שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעודן לחשוף ביעילות biotinylated לתוספי אמין (BDA) תיוג עם פלורסנט צביעת שיטת דרך מסלול עצבי הדדיים. היא מתאימה לניתוח המבנה קנס של BDA תיוג, המבדיל אותו רכיבים עצביים אחרים תחת מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי.

Abstract

משקל מולקולרי גבוה biotinylated לתוספי אמין (BDA) שימש בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רגישה מאוד במשך עשורים רבים. מאז האיכות של תיוג שלה הושפע על ידי גורמים שונים, כאן, אנו מספקים פרוטוקול מעודן של יישום משקל מולקולרי גבוה BDA לימוד אופטימליים תיוג עצבי במערכת העצבים המרכזית. לאחר הזרקת סטיאוטטי BDA לתוך הגרעין הגחוני posteromedial (VPM) של התלמוס בחולדה באמצעות פיפטה מזכוכית עדינה, BDA היה מוכתם streptavidin פלורסנט-(AF) 594 אלקסה, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525. על הרקע של צביעת Nissl ירוק, אדום BDA תיוג, כולל מסופים עצב, וגופי תאים עצביים היה ביתר בירור הפגינו קליפת המגע. יתר על כן, להכפיל מכתים פלורסנט עבור BDA וביצעו סידן מחייב חלבון parvalbumin (PV) היה להתבונן הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons PV-חיובית בתוך המטרה קורטיקלית, מתן הזדמנות ללמוד המקומי עצבית מעגלים ומאפיינים הכימי שלהם. לכן, בשיטה זו מעודן מתאים לא רק להמחיש באיכות גבוהה עצבית תיוג עם משקל מולקולרי BDA גבוהה דרך מסלולים עצביים הדדיים בין קליפת המוח תלמוס, אבל גם יאפשרו הדגמה סימולטני של סמנים עצביים אחרים עם להסטולוגיה פלורסנט או נוגדנים.

Introduction

משקל מולקולרי גבוה BDA (10,000 מולקולרית משקל), מכשיר מעקב רגישים, שימש במשך מעקב מסלולים עצביים במערכת העצבים המרכזית עבור יותר מ-20 שנים¹. למרות השימוש BDA הוא משחק טרקטו עצבית נפוצות עקיבה טכניקה, האיכות של BDA תיוג עשויה להיות מושפעת בבעלי חיים שונים גורמים^1,2,3. מחקר שנערך שלנו ציינו כי המבנה האופטימלי של BDA תיוג זה המשויך זמן הישרדות שלאחר הזרקה נכונה אלא גם בקורלציה עם שיטת צביעת⁴. עד עכשיו, מתחם אבידין-ביוטין-peroxidase קונבנציונאלי (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate, streptavidin-AF594 שיטות מכתימים שימשו חשיפת BDA תיוג הקודם מחקרים^{2,3, 4,5}. לשם השוואה, צביעת פלורסנט עבור BDA ניתן בקלות לבצע.

על מנת להרחיב את היישום של משקל מולקולרי גבוה BDA, הוצג פרוטוקול מעודן במחקר הנוכחי. לאחר ההזרקה של BDA לתוך VPM של התלמוס במוח עכברוש, תיוג BDA היה חשף בשיטה הרגילה של צביעת ABC סטנדרטיים, כמו גם על ידי זוגי פלורסנט מכתים, אשר בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, בסיסי אלמנטים עצבית או interneurons בתוך המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, להסטולוגיה Nissl פלורסנט או PV-נוגדנים, בהתאמה. דרך מסלולים עצביים הדדיים בין VPM של קליפת המגע העיקרית (S1)^6,7,8, התמקדנו שלנו תצפית על BDA תיוג thalamocortical מוקרן אקסונים ו corticothalamic somas תא המתוכננת ב ו- S1. באמצעות תהליך זה, אנו אמורים לספק לא רק פרוטוקול מפורט להשגת האיכות הגבוהה של תיוג עצביים עם משקל מולקולרי גבוה BDA, אלא גם פרוטוקול מעודנת על השילוב של תיוג BDA פלורסנט, סמנים עצביים אחרים פלורסנט עם להסטולוגיה או נוגדנים. גישה זו עדיפה ללמוד את המעגלים העצביים מקומיים ו שלהם מאפיינים כימיים תחת לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ.

Protocol

מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה-סין האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אסמכתא מס ' 20160014). כל ההליכים נערכו לפי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (הלאומית האקדמיה Press, וושינגטון די. סי., 1996). ארבעה חולדות זכר בוגר (משקל 250-280 גרם) השתמשו במחקר זה. כל בעלי החיים היו בבניין מחזור/כהה 12 שעות עם מבוקר טמפרטורה ולחות, איפשרה גישה ללא מזון ומים. כלים וחומרים השתמשו במחקר הנוכחי היו הראה באיור1.  לפני הניתוח, כל הכלים, כגון מסגרת stereotaxic פיפטה מזכוכית, נוקו באמצעות אתנול 70%.

1. ניתוחים

1. קובעים את האזור קואורדינטות עניין ב- VPM באמצעות stereotaxic אטלס⁹ (איור 2 א).
2. להכין 1 µL מיקרו-מזרק מצויד micropipette זכוכית (בקוטר טיפ של 10-20 מיקרומטר) (איור 1D) לבדוק את זה עם שמן פראפין.
3. עזים ומתנגד החולדות עם 7% כלורין (0.7 מ של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן.
4. לאחר הרדמה עמוקה הוא אישר עם זנב קמצוץ, פדלים רפלקס הנסיגה, לגלח את הראש של החיה עם מכונת גילוח חשמלית ו לשפשף את האתר כירורגית 3 פעמים עם 10% povidone יוד ואחריו אתנול 70% בהתאמה.
5. למקם את החולדה המכשיר stereotaxic על-ידי הצבת האוזן בוטה ברים לתוך אוזניה, למקם החותכות העליונות של החולדה בעל הפה (איור 1E), ולאחר מכן החל אופטלמולוגיות משחה על העיניים.
6. לנקות את העור הראשי של האתר כירורגית שוב באמצעות אתנול 70%. להשתמש כפפות כירורגי סטרילי ומגבות כדי לשמור את הניתוח בתנאים סטריליים.
7. עושים חתך הסאגיטלי בעור עם איזמל לאורך התפר המשונן (איור 1F).
8. לגרד את השריר ואת קרום העצם מן הגולגולת באמצעות applicators שקצהו כותנה סטרילי לאורך כל הניתוח כדי לשלוט הדימום (איור 1F).
9. בעזרת הקואורדינטות מוגדרת מראש מתוך אטלס (איור 2 א), לקבוע את המיקום (-3.3 מ מ Bregma נקודות, 2.6 מ מ הזכות קו האמצע) של גולגולת (איור 1 ג'י).
10. לבצע ניתוח של פתיחת גולגולת באמצעות תרגיל בר עם מעט עגול-טיפ (#106) (איור 1 H) ולהמשיך קידוח כדי על 1 מ מ לעומק תוך מספר דקות עד שהגיע קרומי המוח (איור 1I).
11. בלו קרום הדורה באמצעות microforceps לחשוף את קליפת המוח במהלך ההזרקה (איור 1I).
12. לשנות פרפין נוזלי במזרק המיקרו-עם 10% BDA (10,000 משקל מולקולרי, במים מזוקקים) פתרון (איור 1J).
13. בעיא המזרק המנגנון microinjection וחבר עם מיקרו-משאבה (איור 1 K).
    הערה: אמצעי האחסון מוזרק נמצא תלוי על המהירות של המיקרו-המשאבה. כאן זה היה מותאם nL 30/min (איור 1 L).
14. תחת stereomicroscope, הכנס של micropipette זכוכית באופן ידני עם המנגנון microinjection VPM דרך השטח בקליפת המוח של המוח בעומק של 5.8 מ מ (איור 1 מ').
15. לחץ-להזריק 100 nL של 10% BDA לתוך VPM על פני תקופה של 3 דקות (nL 35/דקה) עם מיקרו-משאבה (איור 1 L, M).
16. לאחר ההזרקה, לשמור על פיפטה במקומם 5 דקות נוספות, ואז לסגת לאט.
17. תפר את הפצע עם חוט סטרילי (איור 1N). בצע את הנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מקומיים מראש, לאחר ניתוח נגד כאבים.
18. למקם את החולדה באזור השחזור חמים עד שהיא תשוב להכרה הוא התאושש לחלוטין.
19. להחזיר את החולדה התאושש בחזרה לכלוב שלו.

2. perfusions ומקטעים

1. כעבור זמן הישרדות של בדרך כלל 10 ימים, להזריק החיה עם מנת יתר של 10% urethane (2 מ"ל של 100 גרם) על ידי הזרקת בקרום הבטן לזירוז המתת חסד.
2. Perfuse העכברושים ניסיוני בשכונה (איור 1O).
   1. לאחר עוצר הנשימה, באמצעות מספריים, מלקחיים, לפתוח את חלל בית החזה של העכברוש לגשת הלב. להכניס קטטר תוך ורידי של החדר השמאלי כלפי אבי העורקים, ולאחר מכן פתח את auricle נכון.
   2. קודם perfuse עם 0.9% באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת פיזיולוגיים (37 מעלות צלזיוס) כ 1-2 דקות עד היציאה מן הלב הוא נקה ולאחר מכן המשך עם 250-300 מ ל 4% paraformaldehyde במאגר פוספט 0.1 M (PB, pH 7.4).
3. לאחר זלוף, פצעים וחתכים בעור הראש, לפתוח את הגולגולת, ואז לנתח את המוח חולדה. פוסט-לתקן את המוח ביתור ב 4% paraformaldehyde עבור 2 h בטמפרטורת החדר (26 ° C), אז cryoprotect ב- 30% סוכרוז ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) במשך 3 ימים ב 4 ° C עד המוח הוא שקוע הפתרון (איור 1 P).
4. ברגע המוח הוא שקוע הפתרון, לחלק את המוח שלושה גושי בניינים לכיוון הילתית על מטריצות המוח (איור 1Q). הגוש המרכזי מכיל את VPM ואת S1.
5. חותכים את הגוש המרכזי של המוח-40 µm על שלב ההקפאה הזזה מיקרוטום מערכת בכיוון הילתית. איסוף מקטעים אלה מסודרת בצלחת 6-ובכן עם 0.1 M PBS (pH 7.4) (דמויות 1R, S).

3. תקן ABC מכתים

הערה: חינם צף מקטעים של כל קטע הילתית השלישי של המוח שימשו להמחשת BDA תיוג עם ABC סטנדרטי הליך¹⁰.

1. לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.
2. דגירה בסעיפים 1% פתרון ABC 0.1 M PB (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 לשעה בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).
4. כתם הסעיפים בתמיסה המכילה 0.02 נקודות % 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ו- 0.01% H₂O₂ במאגר טריס 50 מ מ, כ- 2-5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 50 מ מ טריס מאגר (pH 7.4).
6. הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות טכניקות פתולוגיה סטנדרטי (איור 1T; ראה משלימה השלישי קובץ וידאו, זלוף ומקטעים).
7. יבש הסעיפים באוויר הלילה בטמפרטורת החדר.
8. מייבשים את המקטעים בקצרה בסדרה של אלכוהול (50%, 70%, 95%, 100%) פתרונות. להטביע את השקופיות כל פתרון עבור-15 s. אל תאפשר את השקופיות להתייבש בין שלב לשלב.
9. נקה בסעיפים קסילן שלוש פעמים, בערך 20 דקות.
10. לשים הפרוסות 2 או 3 טיפות בלזם ואז במקום coverslips על הסעיפים.

4. צביעת פלורסנט כפול BDA ולא בסיסיות עצביים רכיבי בתוך קליפת המוח

הערה: לעומת זאת, צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, אלמנטים בסיסיים עצבית על הסעיפים סמוכים לעיל להשתמש עם streptavidin-AF594, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525.

1. לשטוף בסעיפים PBS 0.1 M עבור-1 דקות.
2. דגירה בסעיפים פתרון מעורבות של streptavidin-AF594 (שבערך), AF500/525 ירוק ניאון Nissl הכתם (1:1, 000) ב- PBS 0.1 M (pH 7.4) המכיל 0.3% טריטון X-100 עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב 0.1 M PB (pH 7.4).
4. הר הסעיפים על שקופיות מיקרוסקופ בטכניקות פתולוגיה סטנדרטי. יבש הסעיפים באוויר לשעה בערך.
5. חלות coverslips הסעיפים פלורסנט עם גליצרין 50% במים מזוקקים לפני התצפית.

5. צביעת פלורסנט כפול BDA ו Interneurons של קליפת המוח

הערה: צביעת פלורסנט כפול בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons על הסעיפים נציג את המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, PV-נוגדנים.

1. לשטוף בסעיפים נציג 0.1 M PBS (pH 7.4) במשך כ- 1 דקות.
2. דגירה בסעיפים פתרון חסימה המכיל סרום עז רגיל 3% ו- 0.3% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS למשך 30 דקות.
3. להעביר את המקטעים לתוך פתרון של העכבר monoclonal אנטי-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז נורמלי סרום ו- 0.3% טריטון X-100 נלון ב 4 º C.
4. למחרת, לשטוף את המקטעים שלוש פעמים ב- PBS 0.1 M (pH 7.4).
5. לחשוף את הסעיפים פתרון מעורבות של עז אנטי-mouse-AF488 משני נוגדנים (שבערך), streptavidin-AF594 (שבערך) ו 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי, 1:40, 000) בנסיוב 0.1 M PBS (pH 7.4) המכיל 1% עז רגילה 0.3% טריטון X-100 לשעה.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5.

6. תצפית

1. קח תמונות של VPM, thalamocortical אקסונים, corticothalamic נוירונים.
   1. להתבונן הדגימות פלורסנט עם מערכת הדמיה קונאפוקלית מצויד עם מטרות עדשות (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95). השתמש אורכי הגל עירור, פליטה של 405 (ירוק) (כחול), 488 ננומטר (אדום) 559.
      הערה: כאן חריר קונאפוקלית זה 152 מיקרומטר (4 x, 10 x) ו- 105 מיקרומטר (40 x). הרזולוציה המרחבית של לכידת התמונה הוא 1024 × 1024 פיקסלים (4 x, 10 x) 640 × 640 פיקסל (40 x).
   2. סעו עשרים תמונות במסגרות רצופים של 2 מיקרומטר כל סעיף בעובי של 40 µm (סדרת Z).
   3. לשלב התמונות תמונה אחת בפוקוס בתמונה קונאפוקלית עיבוד מערכת תוכנה לניתוח תלת מימדי כדלקמן: התחל קבע במישור המוקד ← סוף קבע במישור המוקד ← שלב הגדרת גודל ← לבחור עומק דפוס ← תמונת לכידת ← Z סדרות.
2. לקחת תמונות brightfield על ידי מיקרוסקופ אור מצויד with a מצלמה דיגיטלית (4 x, נה: 0.13; 10 x, נה: x 0.40; ל-40, נה: 0.95 עדשות). השתמש את זמן החשיפה של גב' 500 להשתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי להתאים את הבהירות והחדות של התמונות להוסיף תוויות.

תוצאות

הישרדות של 10 ימים שלאחר הזרקה של BDA לתוך VPM היה מספיקות לייצור אינטנסיבי עצבית תיוג על אזורים קורטיקליים המתאימים חולשת לצד הזרקה (איור 2). קונבנציונלי ABC והן פלורסנט מכתימה את ההליכים עבור BDA חשף דפוס דומה של תיוג עצבית על ו- S1, כולל anterogradely הנקרא thalamocortical אקס...

Discussion

בחירת מכשיר מעקב ראוי הוא שלב קריטי עבור ניסוי מוצלח עקיבה עצבית. במשפחה של BDA, משקל מולקולרי גבוה BDA (משקל מולקולרי 10,000) הומלץ מעדיפים להיות מועבר דרך מסלול עצבי anterograde בניגוד נמוך משקל מולקולרי BDA (משקל מולקולרי 3,000)^{2,3 , 11 , 12}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain	Molecular Probes	N21480	Protect from light
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Confocal imaging	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop and Illustration	Adobe	CS5