JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מערכת cocultivation הידרופוני שתואר תומך צמחים שלם עם מסכי רשת מתכת cocultivates אותם עם חיידקים. רקמות הצמח, חיידקים, ומולקולות מופרדים אז ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים במורד הזרם, בו זמנית מאפשר תגובות מולקולריות של שני המארחים צמח אינטראקציה חיידקים או microbiomes להיחקר.

Abstract

עיצוב ניסיוני המחקה טבעי אינטראקציות צמח חיידק חשוב מאוד כדי לתכנן את הצמח מורכב מיקרובי אותות תהליכים. Thaliana ארבידופסיס - tumefaciens Agrobacterium מספק מערכת מודל מעולה ללמוד פתוגנזה חיידקי אינטראקציות צמח. מחקרים קודמים של אינטראקציות צמח -אגרוקטריום הסתמכו במידה רבה על תרבויות ההשעיה של תא הצמח, על הפגיעה המלאכותית של צמחים, או על ההשראה המלאכותית של גורמי ארסיות מיקרוביאליים או על ידי הגנת צמחים על ידי כימיקלים סינתטיים. עם זאת, שיטות אלה נבדלים איתות טבעי planta , שבו צמחים ומיקרובים לזהות ולהגיב נימוסים מרחביים וזמניים. עבודה זו מציגה מערכת cocultivation הידרופוני שבו צמחים שלם נתמכים על ידי רשתות רשת מתכת cocultivated עם Agrobacterium . במערכת זו cocultivation, אין phytohormone סינתטי או כימיים המפעילה micrהשמנת יתר obial או הגנת הצומח הוא הוסיף. מערכת cocultivation הידרופוני דומה מקרוב אינטראקציות צמחיות צמחיות איתות הומאוסטזיס ב planta . שורש הצמח יכול להיות מופרדים מן המדיום המכיל Agrobacterium , ואת איתותים ותגובות של המארחים צמח ואת החיידקים אינטראקציה ניתן לחקור בו זמנית באופן שיטתי. בכל נקודת זמן נתונה / מרווח, רקמות צמחיות או חיידקים ניתן לקצור בנפרד עבור ניתוחים שונים "omics", הוכחת כוח ויעילות של מערכת זו. מערכת ההידרופיקציה הידרופונית יכולה להיות מותאמת בקלות ל:) 1 (איתות הדדי של מערכות שונות של חיידקים צמחיים,) 2 איתות בין המארח הצמח ובין מיני חיידקים מרובים ( כלומר, קונסורציום מיקרוביאלי או מיקרוביומות,)) 3 כיצד נוטלים חומרים מזינים וכימיקלים ב מיקרוביאלי איתות צמח, ו 4) איך microbes אינטראקציה עם המארחים צמח ולתרום צמח סובלנות כדי ביו oR מדגיש אביוטי.

Introduction

צמחים הקשורים חיידקים לשחק תפקידים חשובים ביוגיוכימיים רכיבה, bioremediation, הפחתת שינויי האקלים, צמיחה צמחים ובריאות, סובלנות הצמחים כדי מדגיש ביוטי ו מדגיש. מיקרואורגניזמים אינטראקציה עם צמחים הן ישירות דרך הצמח הקיר תא הקיר קשר בעקיפין באמצעות הפרשה כימית איתות 1 , 2 , 3 . כמו אורגניזמים נייחים, צמחים פיתחו מנגנונים ישירים ועקיפים להתנגד זיהום על ידי פתוגנים. ההגנות הישירות כוללות הגנה מבנית והבעה של חלבונים להגנה, ואילו הגנות עקיפות כוללות ייצור מטבוליט של צמחים משניים ואטרקציה של אורגניזמים הנגרמים לפטוגנים פולשים 4 , 5 . נגזרות שורש צמחים, הפרשות, mucilages, mucigel, ו lysates לשנות את התכונות הפיסיקליות-כימיות של הריזופירה כדי למשוך או להדוףחיידקים לקראת המארחים שלהם 6 . ההרכב הכימי של הפרשת שורש הוא מינים ספציפיים, ובכך לשמש מסנן סלקטיבי המאפשר מיקרואורגניזמים מסוימים המסוגלים לזהות תרכובות כאלה לפרוח בתוך הריזופירה 6 . לפיכך, מינים מיקרוביאליים תואם עשוי להיות מגורה כדי להפעיל ולהגדיל את האסוציאציות שלהם, או לטובת או נזק של המארח צמח 1 .

