בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

Summary

כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

Abstract

בלב שלם, תאים סמוכים להשפיע cardiomyocytes למבוגרים. השיטה של בידוד, טיפוח של cardiomyocytes למבוגרים, חקירה מדויקת של אופן הפעולה של תאים אלה תחת טיפולים ספציפיים וסביבות אפשרי. כתב יד זה מציג פרוטוקול הבידוד מוצלח, טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC).

העכברוש מוקרבת על ידי נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה עמוקה. לאחר מכן, מופק הלב, העורקים הוא חשף. לאחר מכן, מתבצע זלוף במערכת זלוף Langendorff עם סידן דלדול וטיפול collagenase. לאחר מכן, רקמות חדרית מקבל כתוש, שהופץ מחדש, מסוננים, ואחריו שלושה צעדים צנטריפוגה עם תוספת הדרגתית של CaCl₂ עד הריכוז פיזיולוגי סידן. ARVC הם מצופה על מנות התרבות תאים. לאחר רענון המדיום התרבות תאים, ARVC יכול להיות מעובד עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום תרבות סרום המכיל. בידוד של ARVC הוא תהליך רגיש סידן. שינויים קטנים בריכוז הסידן תאיים לגרום לירידה האיכות ואת הכדאיות של תאים מבודדים.

טרי מבודד ARVC הם מוט בצורת. בתוך הימים הראשונים של טיפוח-תרגול הוא מפסיד את מוט בצורת טופס ומורפולוגיה pseudopodia מבנים דמויי (התפשטות). במהלך המשקע מורפולוגי ARVC לבזות בתחילה שלהם אלמנטים כויץ ואחריו של הרפורמציה דרך סיבי אקטין מתח, sarcomerogenesis de novo . אחרי שבוע אחד של טיפוח-תרגול, רוב ARVC הצג מראה נפוץ עם striation קרוס לזיהוי בבירור. תהליך זה הוא רגיש ריכוז הסידן תאיים, בזמן הטיפול עם ionomycin נחלש מתפשטת. סמני מפתח בתהליך של דה - ו מחדש - differentiation הם שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), oncostatin M (OSM) ו- swiprosin-1 (EFHD2). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הלב differentiation re ביטול המתרחשים בתנאים תרבות מחקה תכונות ראית ויוו במהלך שיפוץ לב. לכן, בידוד, טיפוח של ARVC לשחק תפקיד מפתח להבנת הביולוגיה של cardiomyocytes.

Introduction

Cardiomyocytes למבוגרים ויוו לעבוד syncytium חשמלי המבוסס על תאים תאים מגעים בין נייטרלים. בנוסף, הם מושפעים תאים סמוכים כמו fibroblasts לב, תאי אנדותל, נוירונים תאים דלקתיים¹. על מנת ללמוד את היכולת של cardiomyocytes להתאים לארגון תאיים שלהם ששונו תנאי עומס, כפי שניתן לראות במהלך היפרטרופיה, מה צעד ראשוני שמוביל אי ספיקת לב, בידוד, טיפוח של עכברוש חדרית למבוגרים cardiomyocytes (ARVC) הוא הכרחי^2,3,4. מבחינה היסטורית, cardiomyocytes קודם הם בודדו אותנו מהמתרחש עובריים חומוס לבבות^5,6. כמה שנים מאוחר יותר, הבידוד הראשון של cardiomyocytes סופני הבדיל תוארה על-ידי שימוש סידן דלדול⁷. אולם, cardiomyocytes למבוגרים אלה לא היו סידן סובלנית, ולכן לא ניתן להשתמש עבור מבחני פונקציונלי. לבסוף, בשנת 1976 פרוטוקול חדש זמין פאוול ולסובב לחקור cardiomyocytes חדרית מבוגר מתחת בתנאים פיזיולוגיים⁸. כצעד ראשון, הם בודדו cardiomyocytes מבוגר מתחת ריכוזי סידן נמוך וסידן מוגבר לאחר מכן פיזיולוגיים ריכוזי בשגרה stepwise. כיום, ברוב הפרוטוקולים עבור בידוד וטיפוח של cardiomyocytes למבוגרים לעבוד עם פרוטוקול זה סידן, להשתמש collagenase עיכול אנזימטי של אנשי קשר תא עבות-תא¹.

לטיפוח מוצלחת, נדרש סרום עגל עוברית (FCS) או oncostatin מ' (OSM). ARVC לבצע של דה - ו מחדש - differentiation בשינויים מבניים מקיף כולל סרקומר פירוק ועל הרפורמציה^9,10,11,12. תהליך זה מלווה ביטוי מחדש של גנים מסוג עוברית, כמו שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), כפי הידוע מן היפרטרופיה, היווצרות של מבנים דמויי-pseudopodia, הנקרא גם מריחה^{4,11, 13}. יתר על כן, swiprosin-1 (EFHD2), שזוהה חלבון, משחק תפקיד מרכזי בתהליך של בידול מחדש ARVC מעובדים¹¹. כתוצאה מכך, ARVC בתרבות להפוך תאים נרחבת, רב שלבית, אשר באופן ספונטני להראות התכווצויות לאחר שבועיים עד שלושה שבועות תרבות^2,4,14.

לאחרונה חשפו כי הלב differentiation re ביטול עם התרחשותה בתנאים תרבות מחקה כולל ראית ויוו במהלך לב שיפוצים^10,15. שיפוץ לב הוא תהליך מפתח במהלך מחלות לב¹⁶. כמו מחלות לב הם עדיין הגורם העיקרי למוות בחברות תעשיתיות, הבנה טובה יותר של הביולוגיה של cardiomyocytes הבוגרים חשוב (מי; 2015). בידוד טיפוח של ARVC יוכלו לסייע לפתח אסטרטגיות חדשות, תרופות לטיפול במחלות לב. עם כתב היד הזה, מסופק עבור בידוד של טיפוח של ARVC פרוטוקול. יתר על כן, כמה חלקים קריטיים של שיטה זו מסומנים במקטע דיון.

Protocol

החקירה התנהלה על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה שפרסם את בנו המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). באופן כללי, חולדות wistar גברים בגילאי 3-4 חודשים, במשקל ממוצע של 250-350 גר' משמשים עבור פרוטוקול זה. לב עכברוש אחד מספיקה עבור 20 מנות התרבות (1 מ"ל לכל מאכל; הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם צפיפות תאים משוער של 1.5 x 10 ⁴ תאים/1000 מ מ ²-

1. הכנה של מדיה, ריאגנטים

1. בינוני קריאטין-קרניטין-טאורין (CCT בינוני)
   הערה: CCT בינוני הוא מדיום מורכבות בהתבסס על בינוני 199 עם התוספת של קריאטין, קרניטין, טאורין.
   1. L להכין 1 בינוני 199: להוסיף 3.6 g Hepes ומיקס לשעה. לאחר מכן להוסיף מ"ג 655.5 קריאטין (5 מ מ), 395.4 mg קרניטין (2 מ מ) ו- 625.5 mg טאורין (5 מ מ). קרניטין טאורין שינוי ה-pH ל < 7. על מנת לעכב את הצמיחה של תאים מזהמים, למשל תאי אנדותל או fibroblasts, להוסיף 10 מיקרומטר ציטוזין β-D-arabinofuranoside המדיום. להתאים את ה-pH עם NaOH (2 מ מ) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. לאחסן המדיום CCT ב-4 מעלות צלזיוס
2. פאוול בינוני
   1. בינוני 1 L פאוול, להמיס 6.43 g NaCl (110 מ"מ) עם 0.19 גרם אשלגן כלורי (2.5 מ מ), 0.16 g ח' ₂ PO ₄ (1.2 מ מ), 0.3 g MgSO ₄ 7 שעות ₂ O (1.2 מ מ), 5.96 g Hepes (25 מ מ), ו- 1.98 g D (+ )-גלוקוז monohydrate (10 מ מ) ב- Aqua סטרילי. להתאים את ה-pH עם NaOH (ז 2) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. חנות בינונית פאוול ב-4 מעלות צלזיוס
3. סידן כלורי (₂ CaCl)
   1. להכין פתרון 100 מ מ CaCl ₂ (50 מ"ל) ולהכין aliquots המכיל 500 µL CaCl ₂. להקפיא aliquots ב-20 מעלות צלזיוס
4. הכנה של תרבות בינוני
   1. להכין שלוש תא תרבות מדיומים: מראש ציפוי בינוני ציפוי בינוני, בינוני כביסה. השתמש CCT בינוני כבסיס עבור כל שלושה מדיומים (טבלה 1). לחשב CCT בינוני עם 1 מ"ל לכל מאכל תרבות. לכן, להתכונן 20 מ"ל CCT בינוני 20 מנות תרבות (הקוטר הפנימי: 35 מ מ)-
   2. תא תרבות צלחות: מעיל שהלוח התרבות התא (הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם 1 מ"ל מראש ציפוי בינוני. חנות את הלוחיות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.

2. בידוד של Cardiomyocytes למבוגרים

1. מערכת זלוף הכנה של Langendorff
   1. תרמי יופיצ בינונית, כביסה בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס Defreeze שפופרת של 500 µL CaCl ₂, שוקלים 25 מ ג של collagenase.
   2. מיושרות מערכת זלוף Langendorff עם אקווה סטרילי, לאחר מכן תן בינוני פאוול הפיצו את המערכת עבור 5 דק.
   3. למלא את המערכת זלוף Langendorff 80 מ ל פאוול בינונית ללא כל האוויר בועות גז המדיום עם 95% חמצן.
   4. להכין צינור (50 מ"ל) עם 40 מ"ל פאוול בינונית מחממים אותו ל- 37 ° C, גז זה עם 95% חמצן.
   5. להתכונן חוט של בערך 25 ס מ אורך הצמדת בלב מוסרים הצינורית.
   6. Degrease סכין גילוח עם אלכוהול (70% לפי נפח) ותחברי אותו למסוק. מלחציים דיסק מפלסטיק לתוך המסוק.
2. החילוץ של הלב
   1. עזים ומתנגד חולדה זכר wistar עם 4-5% איזופלוריין, להקריב אותו עם נקע בצוואר הרחם. לפתוח את הבטן מאחורי הקשת costal עם הטיה הבטן, עם אותו זוג מספריים, לחתוך דרך הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה.
   2. להסיר את הלב, יחד עם ריאות של בלוטת התימוס, על ידי חיתוך מעל בלוטת התימוס הגולגולת מאוד בחלל בית החזה. להעביר את החומר תמיסת כקרח מיד.
   3. להסיר את הריאות ואת בלוטת התימוס מהלב עם מספריים ויבתר (גדול) ולהעביר על ידי קיבעון החומר עם מלקחיים קפסולה, לאחרון פתרון מלוחים חדש.
3. בידוד
   1. להסיר עודפי רקמת, כמו שאריות של בלוטת התימוס, קנה הנשימה, שומן, רקמת חיבור מהלב באמצעות מלקחיים קפסולה מספריים ויבתר (גדול או קטן). לחשוף את העורקים ולסיים עם מספריים ויבתר (גדול או קטן) בין אדריכל הראשון ואת השני branchial
   2. מתחיל טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. מקום בלב-הצינורית של מערכת זלוף Langendorff, שמלמדות את זה קודם. עם מלחציים תנין ומאוחר יותר עם החוט מוכן. לשטוף את הלב עד שיתפנה דם.
   3. לפזר 25 מ ג Collagenase במדיום פאוול חמים 5-6 מ"ל ולהוסיף 12.5 µL CaCl ₂ (30 מיקרומטר).
   4. לסגור את זרימת הדם על ידי הזזת משפך זכוכית, אשר מחובר עם מערכת זלוף Langendorff, על לבו טפטוף ולהוסיף collagenase פתור את המערכת זלוף. נתחיל את זלוף במשך 25 דקות מהירות ירידה של טיפה 1 לשניה.
      הערה: במהלך זלוף, הלב להתנפח ולקבל מראה שעווה.
   5. לעצור את זלוף לאחר 25 דקות ולהסיר את הלב מתוך מערכת זלוף Langendorff. הסר את העורקים אטריה, רקמת חיבור מהלב ולפתוח החדרים ימינה ושמאלה.
   6. חותך את הלב פעמיים בזווית של 90 מעלות (רוחב החיתוך: 0.7 מ"מ; מהירות: 0.15 ס"מ/s). חזור על תהליך זה באופן ידני עם אזמלים שני 10 s בכל צד.
   7. להעביר 12 מ של המדיום זלוף לתוך צינור חדש (50 מ"ל). שופכים את slurry תא לתוך תאים זה בינוני ותקציר לעוד 5 דקות ב 37 ° C. לערבב הפתרון בכל דקה.
   8. לסנן את הפתרון עם הלב מתעכל דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר) לתוך צינור חדש (50 מ"ל).
   9. Centrifuge הפתרון המסוננות ב 29 g x עבור 3 מינימלית להשליך את תגובת שיקוע והוסף בינוני פאוול חמים 6 מ ל כולל 12.5 µL CaCl ₂ (250 מיקרומטר) כדי בגדר התא. Resuspend בגדר באמצעות תנועות חזק חלקה. צנטריפוגה שוב ב 29 g x עבור 2 דק. להשליך תגובת שיקוע והוסף חמים 6 מ"ל פאוול בינוני שהוחלפו עם 25 µL CaCl ₂ (500 מיקרומטר). להמיס בגדר תא דרך בתנועות עדינות חזק ומוסיפים 12 mL חמים פאוול בינונית הכוללת 120 µL CaCl ₂ (1 מ"מ). צנטריפוגה בפעם השלישית ב 16 x g עבור 1 דקות. שוב, להסיר את תגובת שיקוע.
   10. לערבב בגדר תא עם המדיום ציפוי מראש ומחוממת.
   11. הסר בינוני ציפוי מראש צלחות תרבות. העברת 1 מ"ל ציפוי בינוני, כולל את cardiomyocytes מבודדים, כל צלחת תרבות. דגירה cardiomyocytes מבודד טריים ב 37 ° C עבור ה 1
   12. להסיר המדיום ציפוי לוחות תרבות. להוסיף 1 מ"ל שטיפה בינוניים עד שהלוח תרבות, לאחסן את הצלחות ב 37 ° C עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום.
   13. עבור חוקרים את השפעת כימיקלים שונים וטיפולים -ARVC, תחילה רענן בינוני ציפוי על-ידי שטיפת בינוני, לאחר מכן הוספת כימיקלים שונים.
       הערה: הערכה עם מיקרוסקופ אור: עם כל הכנה תא, 150 ל-300 cardiomyocytes צריך לפקח ליום על ידי מיקרוסקופ אור. לסעף cardiomyocytes שנספר הכל לקבוצות על פי המראה שלהם (למשל, " מוט בצורת ", " סיבוב למטה ", " מתפשט ", ו " מראה יוצא דופן "). הקטגוריה " הפצת " כולל כל cardiomyocytes עם מבנים דמויי-pseudopodia. " מראה יוצא דופן " כולל כל ARVC עם משטח לא סדיר אין קרום התא שלם לזיהוי.

3. דוגמה ניסויים

1. זריחה/Immunofluorescence כתמים cardiomyocytes למבוגרים
   1. ניתוח מורפולוגי ומבניים המרות של ARVC במהלך הטיפוח-תרגול על ידי מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. להשתמש Phalloidin-TRITC כדי לחקור מבנים F-אקטין " מוט בצורת ", " סיבוב למטה ", ו " הפצת " ARVC. לבצע צביעת לפי היצרן ' פרוטוקול s. דוגמא אישית Phalloidin-TRITC מכתים ניתנת בהפניה Nippert. et al. ¹¹. עם זריחה/immunofluorescence מכתים, הבדלים ב דה - ו מחדש - differentiation של המנגנון כויץ ב cardiomyocytes למבוגרים מטופח בין ניסיוני טיפולים (למשל, עם Swiprosin-1, ionomycin) יכול ייחקרו.
2. בזמן אמת כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR)
   1. לבצע לרביעיית-PCR לחקור שינויים בביטוי ה-mRNA של גנים שונים (למשל, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. עבור גודל המדגם מספיק, השתמש מנות תרבות גדול (קוטר פנימי: 60 מ מ) עם 2 מ"ל נפח. ARVC של חמש מנות תרבות התשואות דוגמא אחת. לבצע בידוד של mRNA וטרנספורמציה של cDNA לפי היצרן ' פרוטוקול s.
3. Immunoblot טכניקות
   1. לבצע לחומה המערבית לחקור שינויים בביטוי חלבונים (למשל, עבור Swiprosin-1) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. השתמש צלחת תרבות אחת (1 מ"ל) עבור דגימה.

תוצאות

Cardiomyocytes למבוגרים בתרבות: איור 1 מציג סקירה של טרי מבודד למבוגרים cardiomyocytes 2 h לאחר השטיפה האחרונה. כ- 75% של כל cardiomyocytes היה מורפולוגיה של מוט בצורת. 25% הנותרים הראה מראה יוצא דופן מורפולוגיה עגול, אין לזיהוי ללא פגע קרום התא (איור 1). בסו?...

Discussion

ההתנהגות של cardiomyocytes למבוגרים ויוו מושפע על ידי אינטראקציות רבות עם תאים אחרים (למשל, נוירונים, תאי אנדותל, fibroblasts, תאים דלקתיים), את syncytium חשמל אשר הם יוצרים¹. לכן, לימוד מתח עיבוד של cardiomyocytes למבוגרים באופן בלעדי דורש את הבידוד טיפוח של ARVC. ההשפעות העיקריות של בידוד ושל ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177