し、それによってゲノムの完全性^{1を保護する} 。典型的には、DNA修復は、（共焦点）蛍光顕微鏡法によるいわゆる電離放射線誘導病巣（IRIF）の形成をモニターすることによって電離放射線に曝露された細胞において研究される。多くのDNA修復およびDNA損傷感知タンパク質はIRIFを形成し、これはDNA損傷を維持するクロマチン部位で核形成するタンパク質複合体を表す^2,3 。時間の経過とともにIRIFの位置と解像度は、DNA修復の時空間的組織化に重要な洞察を与え、異なるDNA修復経路の関与を示している可能性がある。損傷が達成されたDNA損傷および細胞周期段階の性質は、どのDNA修復経路が活性化されるかを決定する。フォ DNA複製（S期）に活発に関与する細胞では、相同組換え（HR）が優性のDNA修復経路であるのに対し、細胞周期のG1期またはG2 / M期の細胞では、相同末端結合（NHEJ）修復経路が優勢である。 DNA損傷後の最も初期の事象の1つは、細胞周期のG1-およびG2 / M-相において大部分が活性であり、NHEJを調節するDNA損傷感知キナーゼAtaxia毛細血管拡張突然変異タンパク質（ATM）の活性化であり、 HRを活性化することによってS期に作用するRad3関連タンパク質（ATR）を含むが、これらに限定されない。 ATMとATRの両方は、DNA修復、細胞死および生存に関与する多くのタンパク質をリン酸化する非常に多面的なキナーゼである⁴ 。両方のキナーゼは、遺伝毒性ストレスに曝された後に腫瘍抑制タンパク質p53をリン酸化して活性化することが示されており、これらのキナーゼは、重要な腫瘍抑制シグナル伝達軸の上流メディエーターであることが示されている"xref"> 5,6。

IRIFの形成および組成は、典型的には、2色免疫蛍光染色および顕微鏡法を用いて異なるタンパク質の共局在を決定することによって評価されるが、修復タンパク質複合体の一部であるタンパク質のすべてがIRIFを形成するわけではない。さらに、（共焦点）免疫蛍光顕微鏡法は、光の回折特性によって制限され、約200〜300nmの空間分解能がかなり低く、ほとんどの細胞内構造のサイズを超えており、本質的にタンパク質 - タンパク質相互作用分子レベル。このように、（共焦点）蛍光顕微鏡によって検出される免疫蛍光染色パターンの共局在化は、必ずしも直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用を示すものではない。最近、3次元構造物のような新しい超解像技術が開発されている共焦点レーザー走査顕微鏡^8で検出できなかったこれらのタンパク質の空間分布特性を明らかにする、ナノスケールの詳細における53BP1およびBRCA1 IRIF形成の研究に首尾よく使用された、テューティング照明顕微鏡（3D-SIM） ⁷ 。

イン・ビボでのタンパク質 - タンパク質相互作用、例えば共免疫沈降法、プルダウン法および酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を検出するために、いくつかの他の方法を使用することができる。しかしながら、これらの技術はかなり煩雑であり、多量の細胞またはタンパク質を必要とするか、またはタンパク質の過剰発現を伴い、実験的人工物を導入する。最近では、Proximity Ligation Assay（PLA） ^9,10と呼ばれるin-situ （ すなわち 、細胞および組織における）タンパク質 - タンパク質相互作用の視覚化および定量化を可能にする新規な技術が開発されている。 Pr関心対象の2つのタンパク質を認識する二価抗体は、オリゴヌクレオチド（いわゆるPLAプローブ）にコンジュゲートされた二次抗体によって検出される。 2つの異なる二次抗体が、一次抗体によって認識されるタンパク質間の相互作用のために十分に接近している場合、結合オリゴヌクレオチドはハイブリダイズし、ライゲーションして閉環状DNA基質を形成することができる。この環状基質は続いてローリングサークル増幅により増幅され、蛍光色素と結合した相補的オリゴヌクレオチドで視覚化される。 PLAを使用すると、蛍光標識されたローリングサークル増幅産物がPLAプローブに付着したままであるので、タンパク質 - タンパク質相互作用の細胞内局在が保存される。このアッセイの分解能は、抗体の直径が約7〜10nmであるという知見に基づいて<50nmである¹¹ 。ローリングサークル増幅は、2対の抗体（プライマリ+セコンdary）は、そのサイズ（10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm）で定義される周囲内で物理的に相互作用します。シグナル増幅工程は、PLAアッセイの感度を高め、ほとんど発現しないタンパク質の相互作用の検出を可能にする。 PLAは、細胞間単位で定量することができる点状の病巣様シグナルパターンを生成し、それによってタンパク質 - タンパク質相互作用における細胞内および細胞間の変動を評価することができる。

DNA修復複合体およびIRIFの形成および組成は、ヒト骨肉腫上皮細胞株U2OS、ヒト胎児腎細胞株HEK293および網膜色素上皮細胞株RPE-1のような接着細胞株で研究されており、増殖し、トランスフェクションしやすい。これらのリンパ系細胞系および骨髄系細胞系のような懸濁細胞培養は、トランスフェクションの影響を受けにくく、一般的にカバーガラスに付着しないため、使用頻度が低いイメージングのためのeps。しかし、DNA損傷応答は、これらの腫瘍におけるゲノム（ドライバー）異常によって頻繁に影響され、正常なリンパ系および骨髄系の悪性形質転換において中心的な役割を果たすため、リンパ系および骨髄系の悪性疾患の状況において、前駆細胞）細胞^12,13,14 。

このプロトコールは、浮遊細胞培養におけるDNA損傷の誘導後にPLAがどのようにしてタンパク質 - タンパク質相互作用を評価および定量するために使用され得るかを記載する。ここで、PLAは、G1期の細胞周期停止を受けるように誘導されたヒトB細胞白血病細胞におけるDNA損傷に対するATMとp53との間の相互作用を決定し可視化するために行われる。注目すべきは、ここに提示されたプロトコルは、G1拘束性白血病細胞におけるATMおよびp53相互作用の研究に限定されないが、他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化するために使用することもできる種々の細胞型および懸濁細胞培養における細胞の増殖を阻害する。

プロトコル

1.細胞の処理とDNA損傷誘導

1. 20％FCS、50μMβ-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したIMDM中のヒトBCR-ABL + B細胞急性リンパ芽球性細胞系BV173またはSUP-B15を、 37℃、5％CO _2の雰囲気下で培養した。細胞を計数し、5mL /ウェルで6ウェルプレート中で2×10 ⁶細胞/ mLでプレートする。
   注：任意に、様々な起源の懸濁細胞株を使用することができる。
2. 細胞周期のG1期のBCR-ABL + B-ALL細胞を停止させるために、5μMのイマチニブメタンスルホネート（STI571）を添加し、一晩インキュベートする。
   1. 必要に応じて、細胞周期またはBCR-ABL陰性細胞タイプ全体でタンパク質 - タンパク質相互作用を研究する場合は、このステップを省略してください。
3. 50 ng / mLのネオカルジノスタチン（NCS）を培養液に添加してDNA損傷を誘導し、2時間インキュベートする。
   1. あるいは、放射能源[ ¹³⁷ Cs]を0.5Gy /分で5Gyの線量で照射することによりDNA損傷を誘発する。照射後、37℃、5％CO ₂雰囲気下で細胞を2時間回復させる。
4. 場合によっては、DNA損傷に応答するATMキナーゼ活性の関与を評価するために、ATMキナーゼ阻害剤KU55933をNCSの添加または照射処理の前に5μM添加する。
5. ビーカーまたは三角フラスコ中の50mLの1×PBSの上に5gの画分V BSAを重層し、BSAが溶解するまで室温で放置することにより、1×PBS + 10％BSAを調製する。激しい発泡を引き起こすので、振り混ぜないでください。ゆっくりと0.22μmフィルターでろ過し、氷上に置く。
6. 細胞を採取し、氷冷1×PBSで2回洗浄する。細胞を数え、1×PBS + 10％BSA中で2×10 ⁶ / mLで再懸濁する。細胞を氷上に置く。

2.細胞遠心、固定および浸透

1. 準備する新たに1×PBS中4％パラホルムアルデヒド溶液。 2mLのPFAを50mLの1×PBSに添加し、溶液が透明になるまで55℃の振盪水浴中でインキュベートする。溶液を0.22μmフィルターで濾過し、使用するまで室温で保存する。
   注：必要に応じて、4％PFA固定液を-20℃で凍結保存することができます。凍結後、使用のために一度だけ解凍する。そうでなければ、PBS中の4％PFA溶液を直接購入することができる。
2. 糸くずのない組織で76 mm x 26 mmの顕微鏡スライドを注意深く磨き、Coplinジャーで96％エタノールに5分間入れて脱脂する。顕微鏡を10分間空気乾燥させる。
3. 顕微鏡スライドを6mmの領域でサイトスピン/細胞学の漏斗に組み込む。 50μLの1×PBS + 10％BSAを各漏斗に分注し、500 rpmで1分間遠心分離することによりスライドをプレコートする。
4. 100μLの細胞懸濁液（0.2×10 ⁶細胞に等しい）を各漏斗に加え、500rpmで5分間遠心分離する。各抗体の組み合わせについて、ast 4の調製が必要である（二重抗体実験;二つの単一抗体対照;抗体対照なし）。
5. 慎重に漏斗を分解し、その斑点に触れないようにしてください。すぐに固定のサンプルに進みます。
   1. 任意に、スライドを少なくとも30分間空気乾燥させる。風乾した後、スライドをアルミ箔で個別に包み、使用するまで-20℃で保存します。凍結した調製物を使用する場合は、スライド上に結露が発生しないように、ペーパータオルに包まれたスライドを解凍してください。
6. PAPペンの液体ブロッカー（先端5 mm）を使用して、スポットの周りに円（およその直径15-20 mm）を描きます。
7. 各スポットに50μLの4％PFA固定溶液を加え、RTで30分間インキュベートする。
8. 穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1×PBSで5分間3回細胞を洗浄する。
9. 糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させ、できるだけ多くの液体をスポットから除去するペットにスポットに触れることなく、またはスライドを傾けて各スポットに50μLの0.25％Triton-Xを1×PBSに加え、攪拌せずに室温で10分間インキュベートする。
10. 穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー中のTBS（TBS-T）中の〜50-60mLの0.05％Tween-20中で5分間スライドを3回洗浄する。 10枚のスライドをこのようにして同時に処理することができる。

3.ブロッキングおよび一次抗体インキュベーション

1. TBS-Tをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。ブロッキング溶液を短時間ボルテックスし、各スポットに1滴（約40μL）を加えます。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。
2. 使用する前に、市販の抗体希釈液、ボルテックス抗体希釈液中で、1：1,000のヤギ抗ATMと1：100のウサギ抗ホスホSer15-p53を混合することにより抗体カクテルを調製する。対照実験のためにヤギ抗ATMおよびウサギ抗ホスホSer15-p53抗体（単一抗体対照）のみを含有する抗体希釈液を調製する。
3. ブロッキング溶液を除去するが、抗体希釈液を添加する前に細胞を乾燥させないように注意する。各抗体カクテル希釈液30μLを加え、4℃で一晩加湿チャンバー内でインキュベートする。
4. バッファーAとバッファーBミックスの1つの袋の内容物をそれぞれ最終容量1,000mLの水に溶解して、その場で洗浄バッファーAと洗浄バッファーBを調製する。
   1. あるいは、8.8gのNaCl、1.2gのトリス塩基および0.5mLのTween-20を800mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Aを調製する。 HClを用いてpHを7.4に調整し、最終容量を1,000mLにする。
   2. あるいは、5.84gのNaCl、4.24gのトリス塩基および26.0gのトリス-HClを500mLの水に溶解することによって洗浄緩衝液Bを調製する。 HClを用いてpHを7.5に調整する。水を最終容量1000 mLになるまで加えます。
   3. フィルタ両方の溶液を0.22μmのフィルターに通した。
5. 穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャーで1x in situ洗浄バッファーAで5分間スライドを2回洗浄する。

PLAプローブ、ライゲーションおよび増幅

1. 抗ヤギプラスおよび抗ウサギMINUSを市販の抗体希釈液で1：5の両方で希釈することによってPLAプローブを調製する。スライドから1x in situ洗浄バッファーAをタップし、各スポットに30μLのPLAプローブ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で1時間インキュベートする。
   注：適用された一次抗体が異なる種で育成され、PLAプローブの組み合わせが常に存在すべきである限り、二次抗体PLUSおよびMINUS PLAプローブの任意の組み合わせ（抗マウス、抗ウサギ、抗ヤギ）を使用することができるPLUSプローブとMINUSプローブが含まれています。
2. 穏やかに撹拌しながら室温でCoplinジャー中で〜50-60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する
3. 1μLのリガーゼを39μLのライゲーション溶液に添加し、40μLのライゲーション - リガーゼ溶液を各スポットに加えることによって、氷上でライゲーション - リガーゼ溶液を調製する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で30分間インキュベートする。
4. 穏やかに攪拌しながら室温でCoplinジャー内の約50〜60mLの1x in situ洗浄緩衝液Aで5分間スライドを2回洗浄する。
5. 増幅ストック溶液を水で1：5に希釈することにより、氷上で増幅 - ポリメラーゼ混合物を調製する。次に、0.5μLのポリメラーゼを各スポットの1×増幅溶液39.5μLに加える。
   注：増幅試薬は感光性であり、光に直接暴露されないように保護する必要があります。増幅試薬は、4つの異なる色（RED：励起594nm、発光624nm、励起644nm、発光669nm、ORANGE：励起554nm、発光576nm、緑色：励起501nm、発光523nm）利用可能な顕微鏡検査の設定がuitable励起特性とこれらの色をイメージングするフィルタ。
6. 1x in situ洗浄バッファーAをタップし、スポットあたり40μLの増幅 - ポリメラーゼ混合物を添加する。あらかじめ加温した加湿チャンバー内で37℃で100分間インキュベートする。

5.取り付けとイメージング

1. 99mLの水に1mLの1mLのWash Buffer Bを加えて、0.01x in situ洗浄バッファーBを調製します。
2. Amplification-Polymerase混合液をタップし、Coplinジャーで緩やかに攪拌しながら室温で1x in situ洗浄バッファーBで10分間2回スライドを洗浄する。
3. スライドを0.01x洗浄バッファーBで1分間洗浄する。
4. 余分な0.01x洗浄バッファーBをタップし、糸くずのない組織でスポット周辺のスライドを乾燥させます。スポットに触れることなく、またはスライドを傾けることによって、できるだけ多くの液体をピペットを用いてスポットから除去する。
5. DAPIを含まないマウンティング培地をDAPIを含まないマウンティング培地で1：5希釈して、核の過剰な染色を避ける。
6. 25〜30μLの1：5DAPI含有マウント媒体を24mm×24mmのカバースリップに加え、スライドでカバースリップを拾い、気泡が閉じ込められていないことを確認します。ネイルポリッシュでカバースリップをシールし、イメージングの前に少なくとも15分間待つ。
7. （共焦点）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。
   1. 少なくとも4つの獲得された画像フィールド（20×対物レンズ、条件または抗体の組み合わせにつき少なくとも20個の細胞を計数し、処置された細胞において7±5個のシグナルの予想平均を用いた出力計算に基づいて細胞あたりの点陰性PLAシグナルの数を数え、以前に報告されたように、タイプIエラーが0.05の確率、および80％の出力の確率で、未処理の細胞では2±2シグナルであった。
      注：最高の解像度は、ソフトウェアパッケージ（ImageJ、Leica Acquisition Suite（LAS）など）を使用してZスタックとデコンボリューションを取得することによって実現されます。サインDAPI染色によって定義されるように、核周囲内で容易に識別可能であるべきである。
   2. 核の外側にはっきりと現れるシグナルは数えないでください。典型的には、NCS処理またはγ照射は、1細胞あたり約5〜10のphosho-p53 / ATM PLAシグナルを生じる。 「単一抗体」コントロールはバックグラウンドシグナルを与えるかもしれないが、これは20個の細胞のうち1個あたり1〜2個のPLAシグナルを超えてはならない。
   3. 出版およびプレゼンテーションの目的で、40倍または63倍の浸漬油の対物レンズを使用して画像を取り込みます。スライドは4℃で保存することができ、光の当たらないように保護する必要があります。

結果

残基Ser15におけるp53のリン酸化は、ATMキナーゼ活性に依存することが示された¹⁶ 。懸濁細胞培養のサイトスピン調製物に対するPLA技術の特異性を実証し確認するために、細胞周期のG1期に停止したBCR-ABL + B-ALL細胞の2時間のNCS処理によるDNA損傷の誘導が示されている予想通り、ATMとホスホ-Ser15-p53との間の特異的相互作用を生じた。 NCSで処理した細胞の...

ディスカッション

この報告では、PLAを用いて、懸濁細胞培養におけるタンパク質間の特異的相互作用を決定し可視化することができることが示されている。注目すべきは、ここに記載されたプロトコールは、DNA修復複合体の研究に限定されず、懸濁細胞培養における他のタンパク質 - タンパク質相互作用を視覚化および定量化するためにも適用される。 ATMキナーゼは、DNA損傷誘発剤に暴露された場合、G1-停止...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV173 cell line	DSMZ	AC-20	BCR-ABL+ B-ALL cell line
SUP-B15 cell line	DSMZ	ACC-389	BCR-ABL+ B-ALL cell line
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco (Life Technologies)	21980-032
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich	F7524	lot #: 064M3396
L-glutamine	Gibco (Life Technologies)	25030-024
penicillin/streptomycin	Gibco (Life Technologies)	15140-122
imatinib methanesulfonate	LC Laboratories	I-5508	Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution
neocarzinostatin	Sigma Aldrich	N9162	Mutagenic/teratogenic, handle with care
KU55933	Selleckchem	S1092	Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution
Starfrost Microscopy Slides	Waldemar Knittel	VA11200 003FKB
PAP pen liquid blocker	Sigma Aldrich	Z377821-1EA
Cytospin funnel	Q Path Labonord SAS	003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit	Sigma Aldrich	DUO92105	Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green
goat-anti-ATM	Bethyl Laboratories	A300-136A	PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies
rabbit-anti-phospho-Ser15-p53	Cell Signaling Technology	9284	We succesfully used lot #9284-4 in our studies
Vectashield antifading mounting medium with DAPI	Vector Labs	H-1200
Vectashield antifading mounting medium	Vector Labs	H-1000
4% paraformaldehyde in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Also available from various other vendors