הבנת האינטראקציות בין צמחים במיקרוסקופ היא הרקע לשיפור התפוקה של הצמח ותפקוד המערכת האקולוגית, שכן רוב החשיפה המיקרוביאלית והכימית מתרחשת במבנה השורש ובממשק הקרקע-קרקע 2 , 6 , 7 , 8 . עם זאת, בחינת האינטראקציות בין צמחים תת-קרקעיים ותגובות גומלין הייתה אתגר בשל סקרנותה טבע דינאמי מורכב וחוסר מודלים ניסיוניים מתאימים עם מבנה שורש טבעי ומורפולוגיה של צמחים בתנאי צמיחה מבוקרים היטב. בתור אחד phytopathogens ביותר למד, Agrobacterium מדביק מגוון רחב של צמחים עם חשיבות חקלאית וגננות, כולל דובדבן, תפוח, אגס, ענבים, עלה 9 . Agrobacterium הוא אורגניזם מודל חשוב להבנת אינטראקציות בין צמחים פתוגן הוא כלי רב עוצמה בהשתנות צמחים והנדסת הצמחים 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .

צמח מולקולרי - אינטראקציות Agrobacterium נחקרו היטב במשך כמה עשורים, וההבנה הנוכחית של פתוגניות Agrobacterium הוא נרחב 9 ,f "> 11, 15, 16. פתוגניות Agrobacterium מיוחסת במידה רבה ביכולות התפתח שלו לתפוש אותות מן הצומח, וכתוצאה מכך אפנון הקנס של תכנית הארסיות שלה תא אל תא תקשורת, מניין שנקרא חישת 17. Agrobacterium ארסיות התוכנית מוסדר על ידי מספר אותות זמין הרזיוספירה וכולל שתי קבוצות של מערכות 2-רכיב, מערכת ChvG / I ו Vira / G. תנאים חומציים של הריזופירה להפעיל את שעתוק של chvG / I , virA / G , וכן כמה גנים אחרים המעורבים בפתוגניות של Agrobacterium , כולל virE0 , virE1 , virH1 , virH2 , וגנים של מערכת ההפרשה מסוג VI (T6SS) 18. תרכובות פנוליות הנגזרות מן הצמח, כולל אצטוסירינגן (4'-hydroxy-3 ', 5 '-dimethoxyacetophenone), להפעיל את VIRA / G-2 מערכת רכיב באמצעות מנגנוני איתות זרחן 19 . וירא / G ואז מפעיל את כל הרגולציה ויר , וכתוצאה מכך העברה ואינטגרציה של ~ 20 Kb קטע DNA חיידקי שנקרא העברת DNA (T-DNA) מן הגידול שלה (Ti) פלסמיד לתוך גרעין הצמח 16 . T-DNA נושאת גנים האחראים לסינתזה של הורמוני הצמח של חומצה אינדולה -3 חומצה אצטית ( iaaM ו- iaaH ) ו- cytokinin ( ipt ), ופעם אחת מתבטאת בתאי הצמח, נוצרים כמויות גדולות של phytohormones. התוצאה היא התפשטות רקמות חריגה וצמח גידול הגידול, המכונה מחלת כתר הכתר, שהוא בעיה כרונית ו resurgent עבור צמחים 9 , 11 , 20 . רשות העתיקות פועלת גם יחד עם חומצה סליצילית וחומצה גנטית-אמינו בוטירית כדי להדחיק את האלימות של הג'רובקטריום או להפחית את Agrobacteriu (QS) 17 , 21 , 22 . כדי להתמודד עם דיכוי זה, T-DNA גם נושאת גנים עבור ביוסינתזה opine, אשר מפעילה Agrobacterium מניין חישה כדי לקדם פתוגניות Agrobacterium וגם משמש כמקור מזין הפתוגן 22 , 23 .

למרות הבנה מעמיקה הכוללת של אינטראקציות Agrobacterium- plant ואת העברת ה- T-DNA כתוצאה אל המארח צמח, האירועים איתות מורכבים בשלב הראשוני של האינטראקציה הם הבינו פחות טוב. זה בחלקו בשל המגבלות של גישות קונבנציונאלי לחקור Agrobacterium- Plant האות. תא צמחים ההשעיה תרבויות מלאכותית באתר ספציפי הפציעה משמשים בדרך כלל ללמוד אינטראקציות מולקולרית צמח מיקרובי 24 ,Ef "> 26 , 27. עם זאת, המתלים התא חסר מורפולוגיה צמחית טיפוסית, בפרט, תאים ההשעיה המפעל אין מבנים שורש שורש exudates, אשר חשובים מאוד להפעלת chemotaxis מיקרוביאלית ארסיות 28 , 29. תחזוקה של מורפולוגיה הצמח ואת מבנה השורש כבר מטופל על ידי צמחים הפציעה באופן מלאכותי, אשר מאפשר זיהום באתר ספציפי, וכתוצאה מכך איתור של גנים הקשורים להגנת הצמחים הקשורים צמח רקמות נגוע ישירות 30 , 31. עם זאת, הפגיעה מלאכותית שונה באופן משמעותי מפני זיהום הפתוגן בטבע , במיוחד הפצע מוביל הצטברות חומצה jasmmonic (JA), אשר באופן שיטתי מפריע איתות צמח טבעי הגנה 26. בנוסף, כימיקלים סינתטיים משמשים בדרך כלל כדי לגרום באופן מלאכותי צמח המארח תגובותאו ארסיות פתוגן. למרות תוסף של חומרים כימיים כגון רפלקטיביים של ריכוזים ב Planta אפשרי, תוסף כזה אינו מסביר את הפיזור של שורש exudates בהדרגה לתוך הריזופירה שמסביב, אשר מייצר שיפוע chemotactic חשה על ידי חיידקים 28 , 32 . בהינתן המגבלות של גישות קונבנציונליות לחקר האינטראקציות בין צמחים לצמחים, הדיוק והעומק של הנתונים המתקבלים עשויים להיות מוגבלים ומגבילים, והידע הנובע מהגישה הקונבנציונלית עשוי שלא לתרגם באופן ישיר ל- Planta . היבטים רבים של איתות צמחים - Agrobacterium עדיין לא הבנתי במלואה, במיוחד בשלב מוקדם של אינטראקציות, כאשר הסימפטומים המחלה לא פיתחו עדיין.

כדי לתקן את המגבלות של גישות קונבנציונליות, עבודה זו מציגה זול, נשלט היטב, הידרופוני גמיש גמערכת המאפשרת לחוקרים לקבל תובנות מעמיקות יותר לתוך מסלולי האיתות והמענה המורכבים בשלב הראשוני של האינטראקציות בין צמחים מולקולריים למיקרובי. הידרופוניקה כבר בשימוש נרחב כדי ללמוד חומרי הזנה צמח, exudates שורש, תנאי הצמיחה, ואת ההשפעות של רעילות מתכתי על צמחים 33 , 34 . ישנם מספר יתרונות של מודלים הידרופוניים, כולל דרישות מרחביות קטנות, הנגישות של רקמות צמחים שונות, שליטה הדוקה של מזין / תנאים סביבתיים, ואת הדברה / מחלה שליטה. מערכות הידרופוניות גם מגבילות פחות לגידול הצמח בהשוואה לטכניקות ציפוי אגר / phytoagar, אשר בדרך כלל להגביל את הצמיחה לאחר 2-3 שבועות. חשוב לציין, תחזוקת מבנים שלמים של צמחים מקלה על הפרשת השורש הטבעית הדרושה לכימותרזה מיקרוביאלית והשראה ארסית 8 , 29 . המערכת descriהמיטה כאן היא פשוטה יותר ופחות אינטנסיבית מאשר החלופות 33 , 34 . הוא משתמש בפחות חלקים ואינו דורש כלים אחרים מלבד מספריים סטנדרטיים. היא משתמשת רשת מתכת (בניגוד ניילון 33 ) כתמיכה חזקה לצמיחה צמחים שיטה פשוטה של ​​אוורור בתנאים סטריליים דרך רועד לתמוך צמיחה מיקרוביאלית. בנוסף, המערכת יכולה להשתמש רשת מתכת בגדלים שונים כדי לתמוך בצמח הצמיחה, אשר מתאים מיני צמחים שונים מבלי להגביל את רוחב השורשים שלהם.

במערכת cocultivation הידרופוני המוצג כאן, צמחים מעובדים במערכת הידרופוני סטרילית שבה שורשי הצמח להפריש תרכובות אורגניות התומכות בצמיחה של חיידקים מחוסן. במערכת זו cocultivation, חומרים כימיים מלאכותיים, כגון הורמונים צמחיים, מעניק הגנה, או כימיקלים הממריצים ארסיות, הם משלימים, אשר משקף את התא הטבעי- סיגנל הומיאוסטזיס במהלך אינטראקציות של צמח חיידקי. עם מערכת cocultivation הידרופוני זה, ניתן היה לקבוע ביטוי גנים בו זמנית ברקמת השורש ארבידופסיס thaliana Col-0 על זיהום על ידי Agrobacterium, כמו גם הפעלת גנים Agrobacterium על cocultivation עם ארבידופסיס. הוכח עוד יותר כי מערכת זו מתאימה ללמוד Agrobacterium מצורף לשורשים צמח, כמו גם את הפרופיל rootome שורש הצמח, על cocultivation (זיהום) עם Agrobacterium ( איור 1 ).

figure-introduction-9020
איור 1: סקירה של מערכת Cocultivation הידרופוני, עם ניתוח דוגמאות. צמחים גדלים על גבי הרשת (יורה מעל הרשת), עם השורשים שקועים במדיום הידרופוני כי הוא מחוסן אז עם חיידקים ואו coculture. רקמות הצמח החיידקים מופרדים אז לחילוץ וניתוחים בו זמנית. נתון זה שונה מהמלצה 35 .

Protocol

1. תכנון ניסיוני

  1. קבע את היעדים הספציפיים של הניסוי.
  2. קרא את הפרוטוקול כולו להלן. לקבוע אילו חלקים רלוונטיים למטרות הספציפיות ואם יש צורך בשינויים כלשהם. ראה להלן דוגמאות.
    1. שקול אם הניסויים ישתמשו צמחים א thaliana ו tumfaciens A. חיידק, כמו להלן, או שילוב אחר צמח מיקרובי.
      הערה: בעוד מיני צמחים שונים ניתן להשתמש, עובי של שורשי הצמח עשויים לדרוש רשת בגודל שונה (שלב 3.3), ואת הפרמטרים צמיחה (3.10-3.11, ו -4.4) ואת גודל המיכל הידרופוני נפח בינוני (צעד 4.2) עשויים גם דורשים התאמה ( איור 2 ). חיידקים יכולים בקלות להיות מחוסן כמו תרבויות טהורות, מינים מעורבים (קונסורצייה), או מדגימות סביבתיות (microbiomes), אבל כל השינויים יכולים להשפיע על הפרוטוקול, במיוחד שלב 4.5.
    2. שקול אתסוגי ניסויים שישמשו לניתוח הדגימות.
      הערה: מיקרוסקופ פלואורסצנטי (שלב 5) דורש אורגניזמים כי הם מתויגים עם כתב כתב פלואורסצנטי.
  3. תכנון בקרות מתאימות. כלול טנקים הידרופוניים ללא שתילים כי הם מחוסן עם חיידקים שליטה וטנקים עם שתילי שליטה שאינם מחוסן עם חיידקים.
  4. תכננו ניסויים במספר המתאים של זרעים וטנקים הידרופוניים. שקול שולט, משכפל ביולוגי (3 לכל הפחות), ואת כמויות של רקמות נדרש עבור כל הניתוחים.
  5. לקבוע את אורך המתאים cocultivation עבור מטרות הניסוי (שלב 4.8).
  6. בצע את השלבים הבאים, בהתאם לצורך.

figure-protocol-1907
איור 2. דוגמאות של צמחים אחרים שיכולים להיות מטופחים במערכת הידרופוני, נתמך על ידי P הפלטפורמה של רשת מתכת. תאימות של קבוצה של רשתות מתכת עבור מגוון רחב של זרעי צמחים וטיפוח. ( A ) פלדת אל חלד סוג 304 weldmesh 3 × 3 רשת × .047 "חוט Dia עבור Vicia faba . ( ב ) נירוסטה סוג פלדה 304 weldmesh 4 × 4 רשת × 0.335" חוט דיה עבור Zea mays . ( C ) סוג פלדה נירוסטה 304 weldmesh 4 × 4 רשת × × 0.30 "חוט דייה עבור גליצין מקסימום (סויה) ( ד ) נירוסטה סוג פלדה 304 weldmesh רשת 6 × 6 × 0.047" חוט Dia עבור Raphanus sativus (חורף צְנוֹן). ( E ) סוג פלדה נירוסטה 304 weldmesh 6 × 6 רשת × .047 "חוט דיה עבור Triticum spp. ( F ) סוג פלדה נירוסטה 304 weldmesh 6 × 6 רשת × .035" חוט דיה עבור Cucumis sativus . נתון זה שונה מהמלצה 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. הצמח זרע משטח עיקור

  1. וורטקס (במהירות גבוהה) כ 200 זרעים של תליאנה א עם 500 μL של מים deionized בצינור microcentrifuge. עבור מיני צמחים עם זרעים גדולים יותר, להשתמש בצינור גדול כדי להקל על עיקור פני השטח.
  2. צנטריפוגה זה בסביבות 9,000 XG במשך 30 s ב microcentrifuge השולחן למעלה. הסר את המים (supernatant) באמצעות פיפטה.
  3. הוסף 300 μL של 2% hypochlorite נתרן זרעים ו מערבולת. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות. עבור מיני צמחים עם זרעים גדולים יותר, להשתמש בכמויות גדולות יותר כדי לכסות את הזרעים.
  4. צנטריפוגה ב כ 9,000 XG במשך 30 s בראש microcentrifuge השולחן. הסר את הפתרון hypochlorite נתרן באמצעות פיפטה.
  5. הוסף 500 μL של מים סטריליים, deionized זרעים ו מערבולת. צנטריפוגה ב כ 9,000 XG עבור30 ים ולהסיר את המים באמצעות פיפטה סטרילית.
  6. חזור על שלב 2.5 ועוד 4 פעמים.
  7. הוסף 500 μL של 70% אתנול זרעים ו מערבולת. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות.
  8. צנטריפוגה ב כ 9,000 XG במשך 30 s בראש microcentrifuge השולחן. הסר את אתנול 70% באמצעות פיפטה.
  9. חזור על שלב 2.5 5 פעמים נוספות.
  10. Resuspend הזרעים מעוקרים 500 μL של מים סטרילי, ultrapure.

3. זרע זרע ו Semi- מוצק טיפוח של צמחים

  1. הכן מורשיגה מוצק למחצה ו סקוג (MS) בינוני: 2.165 גרם / ליטר מלחים בסל; 10 גרם / סוכרוז L; 0.25 גרם / M MES; ו 59 מ"ל / L B5 תערובת ויטמין, pH 5.75, עם 4 g / L phytoagar.
  2. החיטוי בינוני MS. יוצקים 25 מ"ל של אותו לכל צלחת פטרי עמוק סטרילי (100 x 25 מ"מ 2 ).
  3. עבור כל צלחת פטרי, לחתוך 90 x 90 מ"מ מרובע של רשת נירוסטה.
    הערה: הרשת המומלצת עבור A. thaliana < / Em> יש ציון של 304 (כיתה רגילה), ספירת רשת (מספר חורים לכל אינץ 'ליניארי) של 40 x 40, וקוטר חוט של 0.01 "(0.0254 ס"מ) .רבוע רשת גדול יותר נדרש עבור טנקים הידרופיני גדול או פלטפורמות גבוהות יותר.
  4. לכופף את הפינות של כל רשת מרובע רק מספיק כדי להתאים את הרשת בתוך צלחת פטרי. לכופף את הפינות בזווית של 90 ° על חלק הארי של הרשת כדי לאפשר את הרשת להיות נשען על ידי הפינות, משאיר מספיק מקום מתחת לפיתוח שורש ( איור 3 א ).
  5. שים את הריבועים רשת לחתוך בכוס, לכסות עם רדיד אלומיניום, ולעקר על ידי החיטוי באמצעות 30 דקות מחזור יבש.
  6. לאחר המדיום יש התגבש בצלחות פטרי הרשת היא סטרילית, במקום כל מרובע רשת מעוקרת על גבי בינוני חצי מוצק, עם פינות כפופות כלפי מטה.
  7. לדחוף את הרשת כך פינות לחדור בינוני ואת עיקר הרשת נוגע פני השטח העליון של המדיום (> איור 3 ב).
  8. השתמש פיפטה 200 μL העברת כדי לצייר את הפרט מעוקרים זרעי A. thaliana (זרעים יישארו על קצה פיפטה עקב כוח ואקום) בעדינות להעביר כל זרע על גבי הרשת. מניחים את הזרעים כך שהם מרווחים כראוי לצרכים ניסיוניים ( למשל, 4 6 זרעים / צלחת).
  9. חותם את צלחות פטרי עם המכסים, הנחת סרט כירורגי נקבובי סביב הקצוות.
  10. ריבוד הזרעים על ידי הנחת צלחת פטרי כולו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 ד בחושך ( למשל, לעטוף ב tinfoil כדי לדמות החושך.)
  11. לטפח את הזרעים בצלחת פטרי ב 22-24 מעלות צלזיוס עם photoperiod 16 שעות במשך 10-14 ימים ( איור 3 ג ).

figure-protocol-7187
איור 3: הצמח הידרופוני-חיידק מערכת Cocultivation. השמאליתNel מייצג תרשים זרימה המפרט את ששת מפתחות המפתח בהרכבה ותפעול מערכת שיתוף הידרופוני. הפאנל הימני מדגים את חומרי הניסוי בפועל, ציוד, ותהליכים מבצעיים עבור מערכת cocultivation הידרופוני כאשר לומדים אינטראקציות Arabidopsis-Agrobacterium . שלב החיסון והצעד הסופי לדגימת צמחים או חיידקים מוצגים כעת. נתון זה שונה מהמלצה 35 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. הידרופוני Cocultivation המערכת

  1. הכן מורשיגה נוזלי ו Skoog (MS) בינוני: 2.165 גרם / מל MS מלחי הבסיס, 10 גרם / סוכרוז L, 0.25 גרם / M MES, ו 59 מ"ל / L B5 תערובת ויטמין, pH 5.75.
  2. החיטוי בינוני. יוצקים 18 מ"ל של אותו לתוך כל זכוכית גלילית סטרילית או טנק פלסטיק ברור (גבישי כלים, 100 x 80 מ"מ2) עם עפעפיים סטריליים.
    הערה: Presterilize את הטנקים ואת המכסים על ידי עטיפת אותם בנייר אלומיניום חיטוי.
  3. במכסה המנוע זרימה סטרילי, להשתמש במלקחיים סטרילית להעביר בעדינות כל רשת מרובע עם שתילים 10-14 בן יום מן בינוני מוצק למחצה מיכל גלילי הידרופוני ( איור 3 ). אטום את המכסים על הטנקים באמצעות סרט ניתוחי נקבובי.
  4. לטפח את השתילים על הרשת במיכל עבור 72 שעות ב 22-24 מעלות צלזיוס, עם photoperiod 16 שעות ורעד בסל"ד 50 עבור אוורור ( איור 3e ).
    הערה: זה מאפשר לצמחים להסתגל לסביבה הידרופנית לפני חיסון (cocultivation) עם מיקרואורגניזמים. זו תקופת ההמתנה תאפשר גם זיהום חיידקי מקריים להיות ברור לפני החיסון.
    1. התחל את השלב הבא יום לפני סוף תקופת הדגירה.
  5. לגדול א tumefaciens ב AB בינוני(0.5% w / v שמרים תמצית, 0.5% w / v טריפטון, 0.5% w / v סוכרוז, 50 מ"מ MgSO 4 , pH 7.0) ב 28 ° C עם רעד לילה עד התרבות מגיע צפיפות אופטית הסופי של 1.0 ב 600 ננומטר (OD 600 ), כפי שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר, עם בינונית AB בינוני כמו ריק.
    הערה: OD 600 של 1.0 הוא שווה ערך לכ 10 9 תאים / מ"ל.
  6. שטפו את א tumefaciens א שלוש פעמים בהיקף שווה של 0.85% NaCl. Resuspend בנפח שווה של מים סטריליים מזוקקים פעמיים.
  7. לפני החיסון, לבחון את הטנק עם שתילים בזהירות על מנת להבטיח כי אין זיהום; המדיום של הטנקים הלא מזוהמים צריך להיות ברור ושקוף.
    1. מחק כל מיכל עם נוזל מעונן (זיהום) ומספר שאר הטנקים. לדוגמה כמות קטנה (20 μL) של מדיום הידרופוני מכל טנק ממוספר במקום זה על צלחת פטרי מלא מרק Luria (LB). לִדגוֹרהמנה ב 28 ° C.
  8. מיד, להוסיף 50 μL של ההשעיה א tumefaciens (כ 5 x 10 7 תאים, מוערך מן OD 600 ) לתוך כל מיכל הידרופוני ממוספר. Cocultivate שתלי thaliana א ו tumefaciens ב 22-24 מעלות צלזיוס עם 16 שעות photoperiod ו רועד בסל"ד 50 ( איור 3F ).
    1. בדוק את הצלחת LB הבחין משלב 4.7.1. לאחר דגירה 12 ו - 28 כדי לאמת את העוקבות של הטנקים. אם יש זיהום כלשהו, ​​אין להשתמש טנק ממוספרים המתאים (מחוסן עם חיידקים) עבור מבחני במורד נוסף.
  9. אם תרצה, לפקח על הצמיחה של א tumefaciens במרווחי זמן קבועים על ידי הסרת מדגם של המדיום מן הטנק ומדידת OD 600 באמצעות ספקטרופוטומטר עם בינוני מן שליטה inococulated כמו ריק ( איור 4 ).
    לאTE: תסמיני המחלה הצמח צריך להיות ברור לאחר 7 ד ( איור 5 ).
  10. נפרד א שורשי thaliana מן ההשעיה חיידקי על ידי הרמת צלחת רשת; עיתוי שלב זה תלוי בתהליכים במורד הזרם. לפרטים נוספים ראה את השלבים 5-8.
  11. אם באמצעות שורשים עבור ניתוחים הבאים, במהירות לשטוף את השורשים במים מזוקקים פעמיים. אם באמצעות עלה או רקמות אחרות, לחתוך את הרקמה. עבור ניתוח RNA, להמשיך מיד לשלב 7.1.

figure-protocol-11911
איור 4: גידול Agrobacterium במערכת Cocultivation הידרופוני. גידול Agrobacterium בנוכחות או היעדרות של המארח צמח ( Arabidopsis ) היה פיקוח כל 4 שעות. תאים Agrobacterium גדלו ב בינוני בינוני O / N, שטף 3x עם 0.85% NaCl, ו מחוסן למערכת הידרונית, עם או wIthout Arabidopsis שיתוף טיפוח, מתוך OD 600 הראשונים של סביב 0.1. ערכי OD 600 הם האמצעים של שלושה משכפל ביולוגי, עם סטיות תקן ( OD 600 של 1.0 = 1 x 10 9 תאים / מ"ל).

figure-protocol-12630
איור 5: פנטיוטיפים של צמחים מייצגים וסימפטומים של מחלות נצפות במהלך Cocultivation. בתוך 4 ד לאחר חיסון, לא סימפטומים המחלה גלויים ( א ) לעומת צמחים noninoculated ( B ). לאחר 7 ד של Cocultivation (זיהום), תסמיני המחלה נצפים צמחים נגועים ( C ), בעוד צמחים noninoculated להישאר בריאים ( D ).

5. פלואורסצנטי מיקרוסקופיה

  1. השתמש A. tumefaciens מחסה כתב כתב עבור חלבון autofluorescent עבורההתקנה cocultivation בשלב 4.5 .
    הערה: שונה pJP2 פלסמיד להביע pCherry, נגזרת של dsRed 36 , משמש כאן.
  2. בעקבות שיתוף מתאים טיפוח ( למשל, 48 ח) בשלב 4.8, נפרד משני משורשים (ענפים בצד של השורש הראשי) באמצעות מספריים סטריליים.
  3. שוטפים את השורשים במים מזוקקים פעמיים כדי להסיר חומר קשור ברפיון. לצלול כל שורש μL 30 של מים על שקופית מיקרוסקופ לכסות עם coverslip זכוכית.
  4. חותם את הקצוות של coverslip עם לק על מנת למנוע התייבשות של השורשים.
  5. לדמיין את הקובץ המצורף של א tumefaciens כדי A. שורשים thaliana ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    הערה: כאן, מיקרוסקופ confocal עם עירור מן הליום ניאון (He-Ne) 543/594 nm לייזר משמש לדמיין pHherry אדום הקרינה ב 590-630 ננומטר תחת המטרה 63X היפוך במים העדשה עם הצמצם המספרי של 1.4 ( איור 6).

figure-protocol-14485
איור 6: Agrobacterium שורש מצורף, נקבע על ידי מיקרוסקופיה confocal. את pCherry אדום פלואורסצנטי שכותרתו Agrobacterium היה דמיינו ב 590-630 ננומטר, עם עירור של הליום ניאון (He-Ne) 543/594 ננומטר לייזר. ויזואליזציה נערכה תחת המטרה העדשה 63X הפוכה מים עם הצמצם המספרי של 1.4. סולם ברים = 11 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

6. ניתוח תמלילי בקטריאלי

  1. בעקבות שיתוף מתאים שיתוף ( למשל, 8 ח) בשלב 4.8, להפריד את השורשים מן המדיום הידרופוני כמו בשלב 4.9. העברת 1.5 מ"ל של המדיום הידרופוני מיקרו 1.5 מ"לצנטריפוגה צינור צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 2 דקות כדי גלולה התאים.
  2. הסר את supernatant. העברת עוד 1.5 מ"ל של המדיום הידרופוני באותה צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו צנטריפוגות ב 12,000 גרם במשך 2 דקות כדי גלולה התאים.
  3. הסר את supernatant.
    הערה: פרוטוקול יכול להיות מושהה כאן על ידי הקפאת דגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  4. חלץ את ה- RNA מן התאים A. Tumefaciens באמצעות שיטות סטנדרטיות 37 או בידוד מתאים RNA מסחרי טיהור Kit עם טיפול DNase כדי למנוע זיהום DNA.
    הערה: פרוטוקול יכול להיות מושהה כאן על ידי aliquots מקפיא של RNA ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  5. השתמש RNA מבודד עבור מגוון רחב של ניתוחים באמצעות שיטות סטנדרטיות, כולל את הפעולות הבאות.
    1. השתמש microarray מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן כדי לזהות גנים קובע כי הם הביעו באופן דיפרנציאלי cocultivated לעומת שליטהתַרְבּוּת.
    2. השתמש כמותי בזמן אמת Polymerase תגובת שרשרת (qRT-PCR) כדי לזהות את הביטוי של גנים ספציפיים או לאמת נתונים microarray 38 .

7. ניתוח תמלילי צמחים

  1. לאחר cocultivation המתאים ( למשל, 8 ח) בשלב 4.8, להפריד את השורשים מן המדיום הידרופוני, כמו בשלב 4.9, או רקמות אחרות נפרדות לפי הצורך. מיד מקום כ -150 מ"ג של שורשים או רקמת הצמח לתוך חנקן נוזלי.
    הערה: פרוטוקול יכול להיות מושהה כאן על ידי הקפאת דגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. טוחנים את הדגימות קפוא אבקה בחנקן נוזלי באמצעות מרגמה העלי.
  3. חלץ RNA מן אבקה באמצעות שיטות סטנדרטיות 39 או בידוד מתאים RNA מסחרי ערכת טיהור עם טיפול DNase, כדי למנוע זיהום DNA.
    הערה: פרוטוקול יכול להיות מושהה כאן על ידי aliquots מקפיא של רנ"א ב-80 ° C עד לשימוש.
  4. השתמש RNA מבודד עבור מגוון רחב של ניתוחים באמצעות שיטות סטנדרטיות, כולל את הפעולות הבאות.
    1. השתמש microarray מסחרי על פי פרוטוקול של היצרן כדי לזהות גנים קובע כי הם הביעו באופן דיפרנציאלי שיתוף צמח לעומת צמחים שליטה.
    2. השתמש qRT-PCR כדי לזהות ביטוי דיפרנציאלי של גנים ספציפיים או לאמת נתונים microarray 38 .

8. Secretome פרופיל

  1. לאחר שיתוף מתאים שיתוף ( למשל, 72 ח) בשלב 4.8, להפריד את השורשים מן המדיום הידרופוני כמו בשלב 4.9. לעקר את 18 מ"ל של מדיום הידרופוני על ידי העברת אותו דרך מסנן 0.2 מיקרומטר נקבוביות לתוך צינורות 50 מ"ל חרוטי.
  2. להקפיא את דגימות ב -80 ° CO / N.
  3. שחרר את כובעי על צינורות 50 מ"ל חרוטי ומניחים אותם במכונת הקפאה ייבוש במשך 36 שעות. להמשיך לאחסן או לעבד את דגימות (כמו desCribed למטה) עבור ניתוח HPLC וזיהוי מתחם.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  4. Resuspend כל מדגם 5 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים בצינור הבדיקה sealable.
  5. הוסף 5 מ"ל של אתיל אצטט ומערבבים על ידי הפיכת הצינור מספר פעמים.
  6. אפשר לשלבים להפריד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  7. מעבירים את הדף (שלב אורגני) למיכל חדש על ידי pipetting. אם נדרש, הבריכה מספר שברים אורגניים.
  8. יבש תחת זרם עדין של גז חנקן (~ 45 דקות).
  9. Re- להשעות את המדגם בפתרון המתאים עבור HPLC ( למשל, מתנול 100%).
  10. בצע HPLC על פי שיטות סטנדרטיות 40 .
  11. זיהוי תרכובות לפי האמצעים המתאימים.
    הערה: Electropray יוניזציה זמן טיסה של ספקטרומטריית מסה (ESI-TOF-MS) 40 משמש כאן.

תוצאות

צמיחה של מערכת שיתוף הידרופוני שיתוף

עקומת הצמיחה של א 'tumefaciens C58 הפגינו שלב בפיגור משמעותי ב 16 h הראשונית של cocultivation, ואחריו צמיחה יציבה מאוד כאשר שיתוף מעובד עם א Thaliana Col-0, עד מקסימום OD...

Discussion

בהינתן האופי ההדרגתי של הפרשת השורש, הריכוז של כימיקלים הנגרמים על ידי ארסיות, המופקים ב- Planta והשפעתם על אינטראקציות דינמיות של צמחים במרחב, מתרחשים במעברים מדורתיים וזמניים. במערכת זו הידרופוני שיתוף טיפוח, אין phytohormone סינתטי או כימיים המגרמת ארסיות מיקרוביאלי?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות בריאן Weselowski ואלכסנדר W. איסטמן על העזרה שלהם ושימוש מועיל. כמו כן, ברצוננו להודות לד"ר. יוג'ין נסטר, לינגרוי ג'אנג, האיטיאו שן, יוהאי קואי וגרג ת'ורן על עזרתם, דיונים שימושיים וקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה מומן על ידי חקלאות Agri-Food קנדה, גידול קדימה-AgriFlex (RBPI מספר 2555) ו הגדלת קדימה II מספר 1670 הפרויקט, שנערך על ידי המחברים כחלק מתפקידיהם. מחקר זה מומן חלקית גם על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) גילוי מענק RGPIN-2015-06052 הוענק ZC יואן.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)Arabidopsis Biological Resource CentreCS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)University of WashingtonN/A
labeled bacteriain-houseoptional, depends on downstream analyses
vortex(various)
microcentrifuge tubes(various)
microcentrifuge(various)
5% sodium hypochlorite(various)
double distilled water(various)
autoclave(various)
micropipette (various)
70% ethanol(various)
Murashige and Skoog (MS) basal saltsSigma-AldrichM5524
sucrose(various)
MES(various)
B5 vitamin mixSigma-AldrichG1019
phytoagar(various)
Deep Petri dishes(various)
stainless steel meshFerrier Wire Goods Company LtdN/Agrade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1"3M1530-1
diurnal growth chamber(various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm Pyrex3250other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood(various)
forcepts(various)
yeast extract(various)
tryptone(various)
MgSO4(various)
shaking incubator(various)
spectrophotometer(various)
NaCl(various)
shaker(various)
scissors(various)optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope(various)optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips(various)optional, depends on downstream analyses
nail polish(various)optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit(various)optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 or 74904optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis(various)optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen(various)optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle(various)optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter(various)optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes(various)optional, depends on downstream analyses
freeze dryer(various)optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes(various)optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate(various)optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC(various)optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS(various)optional, depends on downstream analyses

References

  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -. M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. , (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M., Lindsey, K. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. , (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -. C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -. C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena, ., Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
  35. Nathoo, N. . Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125Agrobacterium tumefaciens

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved