JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı peptid ve amino asit çözümler kendi kendine montaj bileşimlerini kullanarak bir sulu ortamda hidrofobik bileşikler eriterek klinik olarak uygulanabilir Aracı açıklanır. Bizim yöntem klinik ayarları çözünürlük ve teslim yöntemleri güvenli, verimli araçlarının eksikliği hidrofobik therapeutics büyük bir sınırlama giderir.

Özet

Kendi kendine montaj peptidler (SAP) hidrofobik tedavi klinik uygulamalar için teslim etmek için umut verici araçlar vardır; onların amfipatik özellikleri onları hidrofobik bileşikler insan vücudunun sulu ortamdaki çözülmeye olanak verir. Ancak, zayıf kan uyumluluk (örneğin, düşük Osmolarite), kendi kendine montaj peptid çözüm var onların klinik uygulama intravenöz idareleri aracılığıyla engelleyen. Biz son zamanlarda amino asit çözümler (SAP-AA) uyuşturucu çözünürlük geliştirmek ve klinik kullanımları için gereksinimleri ulaşmak için formülasyon Osmolarite artırmak için SAP birleştiren hidrofobik ilaç dağıtım için Genelleştirilmiş bir platform geliştirdik. Bu formülasyon strateji iyice üç yapısal olarak farklı hidrofobik bileşikleri-PP2, rottlerin ve curcumin-çok yönlü göstermek için bağlamında test edildi. Ayrıca, formülasyonu bileşenleri 6 farklı SAP, 20 doğal olarak varolan amino asit düşük ve yüksek konsantrasyonlarda ve iki farklı ortak çözücüler Dimetil sülfoksit (DMSO) ve etanol analiz ederek değiştirmenin etkileri incelenmiştir. Bileşenleri belirli hidrofobik uyuşturucu ve formüle engelleyici, PP2, tedavi fonksiyonu için en iyi duruma getirme içinde etkili olduğu kanıtlanmıştır bizim strateji içinde in vitro ve in vivogözlendi. Bu el yazması hidrofobik bileşikler ve çözünürlük daha işlevsel çalışmalarda bu formülasyonları potansiyel kullanımı yolunda ilk adım olarak analizi için SAP-AA bileşimlerini kullanarak bizim Genelleştirilmiş formülasyonu yöntemi özetliyor. Biz temsilcisi çözünürlük sonuçlar için hidrofobik bileşik, curcumin formülasyonu içerir ve nasıl metodolojimiz gelecekteki biyolojik araştırmalar ve hastalık modelleri için bir platform olarak hizmet vermektedir tartışıyorlar.

Giriş

SAP bir rejeneratif tıp1,2,3,43D iskele olarak kapsamlı bir şekilde inceledik Biyomalzeme sınıfıdır. Son zamanlarda Ancak, onlar kendi benzersiz biyolojik özellikler5,6,7,8nedeniyle tedavi teslim etmek için Araçlar istismar. SAP doğal olarak böylece ilaç saklama ve koruma aracı sağlayan istikrarlı nanoyapıların9içine, toplanın. SAP vardır amfipatik hidrofobik ve hidrofilik amino asit tekrarlar, sürüş belirli bir desen ile oluşan, kendi kendinden montajlı9,10 ve onları hidrofobik ve hidrofilik arasında bir aracı olarak hizmet için izin ortamlar. Sonuç olarak, hidrofobik ilaçların-klinik teslimat için hangi olması son derece düşük bioavailability ve emilimi vücut sulu ortamlarda11,12 -çözünürlük eksikliği nedeniyle SAP olarak teslim umut verici araç. Ayrıca, onların sıra desen aynı zamanda SAP olabilir mantıklı bir şekilde tasarlanmış ve verilen herhangi bir ilaç ile uyumluluğu en üst düzeye çıkarmak veya (fonksiyonel gruplarına göreYani,) bileşik ve daha fazla çözünürlük yardımcı olmak için tasarlanmış olduğunu ima.

SAP etkili ilaç teslim araçlar birçok vitro ve in vivo ayarları13,14,15,16olarak uygulandı. Onlar da büyük güvenlik ve Biyouyumluluk göstermiştir. Ancak, nedeniyle düşük Osmolarite SAP-uyuşturucu hazırlıkları onlar olduğu gibi klinik ayarları13intravenöz enjeksiyonlar için kullanılamaz. Bu kısıtlama göz önüne alındığında son zamanlarda toksik co solvent kullanımını azaltmak ve formülasyon Osmolarite artırmak için amino asit çözümlerle SAP birleştiren bir strateji geliştirdik ve bu nedenle, klinik önemi. Biz yapı taşları olan SAP, oldukları gibi amino asitler kullanmayı tercih zaten klinik olarak kabul ve SAP miktarını azaltarak17,18gerekli ise SAP ile birlikte, onlar hidrofobik uyuşturucu çözünürlük artar.

Biz SAP-AA kombinasyonları hidrofobik uyuşturucu çözünürlük ve sonraki teslim için Genelleştirilmiş bir platform olarak Multi-step tarama ardışık düzen oluşturma ve Src inhibitörü, PP2, bir modeli hidrofobik bileşik için uygulama tarafından incelenip. Bu süreçte biz formülasyonu bileşenleri değiştirme-sonuçta 6 farklı SAP, tüm 20 amino asit (düşük ve yüksek; düşük konsantrasyonlarda mevcut klinik uygulamalarda ve yüksek üzerinde göre 2 farklı konsantrasyonlarda test etkisi incelenmiştir konsantrasyonları vardı 2 x, 3 x veya 5 x klinik konsantrasyonu bağlı olarak maksimum çözünürlük su her amino asit) ve 2 farklı ortak çözücüler – ve daha ayrıntılı bir çözümleme için PP2 çözündürüldükten seçili kombinasyonları. Bu uyuşturucu formülasyonu ilaç teslim araca hücre kültürü, hem de boğaza ve şarapla yönetimleri kullanarak vivo içinde modelleri olarak etkili olduğu ortaya çıktı. Aynı şekilde, bizim iş değindi ve çok yönlülük çözücü çoklu birleşimlerde SAP-AA, yapısal olarak farklı hidrofobik bileşikler sulu ortamlarda; Özellikle, uyuşturucu rottlerin ve curcumin18. Bu el yazması SAP-AA formülasyonu yöntemi ve analizini curcumin çözünürlük bizim tarama boru hattı birincil adımda bir örneği olarak önerilmektedir. Bu iletişim kuralı verilen herhangi bir hidrofobik bileşiği geçiyoruz en uygun SAP-AA kombinasyonları için ekran için basit, tekrarlanabilir bir yol sunar.

Protokol

1. Amino asit çözümler hazırlık

  1. hazırla ve etiket iki 50 mL konik santrifüj tüpleri her amino asit (her biri için her ikisi de " düşük " ve " yüksek " konsantrasyonları).
  2. Arıtılmış su (18,2 MΩ·cm 25 ° c) içeren büyük bir 2 L şişe hazırlayın.
  3. İstenen konsantrasyonları ulaşmak için (gram) olarak her amino asit miktarını hesaplamak ve amino asit uygun miktarda bir spatula kullanarak onların anılan sıraya göre 50 mL santrifüj tüpler içine tartmak.
    Not: İçin " yüksek " konsantrasyonu iki olumsuz ücret amino asitler, PBS su yerine kullanılır. Biz onların konsantrasyonları nedeniyle onların düşük su çözünürlük ve düşük pH korumak için su yardımcı olur yerine PBS kullanarak artırılamadı. Ayrıca, konsantrasyon hesaplamalar son hacmi 40 mL için her amino asit çözüm kullanarak elde edilmiştir. Tüm amino asit konsantrasyonu Tablo 3 ' te özetlenmiştir. Spatula kirlenmesini önlemek için amino asitler arasında yıkayın emin olun. Bir su durulama, % 70 etanol ile silinerek tarafından takip öneririz.
  4. Arıtılmış su (veya PBS) serolojik pipet kullanarak her 50 mL tüp içine eklemek 40 mL. Tüpler ve girdap kap veya eriyene kadar şiddetle çalkalanır. Su banyosu sonication (oda sıcaklığında, 130 W, 40 kHz) çözünürlük işleminde yardımcı olması için de kullanılabilir.
    Not: Aşağıdaki amino asit çözümler ışığa duyarlı ve alüminyum folyo ile kaplı: Triptofan, fenilalanin ve (Bu Aromatik halka benzeri yapıların oluşur) tirozin ve sistein (Reaktif - SH grup).

2. SAP-AA çözümleri hazırlanması

  1. kendini hazırlamak için hazırlamak 20 mL mercek şişeleri peptidler. Belirli bir kendi kendine montaj peptid için hazırlanan amino asit çözüm (her bileşeni ayrı bir şişede yapılacak) başına bir şişe hazırlayın.
  2. (Bir okunabilirlik aşağı 0.1 mg veya daha az ile), bir yüksek performanslı analitik denge kullanarak her şişenin dibine yaklaşık 1 ± 0.2 mg peptid tartın. Kap ağırlığında sonra ve peptid başIıkIı üzerinde tam ağırlığı kaydetmek
    3. Peptid, peptid (0.1 mg/mL 16 amino asit uzunluğunda uzun peptidler için veya 0.2 mg/mL için kendi kendine montaj istenen toplama ulaşmak için içeren her şişe içine (Bölüm 1'de hazır) amino asit çözüm uygun hacmi
  3. pipette daha kısa peptidler 8 amino asit uzunluğunda).
  4. Sonicate çözümleri şişeleri içinde tamamen su banyosu içinde dalmış sağlanması bir su banyosu sonicator (130 W, 40 kHz) oda sıcaklığında 10 min için.

3. Uyuşturucu DMSO veya uyuşturucu-etanol hisse senedi çözümleri hazırlanması

  1. kombine ilaç (Bu durumda, % 100 DMSO ile curcumin) 1 mg ve iki hisse senedi çözümleri oluşturmak için % 100 etanol ile başka bir 1 mg.
    Not: 200 µL DMSO ve 400 µL etanol 5 mg/mL 2.5 mg/mL, her çözücü içinde değişen çözünürlük nedeniyle idi DMSO curcumin ve etanol curcumin stokları yapmak eklendi; Ancak, hisse senedi toplama ilgi hidrofobik uyuşturucu bağlı olarak ayarlanması gerektiğini unutmamak gerekir. Uyuşturucu çözünürlük ve etkili biyolojik konsantrasyon gibi faktörler bu değer belirlemede önemlidir. Ayrıca, stok 100-fold ve 50-fold DMSO ve etanol formülasyonları, sırasıyla, (bkz. Bölüm 4) SAP-AA çözümleri ile birleştirildiğinde seyreltilmiş olduğunu göz önünde bulundurun. Stok gerekli formülasyonları sayısına bağlı olarak daha büyük bir hacim hazırlamak için tercih edilen – bu durumda, daha--dan 1 mg ilaç kullanılır. Stok-20 ° C'de depolanabilir; buz ve girdap kullanmadan önce tezcan.
  2. Girdap şişeleri için 15 s tamamen erimesi ilaç.

4. İlaç formülasyonları hazırlanması

  1. hazırla açık, 1.5 mL microcentrifuge tüpler için her formülasyonu. Peptid, amino asit (ve konsantrasyon), kendi kendine montaj amaçlanan ile etiket tüpler için emin olun ve co çözücü.
  2. Ekleyin 10 µL uyuşturucu DMSO hisse senedi veya 20 µL uyuşturucu-etanol hisse senedi için uygun microcentrifuge tüpler.
  3. Ekleyin 990 µL SAP-AA uygun asit çözümler microcentrifuge tüpleri uyuşturucu DMSO stok ve uyuşturucu-etanol hisse senedi içerenler için 980 µL içeren etiketli. Bu %1 DMSO veya % 2 etanol ile 1 mL ilaç formülasyonları üretir.
    Not: Tüm curcumin formülasyonları son konsantrasyonu 0.5 mg/mL protokolüne göre yapıldı. Yine, bu ne zaman değişir hidrofobik diğer bileşikler kullanarak ve/veya farklı bir hisse senedi konsantrasyon ile başlayan (bkz. Adım 3.1)
  4. girdap şiddetle için 30 s ve formülasyonlar için 30 dk dinlenmeye izin

5. Çözünürlük test

  1. dinlenme süresi, 30 için girdap şiddetle bir kez daha sonra s.
  2. 1 dk. 14,220 x g de formülasyonları santrifüj kapasitesi
  3. Microcentrifuge tüpler yağış için alt (görselleştirme tarafından) analiz.

Sonuçlar

Hidrofobik ilacı curcumin, biz doğal amino asitler bir kanıtı-of-ilke olarak yalnızca bir SAP, EAK16-II, ile birlikte düşük konsantrasyonlarda mevcut tüm 20 kullanarak formüller üretti. Ayrıca formülasyonları DMSO ve etanol ortak çözücüler kullanarak test ettik. Toplamda, bu 40 curcumin formülasyonları, her farklı bileşenleri içeren üretti. PP2, Src inhibitörü kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz daha fazla seçenek için SAP (Toplam 6) ve amino asit kons...

Tartışmalar

Formülasyon yordamda, çeşitli kritik adımlar ve gidermede dikkate alınacak noktalar vardır. İlk olarak, biz çeşitli bileşenleri ve konsantrasyonları ile çalışıyor gibi birden çok girdap adımları boyunca iletişim kuralı tüm konsantrasyonlarda düzgün ve doğru olduğundan emin olun. Bazı yüksek konsantrasyon, hidrofobik amino asit çözümler hala tamamen vortexing sonra çözülmüş değil ve bu durumda, onlar şiddetle işleminde yardımcı olması için elle sarsılmış. Aynı şekilde, bu SAP...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri tarafından desteklenir, işletim paspas-42546 paspas-119514 hibe ve.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
EAK16-ICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IVCanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EFK8-IICanPeptide Inc.Custom peptideSequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
A6KECanPeptide Inc.Custom peptideSequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
P6KECanPeptide Inc.Custom peptideSequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
AlanineSigma-AldrichA7469-100GL-Alanine
IsoleucineSigma-AldrichI7403-100GL-Isoleucine
LeucineSigma-AldrichL8912-100GL-Leucine
MethionineSigma-AldrichM5308-100GL-Methionine
ProlineSigma-AldrichP5607-100GL-Proline
ValineSigma-AldrichV0513-100GL-Valine
PhenylalanineSigma-AldrichP5482-100GL-Phenylalanine
TryptophanSigma-AldrichT8941-100GL-Tryptophan
TyrosineSigma-AldrichT8566-100GL-Tyrosine
GlycineSigma-AldrichG8790-100GL-Glycine
AsparagineSigma-AldrichA4159-100GL-Asparagine
GlutamineSigma-AldrichG8540-100GL-Glutamine
SerineSigma-AldrichA7219-100GL-Serine
ThreonineSigma-AldrichT8441-100GL-Threonine
HistidineSigma-AldrichH6034-100GL-Histidine
LysineSigma-AldrichL5501-100GL-Lysine
ArginineSigma-AldrichA8094-100GL-Arginine
Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100GL-Aspartic Acid
Glutamic AcidSigma-AldrichG8415-100GL-Glutamic Acid
CysteineSigma-AldrichC7352-100GL-Cysteine
Dimethyl SulfoxideSigma-AldrichD4540-500MLDMSO
EthanolSigma-Aldrich277649-100MLAnhydrous
CurcuminSigma-Aldrich08511-10MGHydrophobic drug, curcumin
RottlerinEMD Millipore557370-10MGHydrophobic drug, rottlerin
PP2Enzo BML-EI297-0001Hydrophobic drug, PP2
Scintillation VialsVWR2650-66022-081Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide.
Falcon 50 mL Conical Centrifugation TubesVWR352070Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions.

Referanslar

  1. Holmes, T. C., de Lacalle, S., Su, X., Liu, G., Rich, A., Zhang, S. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6728-6733 (2000).
  2. Davis, M. E., Motion, J. P. M., et al. Injectable self-assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells. Circulation. 111 (4), 442-450 (2005).
  3. Matson, J. B., Stupp, S. I. Self-assembling peptide scaffolds for regenerative medicine. Chem. Commun. 48 (1), 26-33 (2012).
  4. Tatman, P. D., Muhonen, E. G., Wickers, S. T., Gee, A. O., Kim, E., Kim, D. Self-assembling peptides for stem cell and tissue engineering. Biomater. Sci. 4 (4), 543-554 (2016).
  5. Keyes-Baig, C., Duhamel, J., Fung, S. -. Y., Bezaire, J., Chen, P. Self-assembling peptide as a potential carrier of hydrophobic compounds. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7522-7532 (2004).
  6. Kumar, P., Pillay, V., Modi, G., Choonara, Y. E., du Toit, L. C., Naidoo, D. Self-assembling peptides: implications for patenting in drug delivery and tissue engineering. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5 (1), 24-51 (2011).
  7. Wang, H., Yang, Z. Short-peptide-based molecular hydrogels: novel gelation strategies and applications for tissue engineering and drug delivery. Nanoscale. 4, 5259-5267 (2012).
  8. French, K. M., Somasuntharam, I., Davis, M. E. Self-assembling peptide-based delivery of therapeutics for myocardial infarction. Adv. Drug Deliv. Rev. 96, 40-53 (2016).
  9. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (8), 3334-3338 (1993).
  10. Bowerman, C. J., Nilsson, B. L. Self-assembly of amphipathic β-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers. 98 (3), 169-184 (2012).
  11. Amidon, G., Lennernäs, H., Shah, V., Crison, J. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification: the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability. Pharm. Res. 12 (3), 413-420 (1995).
  12. Shi, Y., Porter, W., Merdan, T., Li, L. C. Recent advances in intravenous delivery of poorly water-soluble compounds. Expert Opin. Drug Deliv. 6 (12), 1261-1282 (2009).
  13. Bawa, R., Fung, S. -. Y., et al. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance cellular delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine through caveolae-dependent endocytosis. Nanomedicine. 8 (5), 647-654 (2012).
  14. Liu, J., Zhang, L., Yang, Z., Zhao, X. Controlled release of paclitaxel from a self-assembling peptide hydrogel formed in situ and antitumor study in vitro. Int. J. Nanomed. 6, 2143-2153 (2011).
  15. Wu, Y., Sadatmousavi, P., Wang, R., Lu, S., Yuan, Y., Chen, P. Self-assembling peptide-based nanoparticles enhance anticancer effect of ellipticine in vitro and in vivo. Int. J. Nanomed. 7, 3221-3233 (2012).
  16. Fung, S. Y., Yang, H., et al. Self-Assembling Peptide as a Potential Carrier for Hydrophobic Anticancer Drug Ellipticine: Complexation, Release and In Vitro Delivery. Adv. Funct. Mater. 19 (1), 74-83 (2009).
  17. Fung, S. -. Y., Oyaizu, T., et al. The potential of nanoscale combinations of self-assembling peptides and amino acids of the Src tyrosine kinase inhibitor in acute lung injury therapy. Biomaterials. 32 (16), 4000-4008 (2011).
  18. Pacheco, S., Kanou, T., et al. Formulation of hydrophobic therapeutics with self-assembling peptide and amino acid: A new platform for intravenous drug delivery. J. Control. Release. 239, 211-222 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 127biyomalzemelerintraven z ila da t mhidrofobik tedaviila teslim aray ksek retilen i taramakendi kendine montaj peptidamino asit

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır