שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Summary

מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית גדל על מדיה סטרילי. עיקור ממוטבת פרוטוקולים פותחו כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים תוך מתן זרע משביע רצון הישרדות.

Abstract

תודרנית לבנה שתילים (תודרנית) בדרך כלל צריכים להיות מבוגרים במדיה סטרילי. פעולה זו דורשת זרע מוקדמת עיקור כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים בהווה על פני הזרע. כיום, זרעים תודרנית סטריליים באמצעות שתי שיטות עיקור ברורים בתנאים שונים במקצת בין מעבדות, אינה אחידה, שנרשמים עיקור יעיל באופן חלקי בלבד או בתמותה זרע מוגזמת. רוב שיטות אלה אינן גם להרחבה בקלות למספר רב של זרע שורות מגוונים אחרים. טכנולוגיות לניתוח תפוקה גבוהה של תודרנית ממשיכים להתרבות, טכניקות מתוקננת לחיטוי מספרים גדולים של זרעי אחרים שונים הופכים חיוניים עבור ניצוח סוגים אלה של ניסויים. התגובה של מספר קווי תודרנית שתי טכניקות שונות עיקור הוערך בהתבסס על שיעור הנביטה הזרע ואת רמת זיהום זרע ועם חיידקים פתוגנים אחרים. הטיפולים כללו ריכוזים שונים של לחיטוי סוכנים ושעות של חשיפה, בשילוב כדי לקבוע תנאים אופטימליים תודרנית זרע עיקור. הוכנו נהלים מיטביים עבור שתי שיטות שונות עיקור: אקונומיקה (נוזל-פאזי), גז כלור (Cl₂) (אדי-שלב), שניהם וכתוצאה מכך שיעורי הנביטה הזרע גבוהה זיהום מיקרוביאלי מינימלי. השירות של פרוטוקולים אלה מצויר באמצעות בדיקה של פראי סוג והן זרעים. מוטנטים עם מגוון של פוטנציאל נביטה. התוצאות שלנו מראים כי זרעים ביעילות לעקר באמצעות כל אחת מהשיטות ללא זרע מופרז התמותה, למרות השפעות מזיקות של עיקור נצפו על זרעים עם נמוך יותר פוטנציאל נביטה אופטימלית. בנוסף, משוואה פותחה כדי לאפשר לחוקרים חלים התנאים עיקור גז כלור מתוקננת אטום מיכלים בגדלים שונים. הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים עיקור זרע קלה, יעילה וזולה עבור מספר גדול של תודרנית קווים.

Introduction

תודרנית לבנה (תודרנית) הוא אורגניזם מודל עיקרי במחקר בסיסי ויישומי צמח ביולוגיה^1,2,3. ואילו תנאים סטנדרטיים של תודרנית הצמיחה כבר וותיקה⁴, ההשפעה של עיקור זרע על הכדאיות זרע לא בקפדנות נבדק. מדיה מלאים צלחות או בתיבות משמש באופן שגרתי כדי להקל על צמיחה של תודרנית השתילים עבור יישומים ניסויים רבים, כגון זיהוי של homozygous קטלני המוטציות באוכלוסיה הפרדת, תצפית של פנוטיפים לירות ושורש -מוקדם שלבים, בידוד של רקמות ללא הפתוגן, אוסף של כמויות גדולות של שתיל רקמות, מבחר transformants או צמחים עמידים לתרופות והערכה של נביטה^1,2,3,4 . זרעים שנקטפו הצמחים גדלו בחממה או תא לגידול נגועים מדי פעם עם מיקרואורגניזמים ואבק. הצמיחה של תודרנית שתילים על סוגים שונים של מדיה סטרילי מחייבת עיקור זרע מוקדמת כדי להסיר חיידקים מזהמים כגון פטריות וחיידקים המצויים על פני הזרע. השימוש של משטר עיקור של זרע יעיל הוא קריטי עבור איזון של נביטה גבוה, זיהום מזערי צימוח נמרץ.

שתי השיטות הנפוצות ביותר בשימוש עבור עיקור זרע תודרנית מבוססים על מסחרי אקונומיקה (נוזל-פאזי), גז כימי (אדי-שלב). הליכים שונים יש כבר מועסקים שני עיקור נוזלי-שלב^{1,4,5,6,7,8,9 ,} עיקור ¹⁰ ו אדי-פאזי של תודרנית זרעים^{8,10,11,12,13,14,15 ,16}. עם זאת, בעוד נהלים אלה הוכחו כיעילים שישותו של אחרים שימוש עיקור זרע, ניתוח מפורט של ההשפעה של טיפולים שונים עיקור על הזרעים של אחרים שונה לא דווחה. לכן, אופטימיזציה של הליכים אלה עיקור נדרש להגדרת תנאי שבו עיקור יעיל בשילוב עם קצב נביטה גבוה.

תודרנית ביולוגי משאב מרכז (לסלילת) ממוקם באופן ייחודי כדי a) לבדוק הזרע הכדאיות של מגוון אחרים שונים את אוסף b) ולנצל נהלי בקרת איכות מוחל באופן פנימי, בתגובה למשוב על נביטת הזרעים. המטרות של הניסויים שהוצגו כאן היו לברר את ההשפעות של עיקור בשיטות שונות על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית. נהלים עיקור ממוטבת והתוצאה בשערי נביטת הזרעים גבוהה תוך שמירה על הפתוגן מינימלי זיהום מוצגים עבור עיקור גז אקונומיקה והן כלור.

Protocol

1-הכנת 1 x בינוני Murashige ו- Skoog (MS)

1. g 4.31 להוסיף של MS תערובת הבסיס, 10 גרם סוכרוז ו 0.5 גר' 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) גביע המכיל 0.8 לליטר מים מזוקקים ומערבבים להתמוסס. בדוק והתאם pH ל 5.7 באמצעות 1 מ' אשלגן הידרוקסידי (KOH). להוסיף מים מזוקקים כדי ליצור 1 ל'
2. לחלק את המדיה שני בקבוקים 1 ליטר, 500 מ ל כל אחד. להוסיף 5 גר' אגר כל בקבוק. חופשיות המכסה.
3. אוטוקלב כעשרים דקות ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi עם פס מגנטי מערבבים בבקבוק.
4. לאחר autoclaving, למקם את הבקבוקים על צלחת מערבבים במהירות נמוכה, ולאפשר ' המדיום MS להתקרר עד 45-50 ° C (עד הבקבוק יכולים להיות מוחזקים בידיים חשופות).
5. החל משלב זה, לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים ב תא למינארי. להוסיף 500 µL Gamborg ' s ויטמין לפתרון כל בקבוק ומערבבים המדיום MS לפיזור אחיד הפתרון ויטמין.
6. שופכים מספיק מדיה לתוך צלחות לכסות בערך מחצית העומק של הצלחת-
7. לאפשר את הצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך כ 1 h לאפשר את אגר שבמהלכו.
   הערה: אם הצלחות לא אמור לשמש מיד, לעטוף אותם פלסטיק ולאחסן ב 4 מעלות (טמפרטורת המקרר). צלחות מקורה, תיבות או צינורות עם אגר הקרושה ניתן לאחסן מספר שבועות ב 4 ° C בכלי אטום לאוויר.

2. עיקור וסירוס של תודרנית זרעים עם אקונומיקה

1. הכן MS צלחות על פי סעיף 1 של הפרוטוקול. אוטוקלב 100 מ של מים מזוקקים באותו זמן כמו התקשורת MS. השתמש באפשרות זו בהמשך כמו שטיפה במים וכדי לסייע להשעות את הזרעים כדי לסייע יופיצ.
   הערה: אם רצונך בכך, 0.8% אגר תערובת (w/v) (לדוגמא phytagar) יכול להיות גם בלוק בשלב זה. התערובת אגר הרבה מכדי מים מזוקקים במהלך ציפוי (שלב הנגן 2.5.3.). צמיגות נוספת של התערובת אגר מקלה על שטח זרעים על צלחת או צמח בשורות במידת הצורך.
2. הכנת 50% (v/v) מלבין פתרון כדי לשמש לחיטוי הזרעים. כדי לדלל אקונומיקה, להוסיף 100 מ של אקונומיקה 100 מ של מים מזוקקים. להוסיף 50 µL של דטרגנט Tween 20 הפתרון מלבין.
   הערה: פתרון אקונומיקה מוכן ניתן לאחסן עד חודש, כל עוד הוא רק נפתח בתנאים סטריליים.
3. Aliquot 100 זרעים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL-
4. לחטא את הזרעים באמצעות פתרון 50% מלבין.
   1. בתוך תא למינארי, להוסיף 500 µL של הפתרון 50% מלבין הצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים. הקש על החלק התחתון של צינור כדי להשעות את הזרעים בפתרון מלבין.
      הערה: לחלופין, מסובב או שאכר פלטפורמה של עשוי לשמש כדי לשמור את הזרעים מושעה.
5. לשטוף את הפתרון אקונומיקה מהצינור.
   1. אחרי 10 דקות, להסיר הפתרון אקונומיקה באמצעות פיפטה או של העצמות מצויד טיפ פיפטה בקצה הצינור microcentrifuge.
   2. להוסיף 500 µL של מים מזוקקים סטריליים כדי ברכבת התחתית. סגור את הצינור, היפוך לערבב. לאפשר זרעים להתיישב לתחתית הצינור. לאחר זרעים התיישבו לתחתית הצינור בזהירות להסיר את הפתרון אקונומיקה על-ידי pipetting. חזור על פעולה זו שטיפה תהליך 6 פעמים.
   3. להוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים בלוק צינור כדי להשעות את הזרעים.
6. צלחת הזרעים סטיריליים על צלחות MS-
   1. בתוך תא למינארי, תווית התחתית לצלחת MS עם השם מניות לבין התאריך הנוכחי.
   2. יוצקים את הזרעים מהצינור microcentrifuge לצלחת MS. להפיץ את הזרעים סביב הצלחת MS באמצעות לולאה לחסן סטרילי, לשימוש יחיד או טיפ פיפטה סטרילי.
      הערה: אם זרעים נזרע בשורות, פיפטה עם טיפ 200 µL ניתן בנפרד למקם זרעים בעמדות הרצוי. כדי לשפר את הזרימה של זרעים, הסוף של קצה פיפטה שניתן לחיתוך על ידי 3-5 מ מ באמצעות מספריים. כל הזרעים במקומה או אשכולות של זרעים ואז ניתן למקם או מופרדים באמצעות לולאה לחסן חד-פעמי סטרילי.
   3. למקם את הצלחת MS-חוסר של למינארי עם המכסה עצומות למחצה. לאפשר את המים העודפים מתמוססות מהצלחת MS-
   4. למקם את המכסה על הצלחת MS. חותם הצלחת MS על ידי ליפוף לצלחת עם נייר נקבובי כירורגי קלטת (ראה את הטבלה של חומרים).

3. עיקור וסירוס של תודרנית זרע עם גז כלור

1. הכן MS צלחות על פי סעיף 1 של הפרוטוקול. אוטוקלב 100 מ של מים מזוקקים באותו זמן כמו התקשורת MS; זה ישמש אחר כך לעזור להשעות את הזרעים כדי לסייע יופיצ.
   הערה: אם רצונך בכך, 0.8% אגר תערובת (w/v) (לדוגמא phytagar) יכול להיות גם בלוק בשלב זה. התערובת אגר הרבה מכדי מים מזוקקים במהלך ציפוי (שלב 3.6.2.). צמיגות נוספת של התערובת אגר מקלה על שטח זרעים על צלחת או צמח בשורות במידת הצורך.
2. לפני שמתחילים עיקור, לחשב את הסכומים של אקונומיקה, חומצת מלח (HCl) הדרושה להפקת גז כלור.
   1. לחשב הסכום של HCl הדרוש כדי לייצר את Cl 6.1% ₂ נדרש עבור עיקור.
   2. להשתמש בנוסחה הבאה:
      
      עם mL 7,000 בתור אמצעי האחסון של המיכל עיקור וסירוס ו- 6.1% Cl ₂; הנפח של HCl מחושבת להיות 3 מ ל.
      הערה: גיליון אלקטרוני מתוכנת לבצע את החישוב עבור אמצעי אחסון שונים של מיכל ו- % Cl ₂ מסופק משלימה טבלה 1-
3. Aliquot 100 זרעים לתוך צינור microcentrifuge 0.5 mL. לסגור את כובעי כל מבחנה, למקם את הבקבוקונים מתלה פלסטיק ו להפריש.
   הערה: זרעים ניתן לאחסן לתקופה ממושכת של זמן בשלב זה כל עוד הם מאוחסנים בתנאים נאותים. תנאי אחסון ניתן למצוא בסעיף 3.3.2 של הפרוטוקול על ידי ריברו ועמיתיו ⁴. ניתן להשתמש בתבנית 96-ובכן צלחת-
4. להכין את החומרים הדרושים לביצוע סטריליזציה גז כלור.
   1. להשיג מלבין ו- HCl של מיקומי אחסון שלהם.
   2. לחתוך רצועה של פרפין גדול סרט (ראה את הטבלה של חומרים) לשימוש בשלב 3.5.3. לאטום את המיכל עיקור.
   3. למקם את מיכל פלסטיק עם מכסה בו העיקור יתקיים בתוך ברדס fume. לפתוח את הפקקים על כל הבקבוקונים זרע ומניחים המתלה כולו זרע בתוך המיכל פלסטיק.
5. לבצע עיקור גז כלור בטמפרטורת החדר.
   התראה: לעבוד עם אקונומיקה וחומצה בנפרד. אין להשאיר גם בקבוק uncapped כדי להפחית את הסיכון של נוזלים. השתמש המתאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כולל כפפות חלוק מעבדה. אם אקונומיקה או חומצה מתיז על כפפות, לשנות כפפות לפני טיפול חומרים אחרים. תמיד להסיר כפפות בשכונה fume במקרה של זיהום אקונומיקה או חומצה.
   1. מקום גביע 250 מ ל בתוך המיכל ולהוסיף 100 מ של אקונומיקה.
      הערה: התגובה בין HCl אקונומיקה מחייבת לפחות 22 כרכים עודף של אקונומיקה. התגובה לצרוך HCl, אקונומיקה על ידי שחרור גז ₂ Cl עם נתרן כלורי (NaCl) ומים כמו תוצרי לוואי. שימוש עודף גדול של אקונומיקה מאפשר את הצריכה של d HCl נוספיםuring תקופת אוורור, אשר מפחית את כמות נתרן ביקרבונט (NaHCO ₃) הדרושים כדי לנטרל את הפתרון עבור סילוק.
      התראה: כשהספל צריך להיות לפחות פעמיים נוזלי הנפח הכולל של אקונומיקה + HCl. פעולה זו מונעת פרצים בריחה כשהספל במהלך השלב הבא, אשר יכול לגרום נזק זרעים, אקונומיקה בגדים, או לצרוב עור חשוף.
   2. להוסיף 3 מ"ל של HCl כשהספל המכיל האקונומיקה.
      התראה: התגובה הראשונית יהיה לייצר בועות, במיוחד בריכוזים גז גבוהה יותר מ- 6.1%. חלוק מעבדה עם שרוולים ארוכים הכרחי בשלב זה.
   3. לסגור את המיכל עיקור, לאטום אותו עם סרט פרפין מיד.
   4. לפקח על המכולה עיקור במהלך הזמן עיקור כדי להבטיח הצטברות גזים; ההצטברות של כלור גז צריך להיות גלוי כמו אובך הצהוב חלש בתוך המיכל.
      התראה: בדוק מעת לעת המכולה עיקור כדי להבטיח כי הלחץ בתוך יש לא unseated את המכסה או שעוות פרפין הסרט. אם המכסה הגיע ב־2005 נכללו קאו יאי או הסרט פרפין השתחררה, סגור את המכסה, בזהירות לעטוף את המיכל עם רובד נוסף של הסרט פרפין.
   5. לאחר 1 h-עיקור התקופה, פתח את המיכל על-ידי הסרת פרפין הסרט ופתיחה המכסה על פינה אחת. לאפשר המכולה לפרוק עבור 3 שעות להשלים את התגובה ולחסל הגז-
   6. לסגור את הפקקים כל microcentrifuge הצינורות בארון זרע.
      הערה: זרעים סטיריליים ניתן לאחסן עד הזמן של ציפוי כל עוד הן מאוחסנות במצב יבש.
   7. להסיר את המדף זרע ולמקם אותו תא למינארי.
   8. לנטרל תגובת גז כלור
      1. להוסיף 1.5 גר' אבקת ₃ NaHCO לאט כדי כשהספל המכיל את הפתרון מלבין/HCl ומערבבים עם מוט זכוכית לפזר את NaHCO ₃ פתרון. המשך להוסיף NaHCO ₃ עד בועות הגז פחמן דו-חמצני (CO ₂) פסקו להרכיב.
         התראה: להוסיף לאט כדי למנוע פרצים. השתמש עיקרון השוויון הפוליטי המתאים כולל כפפות חלוק מעבדה.
      2. לבדוק את רמת ה-pH של התמיסה באמצעות חומציות או מד pH. להוסיף NaHCO נוספים ₃ אם הצורך עד ה-pH של הפתרון הוא נייטרלי (pH 7.0). בשלב זה הפתרון יכול להיות הוסר מהשכונה fume והשמדתי בהתאם להנחיות סילוק ישים כל.
         התראה: אם כל הריח שם לב במהלך סילוק ואז הפתרון מיד יש להחזיר למכסה fume.
6. צלחת הזרעים סטיריליים על צלחות MS-
   1. בתוך תא למינארי, תווית התחתית לצלחת MS עם השם מניות לבין התאריך הנוכחי.
   2. µL 500 להוסיף מים מזוקקים סטיריליים כל שפופרת microcentrifuge להשעות את הזרעים. יוצקים זרעים על הצלחת MS ולהפיץ את הזרעים אחיד סביב הצלחת באמצעות לולאה לחסן סטרילי, לשימוש יחיד או טיפ פיפטה סטרילי.
   3. למקם את הצלחת MS-חוסר של למינארי עם המכסה עצומות למחצה. לאפשר את המים העודפים מתמוססות מהצלחת MS-
   4. למקם את המכסה על הצלחת MS. לאטום את הצלחת MS על ידי ליפוף לצלחת עם נייר הדבקה נקבובי.

4. הצמיחה של תודרנית על צלחות MS

1. מקום הצלחות עם המכסה על גבי שלושה ימים ב- 4 הלעפה תרוטרפמט והלחות הסביבתית.
   הערה: תהליך זה נקרא ריבוד ומשמש לסינכרון מלכתחילה נביטה של זרעים בודדים.
2. להעביר את הצלחות לסביבה צמיחה. Photoperiod
   1. שמור על טמפרטורה ב 23 ° C, עוצמת האור-120-150 µmol/m ² s 16 h אור / כהה 8 שעות. מקום צלחות שטוח לתוך הסביבה לגדול עם המכסה למעלה אז השורשים לגדול לתוך המדיום.
3. לתת השתילים על צלחות לגדול במשך 8 ימים.
   הערה: תקופת הצמיחה 8 היום מאפשר מאוחר. הנבטת הזרעים לנבוט. צלחות can be הבקיע מוקדם יותר מאשר 8 ימים אם יש כל הזרעים מונבטים.
4. ציון שיעור הנביטה.
   1. רשומה מספר זרעים זה יש מונבטים, כי יש לא מונבטים. לחשב שיעור נביטה על-ידי חלוקת מספר הזרעים מונבטים על ידי המספר הכולל של זרעים על הצלחת.
      הערה: נביטה נספרת כאשר radicle חזתה מחוץ קליפת הזרע פסיגי הזרע שני גלויים.
   2. גם לספור את מספר זרעים מושפעת עובש כדי לקבוע את היעילות של התנאים עיקור.

תוצאות

תודרנית זרעים שנאסף תא בשדה, חממה או צמיחה פתוחה לפעמים שזוהמו על ידי מיקרואורגניזמים שונים כמו פטריות וחיידקים^1,4. לפיכך, נובטים זרעי במדיה סטרילי יכול להיות מאתגר במיוחד עקב זיהום של הצלחות, במיוחד כאשר אספקת הזרעים מוגבלת. פרוטוקול ממוטב עבור עיקור גז אקונומיקה והן כלור, תוצאותיה מוצגות להלן, ממזער את הבעיה ושומר את הכדאיות של זרעים הנדרש עבור יישומי תפוקה גבוהה.

ההשפעות של עיקור אקונומיקה על נביטה של זרעים תודרנית Col-0

אקונומיקה היא סוכן הנפוצות ביותר של זרע עיקור של מיני צמחים רבים. ריכוז אופטימלי של הסוכן עיקור וזמן חשיפה משתנה בין המינים. מספר פרוטוקולים יש כבר מועסקים באמצעות אקונומיקה עבור עיקור של תודרנית זרעים^{1,4,5,6,7,8,9 , 10}. ארבע ריכוזים שונים של אקונומיקה עם זמן חשיפה שונות חמש תקופות נבדקו ואת התוצאות מוצגים איור 1. הטיפולים הוחלו על קולומביה פראי-סוג (Col-0) זרעים. השפעת ריכוז אקונומיקה על נביטה של זרעים Col-0 מגוונים תלוי בזמן של עיקור כפי שמגלה על אינטראקציה משמעותית בין ריכוז אקונומיקה לזמן של עיקור (איור 1, P < 0.001. אנובה-השונות).

בניסויים עם עיקור פעמים בין 5 ל 10 דקות, טיפולים עם כל ריכוזי אקונומיקה הביאה באותה מידה נביטה גבוה שיעור של Col-0 זרעים (איור 1). המחירים נביטה גבוה נצפו גם עבור מלבין ביתי ריכוזים של 40% ו 50% עבור כל הזמן עיקור. טיפולים עם 80% ל-100% מלבין עבור תקופות יותר מ 10 דקות הביא משמעותי להקטין את שיעור הנביטה לעומת הפעמים טבילה קצרה יותר (P < 0.01, ANOVA). יתר על כן, כי הן 80% ל-100% מלבין טיפולים במשך 20 דקות, נביטה משמעותית ירדו בהשוואה המתאימים 40% וטיפולי 50% מלבין (P < 0.001, ANOVA).

זרעים להציג רמות שונות של הלבנת מצמקים בעת שימוש ריכוזים אקונומיקה גבוהה למשך 15 דקות או יותר. בנוסף גבוה יחסית (עד 32%) התמותה זרעים, זרעים מונבטים מעוקר ב תנאים אלה לעיתים קרובות הראה צמיחה פגמים, משתקפת כישלון של פסיגי הזרע, hypocotyls להתפתח, להאריך, וכתוצאה מכך מעצר התפתחותית. רוב הטיפולים (14 מתוך 20) היו לגמרי בחינם, וכתוצאה מכך הכוללת כייר רמת הממוצע של ± 0.21% 0.003 (טבלה 1).

טיפול עם אקונומיקה 50% וזמן הספיגה של 10 דקות נבחר המשטר עיקור הכי טוב כי זה משולב אחוז נביטה גבוה עם עיכוב טוב של פתוגן משטח צמיחה. טיפול זה נבחר כדי לבחון את ההשפעה של עיקור אקונומיקה על קווים מוטנטים שונים כפי שמתואר להלן.

ההשפעות של עיקור גז כלור על נביטה של זרעים Col-0

כדי למטב את תנאי סטריליזציה גז כלור, שימשו שלושה ריכוזים שונים של גז כלור כדי לחטא Col-0 זרעים במשך שתי תקופות זמן (טבלה 2). ריכוז הגז היה מחושב בהתבסס על הנפח של HCl מרוכזת, נפח המיכל עיקור באמצעות המשוואה הבאה:

המשוואה הזו נגזר באמצעות החוק גז אידאלי בהנחה 12.3 M HCl, לטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס, לחץ אטמוספירי של 101.3 kPa.

השפעת ריכוז גז כלור על נביטה של זרעים Col-0 הוצגה לסמוך על הזמן של עיקור כמצוין על-ידי האינטראקציה משמעותי בין הזמן ואת הגורמים ריכוז (איור 2 א, P < 0.01, ANOVA) . ריכוז גז כלור היה אין השפעה משמעותית על נביטה של זרעים Col-0 נתון 1 h עיקור. עם הפעם עיקור, כל ריכוזי גז כימי בדרגה דומה רמות גבוהות של נביטה, מעל 85% (P > 0.05, ANOVA). מצד שני, עיקור h באורך 3, גרמו ירידה משמעותית אחוזי נביטה של הריכוז הגבוה ביותר של גז כלור, לעומת שני ריכוזים גז נמוכה יותר (P < 0.05, ANOVA). תוצאות אלו מצביעות על טיפולים של תודרנית זרעים עם כל אחד ריכוזי גז כלור שנבדקו עבור 1 h, או עם ריכוזי גזים מתחת 16.5% עבור 3 h, יעילים באותה מידה בשימור הזרע הכדאיות מאז נביטה המחירים היו תמיד גדול יותר מ- 82%. עם זאת, לחיטוי זרעים h 3 בגז 16.5% היה מזיק נביטת הזרעים.

השכיחות של עובש גם הייתה תלויה גז ריכוז וזמן החשיפה. צמיחה של עובש היה עכבות ביעילות את ריכוזים גבוהים יחסית של 6.1% ל- 16.5% גז כלור לטיפול h באורך 1 ועם כל ריכוזי גז עבור 3 h (איור 2B).

בהתבסס על תוצאות אלו, טיפול עם ריכוז גז של 6.1% עבור h 1 (טבלה 2) נבחר התנאי עיקור אדי-פאזי הטוב ביותר כדי לבחון את ההשפעה של גז עיקור בשורות מוטנטים שונים, מאז זה משולב (קצב נביטה גבוה 85%) עם רמה נמוכה מאוד של זיהום עובש (0.02%).

ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על זרעים בעלי פוטנציאל שונה נביטה

ניתוח סטטיסטי הראה כי התגובה נביטה שיטות העיקור הייתה תלויה הפוטנציאל נביטה של הקווים (איור 3A, P < 0.01, ANOVA). עיקור גז לא מלבין ולא כלור מופחת קצב נביטה של זרעים עם פוטנציאל גבוה נביטה (קבוצות 4 ו- 5). הטיפול לא היתה השפעה על קצב נמוך כבר נביטה של הקבוצה עם הנביטה הנמוךפוטנציאל (קבוצה 1). לעומת זאת, עיקור גז כלור הביא לירידה משמעותית בכ-12-18% (P < 0.01, ANOVA) ב מלכתחילה נביטה של זרעים עם פוטנציאל נביטה ביניים (קבוצות 2 ו- 3). עיקור אקונומיקה גם ירד שיעור הנביטה ב 13% של קבוצה 2, אבל זה לא פחת שיעור הנביטה של קבוצה 3. למרות שהיה הבדל משמעותי בשיעור נביטה בין אקונומיקה כלור גז טיפולים בשום קבוצה נביטה (איור 3A, P > 0.442, ANOVA), זרעים עיקור באמצעות אקונומיקה היה מעט גבוה יותר שיעור הנביטה יותר גז-עיקור זרעים בכל קבוצות נביטה.

טיפולים עיקור שינו באופן משמעותי (P < 0.001, ANOVA) האחוזים של זרעים מושפעת עובש (איור 3B). שניהם כלור גז ומלבין עיקור, גרמו פחות צמיחה של עובש (P < 0.05, ANOVA) בהשוואה ללא עיקור. לא היה הבדל ברמת עובש זוהה בין עיקור גז ומלבין בשום קבוצה (איור 3B, P > 0.4, ANOVA).

איור 1: השפעת ריכוז אקונומיקה וזמן עיקור על נביטה של זרעים תודרנית Col-0- ערכים הם אמצעי ± SD המתקבל 5 שכפולי עצמאית של הניסוי. * מציין הבדלים משמעותיים ביחס 5 דקות לספוג את משך עבור טווח ריכוזים אקונומיקה (P < 0.01, ANOVA). ^#מציין הבדלים משמעותיים בין 80%-100% מלבין ריכוזי יחסית 40% ל- 50% במשך 20 דקות פרק זמן (P < 0.01, ANOVA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: השפעות של כלור גז ריכוז וזמן עיקור על זרעים תודרנית Col-0- (א) שיעור הנביטה ורמת עובש (B). קווי שגיאה מייצגים ± באמצעים SD המתקבל ביולוגי 5 ו 5 שכפולי טכני של הניסוי. אמצעים שאינם שותפים מכתב הם שונים באופן משמעותי (P < 0.05, ANOVA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על זרעים בעלי פוטנציאל שונה נביטה. (א) שיעור הנביטה ורמת עובש (B). הקווים חוליה T-DNA 100 היו מסווגים חמש קבוצות על פי הנביטה שלהם פוטנציאל הגדיר את קצב נביטה, בהעדר כל סוכן עיקור. הקבוצות מבוסס על קצב נביטה היו כדלקמן: קבוצה 1 (0-20%), קבוצה 2 (21-50%), קבוצה 3 (51-70%), קבוצה 4 (71-90%) ו קבוצה 5 (91-100%). הקווים נבחרו באופן אקראי, שלהם נביטה הפוטנציאליים אינם תלויים גנוטיפ. ערכים הם אמצעי ± SD המתקבל שלושה שכפולי עצמאית של הניסוי. אותיות ("a", "ab", "c", וכו ') מעל כל ערך מציינים את קבוצות סטטיסטיות של קטגוריה פירושו. אמצעים שאינם שותפים מכתב הם שונים באופן משמעותי (P < 0.05, ANOVA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

עיקור הזמן (דקות)	ריכוז אקונומיקה (%)
	40	50	80	100
5	0.00%	0.00%	0.00%	2.13%
8	0.00%	0.00%	0.00%	0.00%
10	0.00%	0.50%	0.00%	0.36%
15	0.00%	0.00%	0.00%	0.68%
20	0.19%	0.28%	0.00%	0.00%

טבלה 1: כייר רמת מחוטא-אקונומיקה Col-0 זרעים.

אקונומיקה	HCl	זמן	% גז כלור (מול Cl2/mol גז סה)
(mL)	(mL)	(h)
25	1	1	2.1
25	1	3	2.1
100	3	1	6.1
100	3	3	6.1
200	9	1	16.5
200	9	3	16.5

בטבלה 2: כלור (Cl₂) גז עיקור טיפולים על קולומביה פראי-סוג הזרעים באמצעות מיכל 7 L.

משלימה טבלה 1: גיליון אלקטרוני מתוכנת לבצע את החישוב עבור אמצעי אחסון שונים של מיכל ו- % Cl₂. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

כאשר גדל תודרנית זרעים במדיה סטרילי, יש להחיל צורה כלשהי של עיקור. הן אקונומיקה כלור גז עיקור וטיפולי התוצאה דומה נביטה עובש וקצב הצמיחה עיכוב. גם שיטת עיקור גורם הפחתה משמעותית בשיעור נביטה של זרעים עם פוטנציאל; גבוהה נביטה עם זאת, אקונומיקה עיקור מומלצת עבור קווים עם פוטנציאל נביטה נמוכה יותר (20-70%), בשל הקטן, אף על פי שאינו משמעותי, שיפור בשיעור הנביטה לעומת גז עיקור (איור 3 א).

לחיטוי תודרנית זרעים עם אקונומיקה ריכוזים בין 40-100% עבור עד 10 דקות מספק אחוזי נביטה משביע רצון, דיכוי עובש יעיל. למרות אקונומיקה ריכוזים פחות מ- 40% לספק עיקור נאותה רוב הזרע הרבה, באמצעות ריכוז של 40% או גבוה יותר ערבויות עיקור יעיל של הרבה זרע מזוהם בכבדות אפילו. זה חשוב לא יעלה על 10 דקות של עיקור בעת שימוש אקונומיקה ריכוזים שווה או גבוה מ- 80% כדי למנוע תמותה גבוהה זרע מולדים בהתפתחות נבט.

טיפול תודרנית זרעים עם ריכוזי גז כלור 6.1% או 16.5% לתוצאות 1 h בנביטה גבוה המחירים ולמניעת עובש נאותה. ריכוז גז כלור נמוך (2.1%) יכול לשמש בהצלחה על ידי הגדלת משך עיקור ל-3 שעות.

כאשר כמה שורות צריך לעקר, מומלץ נוזלי עיקור בפתרון של אקונומיקה 50% למשך 10 דקות. עבור מספרים גדולים של קווים, עיקור גז עם ריכוז גז של 6.1% עבור 1 h הוא אפשרות טובה יותר מאחר קווים רבים יכולים להיות מעוקר בקלות ובמהירות עם פחות מניפולציה.

התוצאות שלנו לספק תנאים סטנדרטיים לחיטוי מספר גדול של זרעי אחרים שונים והן את הזרעים עם פוטנציאל נמוך נביטה. המגבלה היחידה של טכניקות אלה עיקור היא כי הם לא ניתן להחיל את הזרעים הנביטה המחירים פחות מ- 20% עקב תמותה נרחבת זרע. שיטות אלטרנטיביות, כגון sonication¹⁷, כדי להגדיל את שיעור הנביטה בהיעדרו של עיקור עשוי להועיל במקרים אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes	GeneMate	C-3260-5	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube	GeneMate	C-3262-1	Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container	Sistema	1016265438	Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl	Sigma-Aldrich	320331	Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop	Fisher Scientific	22-363-603	Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution	Sigma-Aldrich	G1019	Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach	Clorox	Regular-Bleach	Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M2933	Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape	3M	1530-1	Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS)	Sigma-Aldrich	M5524	Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M	Bemis Company	#PM996	Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips	Whatman	2613991	Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar	Fisher Scientific	50-255-212	Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	Chemical used in the process of making MS media
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100	Chemical used in the process of liquid sterilization
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	CS70000 (Col-0)	Arabidopsis wild-type seeds
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_037606C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_041402C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_059101C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_063470C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072048C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_072240C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081989C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084124C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_089717C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107354C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110111C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111322C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113109C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114872C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115657C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_116803C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039445C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_039782C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_043037C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_045828C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_048556C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049514C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049725C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080816C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081176C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081770C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082262C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082289C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_082702C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083630C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_084635C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085337C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085656C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_093049C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103332C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105336C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_105704C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106388C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_109575C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110580C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110617C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111424C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111584C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115837C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 2
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_019535C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_026478C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_046565C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049258C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_049339C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_056307C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081292C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_083488C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110573C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_112793C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113658C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113904C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114673C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_114709C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_115455C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 3
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_013186C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_018261C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_062509C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080639C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_088586C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_096651C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_106900C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110131C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111051C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_111245C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_113223C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_121391C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_125097C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_201905C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_210001C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 4
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_000662C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_029335C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_047760C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_071275C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_080530C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_103881C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_110864C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_120294C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_124390C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_132808C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_137036C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_139519C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_140643C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_142288C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_143304C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_147597C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_209076C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Group 5
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_081081C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 1
Arabidopsis thaliana seeds	ABRC; order through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_107487C	Arabidopsis seeds used in testing as a part of Groups 5 and 2