JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

Abstract

אוטם שריר הלב המפל איסכמי עוקבות לגרום לאובדן נרחב של cardiomyocytes, שמוביל אי-ספיקת לב, הגורם המוביל של התמותה ברחבי העולם. גזע mesenchymal (MSCs) הם אופציה מבטיח מבוססת תא טיפולים להחליף את הנוכחי, פולשני טכניקות. MSCs יכולים להתמיין שושלות mesenchymal, כולל סוגי תאים הלב, אך התמיינות להשלים לתוך תאים פונקציונלית לא עדיין לא הושג. שיטות קודמות של בידול התבססו על סוכנים תרופתי או גורמי גדילה. עם זאת, אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ניתן גם להפעיל MSCs לעבור טרנספורמציה cardiomyogenic. כאן, אנו מציגים שיטה בידול באמצעות MSC אגרגטים בשכבות מזין cardiomyocyte לייצר תאים קבלנות, כמו cardiomyocyte.

תאים אנושיים חבל הטבור perivascular (HUCPVCs) הוכחו יש פוטנציאל מאשר הבחנה גדולה יותר נפוץ חקרו את סוגי MSC, כגון מח העצם MSCs (BMSCs). כמקור ontogenetically הצעיר, חקרנו את הפוטנציאל cardiomyogenic בטרימסטר הראשון (FTM) HUCPVCs לעומת מקורות בוגרים. FTM HUCPVCs הם מקור הרומן, עשיר של MSCs לשמור בתוך הרחם immunoprivileged המאפיינים שלהם כאשר תרבותי במבחנה. באמצעות בידול פרוטוקול זה, FTM המונח HUCPVCs מושגת בידול cardiomyogenic מוגבר באופן משמעותי בהשוואה BMSCs, כמצוין על-ידי ביטוי מוגבר של סמנים cardiomyocyte (קרי, myocyte משפר פקטור 2 ג, טרופונין לב T, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן, אות חלבון תקינה α ו connexin 43). הם גם קיימו immunogenicity נמוך משמעותית, כפי שהוכח על ידי שלהם נמוך הלע-A ביטוי והבעה הלע-G גבוה. החלת בידול מבוססי צבירה, FTM HUCPVCs הראה היווצרות צבירה מוגבר פוטנציאלי שנוצר קבלנות תאים אשכולות בתוך שבוע אחד של תרבות משותפת בשכבות מזין לב, הופך הסוג MSC הראשון לעשות כן.

התוצאות שלנו להדגים כי אסטרטגיה זו בידול יכול ביעילות לרתום את הפוטנציאל cardiomyogenic של MSCs צעירים, כגון FTM HUCPVCs, מרמז שכי במבחנה קדם הבידול יכול להיות אסטרטגיה אפשרית כדי להגדיל את יעילות הרגנרציה שלהם בתוך vivo.

Introduction

אי-ספיקת לב (CHF) נמשכת כגורם מוביל התחלואה והתמותה ברחבי העולם. CHF מתרחשת לעיתים קרובות בעקבות אובדן מאסיבי של cardiomyocytes ופיתוח של התא ללא רקמה צלקתית כתוצאה פתולוגי של אוטם שריר הלב (MI)1. הלב הוא איבר באופן חלקי עצמי המתחדש, תושב גזע ו קדמון תא הבריכה אחראי על ביצוע התחדשות רקמות באופן משמעותי פוחתת שפע ומתפקדים בחולים בגילאי, לעתים קרובות להיות מספיק להתאוששות אופטימלית לאחר פציעה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח טיפולים ניסיוניים המערבות את השתלת תאי התורם בריא לתוך שריר הלב הפגוע. זה הכרחי כי תאי התורם לא רק לשחזר את המבנה של הרקמה, אלא גם להשיג התאוששות פונקציונליות של שריר הלב מושפעת.

הלב יליד מעסיקה תושב רקמת הלב ותיקון אנדוגני שמקורם במח העצם בתאי גזע עבור לאחר פציעה2,3,4. משובי תאים-מארח, התורם-נגזר כאחד-חובה יש את היכולת להשיג את פנוטיפ המתאים ואת פונקצית microenvironment של שריר הלב שיפוץ, יחד עם היכולת ביעילות ובבטחה להחליף את התאים אבוד. במבחנה בידול שיטות נעשה שימוש נרחב על מנת להשיג יעילות גבוהה, המבוססים על תאי גזע cardiomyocyte-הייצור-5,-6. לפרופיל ביטוי של סמנים השושלת הלב משמש כדי להגדיר תהליך התמיינות תאי גזע כלפי שושלת היוחסין לב7. בתחילת בידול סמנים, כגון NKX2.5, myocyte משפר פקטור 2 ג (Mef2c), ו-8,GATA49, יכול להיות אינדיקציה אתחול של תהליך cardiomyogenic. סמנים cardiomyocyte בוגר נפוץ כדי להעריך את היעילות בידול הן אות חלבון תקינה α (SIRPA)10, טרופונין לב T (cTnT)11, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן (MYH6)8,12,13ו connexin 43 (Cx43)14,15,16. השיטות שימוש בתאי גזע עובריים (ESCs) וגזע pluripotent (מגירסה) יש כבר ביסודיות אופטימיזציה ודן לגבי הפרטים של גורמים אינדוקטיבית, חמצן ומילויים הדרגתיים מזין, ואת העיתוי המדויק של פעולה5,6,7,17,18. למרות זאת, ESC-PSC מבוססי טכנולוגיות עדיין להציג את מספר דאגות אתיות ובטיחות, יחד עם תכונות אלקטרופיזיולוגיות אימונולוגי שיוצרת19,20. המארחים מושתלים עם תאים אלה לעיתים קרובות חווים immunorejection ודורשים החיסוני קבוע. זאת בעיקר בשל mismatching תשואה histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) מולקולות המארח של התורם, וכתוצאה מכך T-cell תגובה21. בזמן MHC בודדים מחלקה אני התאמת הוא פתרון אפשרי, פרקטיקה קלינית נגיש יותר ידרוש מקור תא זה אוניברסלית immunoprivileged להתגבר על החשש מדחייה.

כמקור חלופי תא לשימוש ביישומים קליני, MSCs ובמיוחד, BMSCs, נחקרו לשימוש בהתחדשות רקמות מאז תיאור הראשונית שלהם בשנת 199522. MSCs מאמינים כי תושב תאים משובי שניתן למצוא כמעט בכל רקמה vascularized23. על בידוד מן המקור הרצוי, MSCs ניתן בקלות להרחיב בתרבות, יכולת paracrine נרחב, לעיתים קרובות בעלי immunoprivileged או immunomodulatory מאפיינים24,25. הבטיחות והיעילות שלהם כבר הוכחו במספר מחקרים קליניים, בפרט עבור התחדשות לב3,26.

אסטרטגיות רבות של בידול MSC לנצל סוכנים תרופתי, כגון 5-azacytidine22 , דימתיל סולפוקסיד27, ואת הצמיחה או גורמים morphogenic, כמו BMPs5,7,28,29 או אנגיוטנסין-II30, עם יעילות משתנה. אסטרטגיות אלו, עם זאת, אינם מבוססים על המכשולים תא משובי תמים סביר להניח שתיתקל לאחר שנשלחה אל האתר של פציעה או ויוו. אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, עוד יותר קשה להגדיר, לתמרן, מבוססים על ההנחה כי בידול MSC יכולה להיגרם באמצעות אותות microenvironment הרקמה עצמה. מחקרים קודמים הראו כי החשיפה לב תא lysates31 או32,חדרית שריר הלב33או ישיר קשר cardiomyocytes הראשית in vitro לקשרי15,34, באפשרותך להגדיל את הביטוי של סמני לב MSCs. אחרים הדגים cardiomyogenesis ספונטנית לאחר טיפול פציעות לב עם MSCs35,36,37,38, למרות בחלקו, היתוך גרעיני של BMSCs, cardiomyocytes39,40 שנוצר לשריר המתהווה. לידע שלנו, cardiomyocytes פונקציונלי, מתקשרת באופן ספונטני של MSCs אנושי (hMSCs) של כל מקור הרקמה לא טרם דווחו.

הקונצנזוס הנוכחי הוא כי כל MSCs נובעים תאים perivascular23. יאנג MSCs עם מאפיינים pericyte ניתן לבודד מאזור perivascular של42,41,רקמה אנושית הטבור43. בהשוואה BMSCs, HUCPVCs בעלי פוטנציאלי מוגבר בידול, מספר יתרונות משובי אחרים, שניהם במבחנה41,44 ו ויוו45,46,47. ראוי לציין, המקור להיות הממשק אמהי-עוברית, HUCPVCs יש immunogenicity נמוך משמעותית בהשוואה למבוגרים מקורות של MSCs. המחקר שלנו מתמקד אפיון ויישומים קליניים של FTM HUCPVCs, המקור הצעיר של MSCs חקירה, אשר בעבר הראינו הגבירו proliferative ומעלה multilineage הבחנה הקיבולות, כולל השושלת cardiomyogenic41.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב היווצרות צבירה ושכבות המזין העיקרי תא לב כמו אינדוקטיבית כוחות כדי להשיג את הבידול cardiomyogenic מלאה של אגרגטים MSCs. לספק סביבה תלת-ממד, כדאי מודלים תנאים ויוו לעומת תרבויות חסיד 2D. ניצול שכבות הלב מזין מספק סביבה נציג של האתר השתלת האולטימטיבי MSCs. נדגים כי מקורות הצעיר של MSCs מבודד חוטי חבל הטבור לפני או אחרי לידה יש יכולת גבוהה יותר טופס אגרגטים ולהגיע על פנוטיפ לב בהשוואה למבוגרים BMSCs, תוך שמירה על הזכות-החיסון שלהם. מלבד גובה תלול של השושלת לב סמן גנים, הביטוי המושרה תאיים (קרי, cTnT ו- MYH6) וחלבונים תא-פני (קרי, SIRPA ו Cx43) ספציפיות עבור cardiomyocytes, אנו מראים כי הפוטנציאל בידול של FTM HUCPVCs ניתן לשלוט באמצעות שיטה זו, כי הם יכולים להצמיח באופן ספונטני קבלנות תאים, כמו cardiomyocyte.

Protocol

All studies involving animals were conducted and reported according to ARRIVE guidelines48. All studies were performed with institutional research ethics board approval (REB number 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, University of Toronto, Toronto, Canada). All animal procedures were approved by the Animal Care Committee of the University Health Network (Toronto, Canada), and all animals received humane care in compliance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition (National Institutes of Health 2011).

1. Tissue Culture

  1. Culture FTM HUCPVCs, term HUCPVCs (previously established, n ≥ 3 independent lines for each)42 and commercially available BMSCs in alpha-minimum essential medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and a 1% penicillin/streptomycin (P/S) cocktail. Culture rat primary cardiomyocytes and MSC-cardiomyocyte co-cultures in Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM-F12) containing 10% FBS and 1% P/S.
    NOTE: Sterilize the medium using a 0.2-µm filter. Store prepared medium solutions at 4 °C for up to 3 weeks.
  2. Maintain cell cultures in humidified incubators (95% relative humidity, 37 °C, and 5% CO2) and passage at 70-80% confluency, determined by phase-contrast microscopy. Use appropriate volumes of medium for the size of tissue culture dish used (e.g., 10 mL in a 10-cm dish and 2 mL per well in 6-well tissue culture plate). Use these culture conditions for the duration of the protocol.
  3. Dissociate MSC monolayers for passaging or MSC-cardiomyocyte co-culture establishment using a dissociation enzyme solution (2 mL/well in a 6-well plate) and incubate at 37 °C for 4 min.
  4. Transfer the dissociated cells to a 15-mL tube and centrifuge at 400 x g for 5 min.
  5. Aspirate the supernatant without disrupting the cell pellet and resuspend the cells in 1 mL of a culture medium appropriate for counting using an automated cell counter. Seed the cells as described in the following protocol sections.

2. Preparation of Primary Rat Cardiomyocyte-MSC Co-cultures

  1. Obtain heart tissue for primary cardiomyocyte isolation.
    1. Euthanize rat pups (5-6 days postnatal) using CO2 asphyxiation. Set CO2 chambers to 20% gas replacement (flow rate = 0.2 x chamber volume per min). Confirm exitus by the absence of the pinch reflex.
    2. Remove the atria with the connecting major blood vessels using sterilized instruments (i.e., forceps and curved scissors)41. Transfer the hearts to 50-mL tubes containing sterile PBS with1% P/S (PBS-P/S) on ice.
    3. Cut the ventriculi in half and let the blood wash out in a 10-cm dish with 10 mL of PBS-P/S on ice. Cut the ventricular walls into small pieces (diameter = 2-3 mm) using curved scissors.
    4. Transfer the heart pieces from 10-12 animals to a 50-mL tube using a serological pipette and let them settle.
    5. Remove as much PBS-P/S as possible without removing any heart pieces. Add 10 mL of new PBS-P/S.
  2. Digest the heart tissue to isolate the cardiomyocytes.
    1. Allow the heart pieces to settle. Replace the PBS-P/S with 10 mL of 0.15% trypsin in PBS and shake at 37 °C for 10 min.
    2. Discard the supernatant. Repeat the digestion described in step 2.2.1 three more times, but decant the supernatants into 50-mL collection tubes containing 10 mL of 100% FBS.
  3. Centrifuge the cells (400 x g, 5 min) and aspirate the supernatant. Resuspend the cells in DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S and seed onto a 6-well plate (1 x 105 cells/cm2, 2 mL of medium per well).
  4. After 1 h, transfer the medium containing non-attached cells to a 50-mL tube and discard the attached cells. Count the cells in suspension and re-plate them into new 6-well plates (1 x 105 cells/cm2, 2 mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S per well).
  5. Inhibit cell proliferation with bromodeoxyuridine (BrdU).
    Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training is provided and refer to the safety data sheet before use.
    1. Once cells have attached, replace the medium in the 6-well plate with DMEM-F12 containing 10% FBS, 1% P/S (2 mL of medium per well), and 5 µM BrdU. Incubate for 16 h (37 °C, 5% CO2).
    2. Remove the BrdU-containing medium and replace with DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S (2 mL of medium per well).
  6. Prepare pre-stained MSCs.
    1. Once MSC cultures are at 70-80% confluency in 10-cm dishes, remove the culture medium and add 3 mL of cell dissociation solution. Incubate the dish at 37 °C and 5% CO2 for 5 min.
    2. Transfer the dissociated cells to a 15-mL tube and centrifuge at 400 x g for 5 min.
    3. Aspirate the supernatant without disrupting the cell pellet and resuspend the cells in 1 mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S for counting using an automated cell counter.
    4. Dilute the cells to a concentration of 1 x 106 MSC/mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S.
    5. Incubate the MSCs with viable, non-transferable fluorescent dye (5 µM, 30 min, 37 °C, 5% CO2) in 1.5-mL centrifuge tubes for 1 h.
    6. Centrifuge the tubes at 400 x g for 5 min. Aspirate the supernatant and resuspend the pellet in DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S for a cell concentration of 1 x 106 MSC/mL. Repeat this a total of 3 times.
  7. Transfer the MSCs onto cardiomyocytes (step 2.5.2) at a concentration of 10 x 104 cells per well of the 6-well plate.

3. Preparation of Aggregate Co-cultures

  1. Prepare a single-cell suspension of MSCs (2 x 104 cells/mL of medium, passage # ≤ 6) in alpha-MEM supplemented with 10% FBS and 1% P/S (see step 2.6).
    NOTE: Refer to section 1 of the protocol for the passaging of cells. Alternatively, pre-stain MSCs as per step 2.6.
  2. Initiate aggregate formation by placing 25-µL drops of cell suspension (500 cells) on the inner surface of the lids of 10-cm tissue culture dishes (up to 50 drops per lid). Place the lids on their bottom counterparts containing PBS-P/S. Incubate at 37 °C and 5% CO2.
    NOTE: Place 5-7 mL of PBS-P/S into the culture dish below the hanging drops to avoid drop evaporation.
  3. Observe aggregate formation in the drops after 3 days using a stereomicroscope. If over 40 out of 50 drops contain formed aggregates, collect the drops from the lids using a 1-mL micropipette and transfer the aggregates directly onto primary rat cardiomyocyte monolayers (prepared in steps 2.1-2.7; 10 drops/well). Avoid vigorous pipetting to preserve aggregate integrity.
  4. Keep aggregate co-cultures in the incubators for up to 2 weeks, changing the full volume of medium (2 mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S per well) every 72 h.
    1. Daily observe aggregates attaching on feeder cell layers using bright-field microscopy. Record contracting aggregates when observed.
  5. Prepare aggregates for analysis.
    1. Remove the medium and add 2 mL of PBS per well of a 6-well tissue culture dish. Remove the PBS and add 2 mL of dissociation solution per well. Incubate for 3 min at 37 °C and 5% CO2.
    2. Centrifuge at 400 x g for 5 min to obtain a cell pellet. Resuspend in medium, as specified for the applications described in the subsequent steps (see steps 4.1, 5.1, and 6.1) and pass through a 70-µm cell strainer.

4. Flow Cytometry (FC) and Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS)

  1. Incubate cell suspensions (1 x 105 cells in 200 µL of PBS containing 3% FBS) with fluorophore-conjugated (FITC or APC) primary antibodies (i.e., CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G, and SIRPA for FC or TRA-1-85 for FACS; 1:40) at 4 °C for 30 min, protected from light.
  2. Centrifuge (400 x g, 5 min) and resuspend the cells in 1 mL of PBS with 3% FBS for FC or PBS with 0.5% FBS for FACS.
    NOTE: The FC of MSCs was optimized by Hong et al.41.
  3. Maintain the cells at 4 °C in the dark until they are ready to be analyzed by FC (at least 1 x 104 events) or FACS. Sort the cells as described41. Re-plate TRA-1-85 high-positive sorted cells in 6-well plates (1 x 104 cells/well, 2 mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S) within 1 h.
    NOTE: For the gating strategy of the TRA-1-85 human cell surface antigen, see the Supplementary Figure.

5. Immunocytochemistry (ICC) and Microscopy

  1. Re-plate the cell suspensions obtained from the co-cultures (step 3.5.2) or FACS (section 4) onto chamber slides (1 x 104 cells/well, 2 mL of DMEM-F12 containing 10% FBS and 1% P/S per well). Let the cells attach overnight in a tissue culture incubator (see section 1 for the conditions).
  2. Fix the cells using 3 mL of 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 15 min at room temperature. Wash 3 times with 3 mL of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA; PBS-BSA) for 5 min per wash.
    Caution: Wear appropriate personal protective equipment when handling PFA.
  3. Permeabilize the cells in 3 mL of PBS-BSA with 0.1% Triton X-100. Incubate at room temperature for 10 min for intracellular antigens (i.e., alpha sarcomeric actinin (aSarc) and Cx43), or 25 min for intra-nuclear antigens (i.e., Mef2c and human nuclear antigen (HuNu)). Wash 3 times with 3 mL of PBS-BSA for 5 min per wash.
  4. Block the samples against non-specific antibody reactions with 3 mL of PBS containing 5% normal goat serum (NGS) and 1% BSA for 15 min at room temperature. Wash 3 times with 3 mL of PBS-BSA for 5 min per wash.
  5. Incubate the cells in the primary antibodies (i.e., Mef2c, aSarc, Cx43, and HuNu) diluted 1:200 in 3 mL of PBS-BSA at 4 °C overnight.
  6. Wash 3 times with 3 mL of PBS-BSA for 5 min per wash and incubate with secondary antibodies for 30 min at room temperature. Wash 3 times with 3 mL of PBS-BSA for 5 min per wash.
  7. Store the stained specimens in 3 mL of of mounting medium.
  8. Acquire images using a fluorescence microscope. Use a 10X objective (NA = 0.3), and a 20X objective (NA = 0.45) for lower-magnification imaging. Use fluorescence filter cubes and wavelengths for GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) and RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) for the secondary antibodies used (see the Materials and Equipment Table).
  9. Quantify images using imaging software (see the Materials and Equipment Table for the recommended software). Normalize the fluorescence intensity readings to the secondary control acquisitions.

6. RNA Isolation and Quantitative RT-PCR

  1. Prepare RNA samples from undifferentiated MSC cultures or MSCs sorted from co-cultures using column-based RNA isolation, according to the manufacturer's instructions. Prepare 1 x 104 to 1 x 106 cells in 0.7 mL of cell lysis buffer (provided with the RNA isolation kit) per sample.
  2. Prepare cDNA from up to 2 µg of RNA per 100-µL RT reaction.
  3. Perform qPCR using 10 ng of cDNA per reaction (40 cycles, 60 °C annealing/extending temperature).
    1. Use primers for human MY6H and cTnT in a 500-nM concentration and 1-100 ng of cDNA per reaction (see the Materials and Equipment Table). Use GAPDH, ACTB, and HPRT as internal housekeeping normalizers. Use commercially available human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as a positive control.
      NOTE: Express the fold-change of expression compared to undifferentiated MSC-derived cDNA samples.

תוצאות

HUCPVCs Display Higher Aggregate-formation Potential and CD49f Expression Levels Compared to BMSCs:

To induce the differentiation of hMSCs (i.e., FTM HUCPVCs, term HUCPVCs, and BMSCs), single-cell suspensions of undifferentiated MSCs or MSC-containing hanging drops (Table 1) were transferred onto rat primary cardiomyocyte monolayers to establish direct co-cultures or aggregate co-cultur...

Discussion

הבידול הלב של תאי גזע נמצא בפיתוח במשך יותר מ 2 עשורים, עם מספר אסטרטגיות שונות בשימוש ליצירת תאים דמויי cardiomyocyte ממקורות MSC. רבים של אסטרטגיות אלו, עם זאת, הם לא יעילים, התנאים בהם נעשה שימוש לעתים קרובות לא נציג הסביבה, מושתלים תאים מפגש ויוו.

בניגוד לשיטות הקיימות, פרוטוק...

Disclosures

ד ר קליפורד ל' Librach הוא מחזיק משותף של הפטנט: שיטות בידוד ושימוש של תאים שמקורם ברקמות חבל הטבור בשליש הראשון, העניק קנדה ואוסטרליה.

Acknowledgements

המחברים תודה חברי הצוות הבאה ומחקר סגל על תרומתם: מתיו Librach, ליילה בית, טניה א Baretto, שלומית קניגסברג ו אנדרה גותייה-פישר. עבודה זו נתמכה על ידי אונטריו מחקר קרן - מחקר (ORF-RE, עגול #7) ומצוינות ליצור תוכנית בע מ

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200056For cell dissociation
Alpha-MEMGibco12571071For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibodyBiolegend313612Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibodyR&D SystemsFAB7737AConnexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibodyGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibodyAbcamab7904Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibodyAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FCardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibodyR&D SystemsFAB3195AHuman cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibodyR&D SystemsFAB3195FHuman cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibodyAbcamab11370Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibodyAbcamab9465aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibodyNew England BioLabs Ltd.5030SFor ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibodyEMD MilliporeMAB1281For ICC
MZ9.5 StereomicroscopeLeicaFor imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubesAxygenMCT-150-CFor staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJOpen source image processing software.
Aria II BDUHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cellsLonzaPT-2501BMSCs
Bovine serum albuminSigma-AldrichA7030-100GBSA. To prepare solutions for ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto IIBDUHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counterInvitrogen Inc.C10227For cell counting
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineGibco10010023D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesIn-house fluorescent microscope
FACSCaliburBDIn-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probesIntegrated Data TechnologiesFAM fluorophorehttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting MediumThermoScientificTA-030-FMFor storage of cells to undergo ICC
LSR II BDUHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serumCell Signaling Technology5425SNGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wellsThermo Scientific Nunc155409To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPAs a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycinGibco15140122Component of cell culture medium.
PrimersSigmaCustom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmolCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytesReproCellRCD001NPositive control for qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074For qPCR with master mix
RPMI 1640GibcoA1049101For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assaysThermo Fisher Scientific4444556For qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Staining of cells for viability and counting
TrypsinGibco272500108For cell dissociation
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Imaging software
0.2 μm pore filterThermo Fisher Scientific566-0020For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific51026410For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
ForcepsAlmedic7727-A10-704For handing rat heart. Can use any similar forceps.
ScissorsFine Science Tools14059-11For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tubeBD Falcon352070For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tubeBD Falcon352096For general tissue culture procedures
6-well platesThermo Scientific NuncCA73520-906For tissue culture
10 cm tissue culture dishesCorning25382-428For aggregate formation
Axiovert 40C MicroscopeZeissFor bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainerFisherbrand22363548To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100EMD Millipore9410-1LUsed in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Stain used during visualization of Cx43 localization

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126mesenchymalcardiomyocytesperivascularcardiomyocytes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved