A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
מסיסות של תרכובות הידרופוביות בתמיסה המימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ושל חומצות אמינו
In This Article
Summary
פרוטוקול זה מתאר אמצעי ישים קלינית המסת תרכובות הידרופוביות סביבה מימית באמצעות שילובים של הרכבה עצמית פפטיד ופתרונות חומצת אמינו. השיטה שלנו פותר מגבלה עיקרית של הרפוי הידרופוביות, שחסרה אמצעי בטוחה ויעילה, המסיסות ושיטות משלוח לתוך הגדרות קליניים.
Abstract
פפטידים וההספק עצמית (לטמבלים) הם מבטיחים רכב למסירה של הרפוי הידרופובי ליישומים קליניים; תכונותיהם amphipathic מאפשרים להם להתמוסס תרכובות הידרופוביות בסביבה מימית של הגוף האנושי. עם זאת, פתרונות פפטיד וההספק עצמית יש תאימות דם לקויה (למשל, osmolarity נמוך), הפרעה היישום הקליני שלהם באמצעות מינהלות תוך ורידי. לאחרונה פיתחנו פלטפורמה מוכללת עבור משלוח סמים הידרופוביות, המשלב לטמבלים עם חומצת אמינו פתרונות (SAP-AA) כדי לשפר את מסיסות סמים ולהגביר ניסוח osmolarity להשיג את הדרישות עבור שימושים קליניים. אסטרטגיה זו ניסוח נבחנה ביסודיות בהקשר של שלוש תרכובות הידרופוביות שונות מבנית – PP2, rottlerin, ו כורכומין – כדי להדגים צדדיות שלה. יתר על כן, נבחנו ההשפעות של שינוי ניסוח מרכיבים על-ידי ניתוח לטמבלים שונים 6, 20 חומצות אמינו הקיימת באופן טבעי בריכוזים נמוכים וגבוהים, ואת שני ממיסים שיתוף שונים דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) אתנול. האסטרטגיה שלנו הוכיח כיעיל אופטימיזציה של רכיבים עבור סמים הידרופובי נתון ו פונקציה טיפולית של המדכא ניסח, PP2, נצפתה גם בתוך vitro וגם ויוו. כתב יד זה מתאר שיטת ניסוח מוכללת שלנו באמצעות שילובים SAP-AA עבור תרכובות הידרופוביות, וניתוח של מסיסות כצעד ראשון לקראת להשתמש הפוטנציאל של ניסוחים אלה במחקרים יותר פונקציונלי. אנו כוללים נציג מסיסות תוצאות ניסוח הכורכומין במתחם, הידרופובי, ולדון כמה המתודולוגיה שלנו משמש כפלטפורמה עבור מחקרים ביולוגיים עתידיים ומודלים המחלה.
Introduction
אידיוטים הם סוג של biomaterials זה נחקרו בהרחבה ככל פיגומים 3D רפואה רגנרטיבית1,2,3,4. לאחרונה אולם הם נוצלה כמו כלי רכב למסירה של הרפוי עקב שלהם תכונות ביולוגיות ייחודיות5,6,7,8. לטמבלים להרכיב באופן טבעי לתוך nanostructures יציב9, ובכך לספק אמצעי סמים עיטוף והגנה. אידיוטים הם amphipathic, המורכב דפוס מסוים של חומצת אמינו הידרופוביות, הידרופילית חזרה, הנהיגה שלהם הרכבה עצמית9,10 ומאפשר להם לשרת כמדיום בין הידרופובי הידרופילית סביבות. כתוצאה מכך, למסירה קליניים של תרופות הידרופוביות – אשר יש הזמינות הביולוגית נמוכה ביותר וספיגה בגוף עקב חוסר מסיסות סביבות מימית11,12 – לטמבלים מבטיחים כמו משלוח הרכב. יתר על כן, דפוס רצף שלהם מרמז גם כי לטמבלים יכול להיות רציונלי מעוצבים ומתוכננים להגדיל את התאימות עם כל תרופה מסוימת או מורכבים (כלומר, בהתבסס על קבוצות פונקציונליות) ולסייע נוסף מסיסות.
לטמבלים הוחלו כמו רכב משלוח סמים רבים במבחנה ועוד ויוו הגדרות13,14,15,16. הם גם הראו הביו ובטיחות נהדר. עם זאת, בשל osmolarity נמוכה של תכשירים תרופתיים SAP, הם אינם יכולים לשמש עבור זריקות תוך ורידי כמו הגדרות קליניים13. בהתחשב באיפוק זה, פיתחנו לאחרונה אסטרטגיה המשלבת לטמבלים עם חומצת אמינו פתרונות על מנת לצמצם את השימוש ממיסים שיתוף רעילים ולהגדיל את ניסוח osmolarity, ולכן, הרלוונטיות הקלינית. אנחנו בחרה להשתמש חומצות אמינו כפי שהן אבני הבניין של אידיוטים, הן כבר מקובלים מבחינה רפואית, בשילוב עם אידיוטים, הם מגבירים סמים הידרופובי מסיסות תוך הפחתת כמות SAP חובה17,18.
כבר בחנו מקרוב את SAP-AA שילובים כפלטפורמה כללית סמים הידרופובי מסיסות ואספקה הבאים על ידי יצירת צינור רב שלבי סינון, החלתו על החומר המדכא Src, PP2, כמו תרכובת הידרופובי מודל. בתהליך זה, בדקנו את האפקט של שינוי הרכיבים של ניסוח – בסופו של דבר בדיקות 6 לטמבלים שונים, כל 20 חומצות האמינו בריכוזים שונים 2 (נמוך ולא גבוה; נמוך מבוסס על ריכוזים ב קיימים יישומים קליניים, וגבוה ריכוזי היו 2 x, 3 x או 5 x ריכוז קלינית המבוסס על המסיסות המרבי לכל חומצה אמינית במים), 2 ממיסים שיתוף שונים – ואת השילובים שנבחרו solubilized PP2 לצורך ניתוח נוסף. זה ניסוח הסמים הוכיח כיעיל כרכב משלוח סמים תרבית תאים, כמו גם ב- vivo מודלים המשתמשים הממשלים הן intratracheal והן תוך ורידית. כמו כן, העבודה שלנו נגע על צדדיות של SAP-AA צירופי מרובה solubilizing, תרכובות הידרופוביות שונות מבנית בסביבה מימית; באופן ספציפי, תרופות rottlerin, כורכומין18. כתב יד זה מתאר את שיטת ניסוח SAP-AA וניתוח של כורכומין מסיסות כדוגמה הצעד העיקרי בצבר ההקרנה שלנו. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לשחזור למסך השילובים SAP-AA אופטימלית, אשר להמיס כל המתחם הידרופובי נתון.
Protocol
1. הכנה של חומצת אמינו פתרונות
- הכן ותווית שני 50 מ ל צנטריפוגה חרוט צינורות עבור כל חומצה אמינית (אחד עבור שניהם " נמוכה ", " גבוהה " ריכוזים).
- להכין בקבוקון 2 ל' גדול המכיל מים מטוהרים (18.2 MΩ·cm 25 ° c).
- לחשב את סכום כל חומצה אמינית (בגרמים) כדי להגיע הריכוזים הרצוי, ולשקול את הכמות המתאימה של חומצת אמינו לתוך צינורות צנטריפוגה שלהם בהתאמה 50 מ ל באמצעות מרית.
: הערה " גבוהה " ריכוז של השני אניון חומצות אמינו, PBS משמש במקום מים. אנחנו לא יכולים להגדיל ריכוזים שלהם עקב מסיסות נמוכה במים שלהם, באמצעות PBS במקום מים מסייעת לשמור על רמת ה-pH נמוך. יתר על כן, החישובים ריכוז התקבלו באמצעות אמצעי אחסון הסופי של 40 מ עבור כל הפתרונות חומצת אמינו. כל ריכוזי חומצת אמינו מתוארים בטבלה 3. הקפידו לשטוף את המרית בין חומצות אמינו כדי למנוע זיהום. אנו ממליצים לשטוף במים, ואחריו לקנח עם אתנול 70%- - להוסיף 40 מ"ל של מים מטוהרים (או PBS) לתוך כל שפופרת 50 מ ל באמצעות פיפטה סרולוגית. קאפ צינורות, מערבולת או לנער נמרצות עד התפרקה. Sonication אמבט מים (טמפרטורת החדר, 130 W, 40 קילו-הרץ) יכול לשמש גם כדי לסייע בתהליך מסיסות.
הערה: הפתרונות הבאים של חומצת אמינו רגישות לאור, שאמור להיות מכוסה ברדיד אלומיניום: טריפטופן, פנילאלנין, ואת טירוזין (אשר מורכב מבנים דמויי טבעת ארומטית) ציסטאין (תגובתי - SH לקבץ).
2. אופן ההכנה של פתרונות SAP-AA
- להכין 20 מ"ל נצנוץ בקבוקונים להרכבת עצמית פפטידים. עבור פפטיד וההספק עצמי נתון, להכין בקבוקון אחד לכל פתרון מוכן חומצת אמינו (כל שילוב יבוצעו במטבע בקבוקון נפרדות).
- באמצעות איזון האנליטי בעל ביצועים גבוהים (עם הקריאות עד 0.1 מ ג או פחות), שוקל כ 1 ± 0.2 מ ג של פפטיד לתוך החלק התחתון של כל מבחנה. קאפ לאחר שקילה ולהקליט את משקל מדויק פפטיד על הצוואה
- Pipette נפח מתאים של פתרון חומצה אמינית (להכין בסעיף 1) לתוך כל בקבוקון המכיל פפטיד, כדי להגיע לריכוז הרצוי עצמית בהרכבת פפטיד (0.1 mg/mL עבור פפטידים ארוכים באורך של 16 חומצות אמינו, או 0.2 מ"ג/מ"ל עבור פפטידים קצרים באורך של 8 חומצות אמינו).
- Sonicate 10 דקות ב מים באמבטיה sonicator (130 W, 40 קילו-הרץ) בטמפרטורת החדר, המבטיח הפתרונות בתוך המבחנות שקועים לחלוטין באמבט מים.
3. הכנה של סמים-דימתיל סולפוקסיד או סמים-אתנול מלאי פתרונות
- לשלב 1 מ ג של התרופה (במקרה זה, כורכומין עם 100% דימתיל סולפוקסיד) ולאחר עוד 1 מ ג עם 100% אתנול ליצירת שני פתרונות מניות.
הערה: הוספנו µL 200 של דימתיל סולפוקסיד ואתנול 400 µL כדי להפוך דימתיל סולפוקסיד-כורכומין אתנול-כורכומין מניות היו 5 מ"ג/מ"ל ו- 2.5 מ"ג/מ"ל, בהתאמה, עקב מסיסות בדרגות שונות של הממס כל; עם זאת, חשוב לציין כי הריכוז של המניה צריך להיות מותאם בהתאם הסם הידרופובי עניין. גורמים כגון סמים מסיסות וריכוז ביולוגי יעיל חשובים בקביעת ערך זה. כמו כן, זכור כי המניה להיות מדולל 100-fold ו 50-fold ניסוחים דימתיל סולפוקסיד אתנול, בהתאמה, בשילוב עם פתרונות SAP-AA (ראה סעיף 4). זה עשוי להיות מועדף להכין נפח גדול יותר של מניות בהתאם למספר ניסוחים נדרש – במקרה זה, ישמש יותר מ 1 מ ג של התרופה. ניתן לאחסן את המניה ב-20 ° C; הפשרת הקרח ו מערבולת לפני השימוש. - מערבולת שבקבוקי 15 s כדי נמסים לחלוטין את התרופה.
4. הכנת פורמולציות התרופות
- הכן 1.5 mL ברורה, microcentrifuge צינורות עבור כל ניסוח. הקפד צינורות בתווית עם המלצותיה הרכבה עצמית פפטיד, חומצת אמינו (וריכוז), ואת שיתוף הממס.
- להוסיף 10 µL של סמים-דימתיל סולפוקסיד מלאי או המניה סמים-אתנול µL 20 microcentrifuge המתאים צינורות.
- להוסיף 990 µL של פתרונות SAP-AA חומצה להקציב תוויות צינורות microcentrifuge המכיל סמים-דימתיל סולפוקסיד המניות, 980 µL לאלה המכילים מלאי הסמים-אתנול. זה מייצר 1 מ"ל ניסוחים סמים עם אתנול דימתיל סולפוקסיד או 2%-1%.
הערה: הריכוז הסופי של כל כורכומין ניסוחים היה 0.5 מ"ג/מ"ל לפי הפרוטוקול. שוב, זה ישתנה כאשר באמצעות תרכובות הידרופוביות אחרות ו/או מתחיל עם ריכוז מניות שונות (ראה שלב 3.1) - מערבולת נמרצות במשך 30 s ולאפשר ניסוחים לנוח 30 דקות
5. מסיסות בדיקות
- לאחר תקופת מנוחה, מערבולת נמרצות שוב ל 30 ס
- Centrifuge על ניסוחים ב g x 14,220 עבור מינימלית 1
- לנתח את תחתית הצינורות microcentrifuge עבור משקעים (על-ידי החזותיים).
תוצאות
עבור התרופה הידרופוביות, כורכומין, שהפקנו ניסוחים באמצעות כל 20 באופן טבעי קיימות חומצות אמינו בריכוזים נמוכים, בשילוב עם SAP אחד בלבד, EAK16-II, בתור הוכחה-של-עיקרון. בדקנו גם ניסוחים באמצעות דימתיל סולפוקסיד והן אתנול כמו ממיסים משותף. בסך הכל, זה הפיק 40 ניסוחים כורכומין, שכל א...
Discussion
בהליך ניסוח, ישנם שלבים קריטיים ונקודות שונות לשקול בפתרון. ראשית, כפי שאנחנו עובדים עם רכיבים שונים ריכוזים, מרובי שלבים מערבולת לאורך כל הפרוטוקול להבטיח כי כל ריכוזי אחידה ונכונה. חלק מהפתרונות חומצת אמינו הידרופוביות, ריכוז גבוה עשוי עדיין לא להיות התפרקה לחלוטין לאחר vortexing, במקרה זה, ?...
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מוסדות הקנדי למחקר בריאות, הפועלים מעניק מגב-42546 ומגב-119514.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| A6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| P6KE | CanPeptide Inc. | Custom peptide | Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC |
| Alanine | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-Alanine |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-Isoleucine |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-Leucine |
| Methionine | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-Methionine |
| Proline | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-Proline |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-Valine |
| Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-Phenylalanine |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-Tryptophan |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-Tyrosine |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-Glycine |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-Asparagine |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-Glutamine |
| Serine | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Serine |
| Threonine | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-Threonine |
| Histidine | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-Histidine |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-Lysine |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-Arginine |
| Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-Aspartic Acid |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-Glutamic Acid |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-Cysteine |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | Anhydrous |
| Curcumin | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | Hydrophobic drug, curcumin |
| Rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | Hydrophobic drug, rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | Hydrophobic drug, PP2 |
| Scintillation Vials | VWR | 2650-66022-081 | Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide. |
| Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes | VWR | 352070 | Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions. |
References
- Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
- Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
- Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
- Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
- Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
- Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
- Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
- French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
- Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
- Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
- Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
- Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
- Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
- Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
- Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
- Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
- Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved