Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine raffinierte Protokoll um effektiv biotinylierte Dextran Amin (BDA) Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Färbung Methode durch eine wechselseitige neuronale Weg zu offenbaren. Es ist geeignet für die Analyse der Feinstruktur des BDA Etikettier- und unterscheidet sie von anderen neuralen Elemente unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop.

Zusammenfassung

Hochmolekularen biotinylierte Dextran Amin (BDA) hat seit vielen Jahrzehnten als hochsensible neuroanatomischen Tracer verwendet worden. Da die Qualität der Beschriftung durch verschiedene Faktoren, die hier betroffen war bieten wir eine raffinierte Protokoll für die Anwendung des hohen Molekulargewichts BDA für optimale neuronale Kennzeichnung in das zentrale Nervensystem zu studieren. Nach Stereotaktische Injektion von BDA in den ventralen Posteromedial Kern (VPM) des Thalamus bei der Ratte durch eine zarte Glaspipette war BDA mit fluoreszierenden Streptavidin-Alexa (AF) 594 befleckt und counterstained mit fluoreszierenden Nissl Fleck AF500/525. Auf dem Hintergrund der grünen Nissl Färbung die roten BDA Kennzeichnung, einschließlich der neuronalen Zellkörpern und axonalen Terminals, deutlicher im somatosensorischen Cortex zeigte. Darüber hinaus verdoppelt fluoreszierende Färbung für BDA und die Kalzium-bindenden Proteins Parvalbumin (PV) wurde durchgeführt, um die Korrelation von BDA Kennzeichnung und PV-positiven Interneuronen im kortikalen Ziel, bietet die Möglichkeit, die lokale neuronale studieren zu beobachten Schaltungen und deren chemischen Eigenschaften. Also, diese raffinierte Methode eignet sich nicht nur zur Visualisierung von hochwertigen neuronale Markierung mit hohem Molekulargewicht BDA durch gegenseitige Nervenbahnen zwischen Thalamus und Großhirnrinde, aber auch erlauben die gleichzeitige Vorführung von andere neuronale Marker mit fluoreszierenden Histochemie oder Immunchemie.

Einleitung

Hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht), eine hochempfindliche Tracer für tracing Nervenbahnen in das Zentralnervensystem für über 20 Jahre¹verwendet worden. Obwohl die Verwendung des BDA eine gemeinsame neuronale Trakt tracing Technik, kann die Qualität der BDA Kennzeichnung bei Tieren durch verschiedene Faktoren^1,2,3beeinflusst werden. Unsere aktuelle Studie darauf hingewiesen, dass die optimale Struktur der BDA Beschriftung ist nicht nur eine richtige nach der Injektion Überlebenszeit zugeordnet, sondern auch mit der Färbung Methode^{4 korreliert}. Bis jetzt, konventionelle Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC), Streptavidin-Fluorescein erfolgt und Streptavidin-AF594 dienten Färbung Methoden zur Aufdeckung der BDA Kennzeichnung in früheren Studien^{2,3, 4,5}. Im Vergleich dazu kann fluoreszierende Färbung für BDA einfach durchgeführt werden.

Um die Anwendung der hochmolekularen BDA zu verlängern, wurde in der vorliegenden Studie eine raffinierte Protokoll eingeführt. Im Anschluss an die Injektion von BDA in der VPM des Thalamus im rattengehirn war BDA Kennzeichnung, offenbart durch die reguläre Methode der standard ABC Färbung sowie durch doppelte fluoreszierende Färbung, die für die Beobachtung der Korrelation der BDA Kennzeichnung durchgeführt wurde und einfach neuralen Elemente oder Interneuronen im kortikalen Ziel mit Streptavidin-AF594 und fluoreszierende Nissl Histochemie oder PV-Immundiagnostik, beziehungsweise. Durch die gegenseitige Nervenbahnen zwischen VPM und die primären somatosensorischen Cortex (S1)^6,7,8konzentrierten wir uns unsere Beobachtung auf BDA Kennzeichnung in die Thalamocortical projiziert Axone und corticothalamic projizierte Zelle Somas in der S1. Durch diesen Prozess voraussichtlich nicht nur ein detailliertes Protokoll für den Erhalt der hohen Qualität der neuronalen Etikettieren mit hohem Molekulargewicht BDA, sondern auch eine raffinierte Protokoll über die Kombination von fluoreszierenden BDA Kennzeichnung und andere fluoreszierende neuronale Marker mit Histochemie oder Immunchemie. Dieser Ansatz ist vorzuziehen, den lokalen neuronale Schaltkreise und ihre chemischen Eigenschaften unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie zu studieren.

Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission an der China Academy of chinesische Medical Sciences (Referenznummer 20160014) genehmigt. Alle Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (nationale Akademie-Presse, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Vier Erwachsene männlichen Ratten (Gewicht 250-280 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere waren untergebracht in einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit, und erlaubt freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Instrumente und Materialien in der vorliegenden Studie wurden in Abbildung 1gezeigt.  Vor der Operation wurden alle Instrumente, wie z. B. stereotaktischen Rahmen und Glaspipette, mit 70 % igem Ethanol gereinigt.

1. chirurgische Eingriffe

1. Bestimmen Sie die Koordinaten Interessengebiet im VPM mit einer stereotaktischen Atlas⁹ (Abbildung 2A).
2. Bereiten Sie eine 1 µL Mikro-Spritze mit einem Glas Mikropipette (mit einen Durchmesser von ca. 10-20 µm) ausgestattet (Abbildung 1) und testen Sie es mit flüssigem Paraffin.
3. Die Ratten mit 7 % Chloral Hydrate (0,7 mL/100 g) durch intraperitoneale Injektion zu betäuben.
4. Wenn Tiefe Narkose bestätigt ist Schwanz Kneifen und pedal Rückzug Reflex, oben auf den Kopf des Tieres mit einen elektrischen Rasierapparat rasieren und schrubben der Operationsstelle 3 Mal mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % igem Ethanol bzw..
5. Legen Sie die Ratte in der stereotaktischen Gerät indem man stumpfes Ohr Bars in den Ohren und legen Sie die Ratte oberen Schneidezähne in den Mund-Halter (Abbildung 1E) und dann tragen Sie ophthalmologischen Salbe auf die Augen auf.
6. Reinigen Sie die Kopfhaut von der Operationsstelle erneut mit 70 % igem Ethanol. Verwenden Sie sterile OP-Handschuhe und Handtücher um den Eingriff unter sterilen Bedingungen beizubehalten.
7. Machen Sie einen sagittalen Schnitt in der Haut mit einem Skalpell entlang die sagittale Naht (Abb. 1F).
8. Kratzen Sie die Muskeln und Knochenhaut Weg von den Schädel mit sterilen Baumwolle Spitze Applikatoren während der Operation zu Blutungen (Abb. 1F) kontrollieren.
9. Verwenden vordefinierte Koordinaten aus einem Atlas (Abbildung 2A), bestimmen Sie den Speicherort (-3,30 mm Bregma Punkt, 2,6 mm rechts zur Mittellinie) der Kraniotomie (Abbildung 1).
10. Durchführen einer Kraniotomie mit einem Grat-Bohrer mit einer Runde-Tip-Spitze (#106) (Abbildung 1 H) und weiter über eine 1 mm tiefe Bohrungen innerhalb von ein paar Minuten bis zum Erreichen der Hirnhaut (Abbildung 1I).
11. Verbrauchssteuern der Dura Mater mit mikrozangen der Großhirnrinde über der Einstichstelle (Abbildung 1I) verfügbar zu machen.
12. Flüssiges Paraffin in der Mikro-Spritze mit 10 % BDA (10.000 Molekulargewicht, in destilliertem Wasser) Lösung (Abbildung 1J) zu ändern.
13. Montieren Sie die Spritze in den Apparat der Mikroinjektion und verbinden mit einer Mikro-Pumpe (Abbildung 1 K).
    Hinweis: Das Volumen injiziert ist abhängig von der Geschwindigkeit der Mikro-Pumpe. Hier war es 30 nL/min (Abbildung 1 L) angepasst.
14. Legen Sie unter einem Stereomikroskop ein Glas Mikropipette manuell mit der Mikroinjektion Apparat in der VPM durch die kortikalen Oberfläche des Gehirns auf die Tiefe von 5,8 mm (Abbildung 1 M).
15. Druck-Spritzen 100 nL 10 % BDA in der VPM über einen Zeitraum von 3 min (35 nL/min) mit einer Mikro-Pumpe (Abbildung 1 L, M).
16. Bewahren Sie nach der Injektion die Pipette für eine zusätzliche 5 min und dann zurückziehen Sie langsam.
17. Naht der Wunde mit sterilen Faden (Abbildung 1N). Folgen Sie Ihren lokalen Tierpflege Ausschuss Leitlinien für Prä- und postoperative Analgesie.
18. Legen Sie die Ratte in eine warme Recovery-Bereich, bis es Bewusstsein wiedererlangt und ist vollständig erholt.
19. Die wiederhergestellten Ratte zurück in seinen Käfig zurück.

(2) Perfusionen und Abschnitte

1. Spritzen Sie nach einer Überlebenszeit von in der Regel 10 Tage das Tier mit einer Überdosis von 10 % Urethan (2 mL/100 g) durch intraperitoneale Injektion, Euthanasie zu induzieren.
2. Durchspülen der experimentellen Ratten in der Haube (Abbildung 1O).
   1. Wenn der Atem aufhört, mit Schere und Pinzette, der Brusthöhle der Ratte Herzen Zugang zu öffnen. Legen Sie einen intravenöse Katheter in die linke Herzkammer in die Aorta, und öffnen Sie dann die Rechte Ohrmuschel.
   2. Zuerst durchspülen mit 0,9 % Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei physiologischen Temperatur (37 ° C) ca. 1-2 min. bis das Blut aus dem Herzen ist klar, und dann weiter mit 250-300 mL 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH 7.4).
3. Einschneiden Sie nach der Perfusion der Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel zu und dann die Ratte Gehirn sezieren. Post-fix sezierten Gehirns bei 4 % Paraformaldehyd für 2 h bei Raumtemperatur (26 ° C), dann Cryoprotect in 30 % Saccharose mit 0,1 M PBS-Puffer (pH 7,4) für 3 Tage bei 4 ° C bis das Gehirn in die Lösung (Abbildung 1 P) eingetaucht ist.
4. Sobald das Gehirn in die Lösung eingetaucht wird, unterteilen Sie das Gehirn in drei Blöcke in den koronalen Richtung auf die Gehirn-Matrizen (Abbildung 1Q). Der Mittelbau enthält die VPM und S1.
5. Schneiden Sie der Mittelbau des Gehirns auf 40 µm auf einer eisigen Bühne Schiebesystem Mikrotom in den koronalen Richtung. Sammeln Sie diese geordnete Abschnitte in einem 6-Well-Teller mit 0,1 M PBS (pH 7,4) (Figuren 1R, S).

3. standard ABC Färbung

Hinweis: Frei schwebende Abschnitte von jedem dritten Koronaler Abschnitt des Gehirns dienten zur Visualisierung der BDA-Etikettierung mit standard ABC Verfahren¹⁰.

1. Spülen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS für ungefähr 1 Minute.
2. Brüten in den Abschnitten 1 % ABC Lösung in 0,1 M PB (pH 7,4) mit 0,3 % Triton x-100 für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4).
4. Färben Sie die Abschnitte in einer Lösung mit 0,02 % 3, 3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) und 0,01 % H₂O₂ in 50 mM Tris-Puffer für ca. 2-5 min bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4).
6. Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit standard-histochemische Techniken (Abbildung 1 t; siehe Ergänzende Video Datei III, Perfusion und Abschnitte).
7. Trocknen Sie die Abschnitte in der Luft bei Raumtemperatur über Nacht.
8. Entwässern Sie die Abschnitten kurz in einer Reihe von Alkohol (50 %, 70 %, 95 %, 100 %)-Lösungen. Tauchen Sie die Folien in jede Lösung für ca. 15 s. Lassen Sie sich nicht die Folien zwischen den einzelnen Schritten austrocknen.
9. Deaktivieren Sie die Abschnitte in Xylol dreimal, ca. 20 Minuten.
10. Legen Sie 2 oder 3 Tropfen Balsam auf die Scheiben dann legen Sie Deckgläsern auf den Abschnitten.

4. doppelte fluoreszierende Färbung für BDA und neuronale Grundelemente in der Großhirnrinde

Hinweis: im Gegensatz dazu doppelte fluoreszierende Färbung erfolgte für die Beobachtung der Korrelation der BDA Beschriftung und neuronale Grundelemente auf den angrenzenden Abschnitten zu den oben genannten mit Streptavidin-AF594 und counterstained mit fluoreszierenden Nissl Fleck AF500/525.

1. Spülen Sie die Abschnitte in 0,1 M PBS für ungefähr 1 Minute.
2. Inkubieren Sie die Abschnitte in einer gemischten Lösung von Streptavidin-AF594 (1: 500) und AF500/525 grün fluoreszierenden Nissl Fleck (1:1 000) in 0,1 M PBS (pH 7,4) mit 0,3 % Triton x-100 für 2 h bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in 0,1 M PB (pH 7,4).
4. Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit standard-histochemische Techniken. Trocknen Sie die Abschnitte in der Luft für ca. 1 h.
5. Die fluoreszierende Abschnitte mit 50 % Glycerin in destilliertem Wasser vor Beobachtung Deckgläsern zuweisen.

5. doppelte fluoreszierende Färbung für BDA und Interneuronen in der Großhirnrinde

Hinweis: Doppelte fluoreszierende Färbung für die Beobachtung der Korrelation von BDA Kennzeichnung und Interneurone auf den repräsentativen Abschnitten im kortikalen Ziel mit Streptavidin-AF594 und PV-Immundiagnostik durchgeführt wurde.

1. Spülen Sie die repräsentative Abschnitte mit 0,1 M PBS-Puffer (pH 7,4) für ca. 1 min.
2. Inkubieren Sie die Abschnitte in einer blockierenden Lösung mit normalem ziegenserum 3 % und 0,3 % Triton x-100 in 0,1 M PBS für 30 Minuten.
3. Übertragen Sie die Abschnitte in einer Lösung von Maus monoklonalen Anti-PV IgG (1:1 000) in 0,1 M PBS (pH 7,4) mit 1 % normalem ziegenserum und 0,3 % Triton x-100 für eine Nacht bei 4 ° C.
4. Am folgenden Tag waschen Sie die Abschnitte dreimal in 0,1 M PBS (pH 7,4).
5. Setzen Sie die Teile zu einer gemischten Lösung der Ziege anti-mouse-AF488 Sekundärantikörper (1: 500), Streptavidin-AF594 (1: 500) und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI, 01:40, 000) in 0,1 M PBS (pH 7,4) mit 1 % normalem ziegenserum und 0,3 % Triton X-100 für 1 h.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5.

6. Beobachtung

1. Nehmen Sie Bilder von den VPM Thalamocortical Axone und Corticothalamic Neuronen.
   1. Beobachten die fluoreszierenden Proben mit einem konfokalen imaging System ausgestattet mit Zielen-Objektive (4 X, NA: 0,13; 10 X, NA: 0,40; und 40 X, NA: 0.95). Anregung und Emission Wellenlängen von 405 (blau), 488 (grün) und 559 nm (rot) zu verwenden.
      Hinweis: Hier ist die konfokale Lochkamera 152 µm (4 X, 10 X) und 105 µm (40 X). Die räumliche Auflösung der Bilderfassung ist 1024 × 1024 Pixel (4 X, 10 X) und 640 × 640 Pixel (40 X).
   2. Jeder Abschnitt in der Dicke von 40 µm (Z-Serie) entnehmen Sie zwanzig Bilder in aufeinander folgenden Frames von 2 µm.
   3. Integrieren Sie die Bilder in ein Einzelbild im Fokus mit der konfokalen Bildverarbeitungs-Software-System für die dreidimensionale Analyse wie folgt: Set Start Brennebene → Ende gesetzt Brennebene → Schritt setzen Größe → Tiefe Muster → Image Capture → Z Serie wählen.
2. Hellfeld-Bilder von einem Lichtmikroskop, ausgestattet mit einer digitalen Kamera zu nehmen (4 X, NA: 0,13; 10 X, NA: 0,40; und 40 X, NA: 0,95-Objektive). Verwenden Sie eine Belichtungszeit von 500 ms Verwendung Foto-Bearbeitungs-Software, Anpassung von Helligkeit und Kontrast der Bilder und Beschriftungen hinzufügen.

Ergebnisse

Überleben der 10 Tage Post Einspritzung von BDA in der VPM war ausreichend für die Herstellung von intensiven neuronalen Kennzeichnung auf den entsprechenden kortikalen Areale ipsilateral zur Injektion Seite (Abbildung 2). Sowohl konventionelle ABC und fluoreszierende Färbung Verfahren für BDA offenbart das ähnliche Muster der neuronalen Beschriftung auf der S1, einschließlich Anterogradely mit der Bezeichnung Thalamocortical Axone und doppelthebel mit ...

Diskussion

Auswahl einer richtigen Tracers ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche neuronale Ablaufverfolgung Experiment. In der Familie der BDA, hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht) wurde empfohlen, bevorzugt durch die Anterograde neuronalen Signalweg im Gegensatz zu niedermolekularen BDA (3.000 Molekulargewicht)^2,3 transportiert werden ^{, 11 , 12 , 13}....

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain	Molecular Probes	N21480	Protect from light
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Confocal imaging	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop and Illustration	Adobe	CS5