ラット心筋細胞の分離と培養

要約

ここでは、分離と培養ラット心室心筋細胞 (ARVC) のためのプロトコルを提案する.分離 ARVC は、短期および長期の栽培に使用できます。分離と ARVC の栽培は、心疾患の新しい治療法の開発に重要な役割を再生できます。

要約

そのままの心で隣接するセル大人の心筋細胞に影響を与えます。分離法と成人の心筋細胞の培養は、特定の治療法や環境下でこれらの細胞の動作の正確な調査が可能です。この原稿は、ラットの心室心筋細胞 (ARVC) の培養と分離を成功させるためのプロトコルを示します。

頚部転位深麻酔下でラットが犠牲に。中心部を抽出し、大動脈がカバーされていません。その後、蛍光灌流システム カルシウム枯渇とコラゲナーゼ処理の灌流が実行されます。その後、心室の組織を取得しますみじん切り、再循環、フィルター、CaCl₂の段階的な追加で 3 つの遠心分離手順に続いて生理カルシウム濃度に到達するまで。ARVC 細胞培養皿にメッキパーツを多数。細胞培養液を更新した後 ARVC できます栽培される 6 日間の血清を含む培養液を変更せず。ARVC の分離は、カルシウム敏感なプロセスです。細胞内カルシウム濃度のわずかな変化は、質と隔離されたセルの実行可能性の減少を引き起こします。

新鮮な分離 ARVC は棒状のものです。栽培の最初の日以内に、彼らは、棒状形態とフォーム偽足のような構造 (拡散) を失います。この形態の形成の間に ARVC は当初改革アクチン繊維の応力およびde novo sarcomerogenesis によって続いて収縮要素を低下します。栽培の 1 週間後は、ほとんど ARVC は明確に検出可能な十字紋と広範な外観を表示します。このプロセスは細胞内カルシウム濃度に敏感イオノマイシンによる治療は拡散減衰です。Β-ミオシン重鎖 (β-MHC)、オンコスタチン M (OSM) swiprosin 1 (EFHD2)、このプロセスでのデ- と再-differentiation キー マーカー。最近の研究はことを心臓改造中に見られる生体機能模倣心臓再脱 differentiation 発生培養条件下で示唆しています。したがって、ARVC の分離と培養心筋細胞の生物学を理解する上で重要な役割を再生します。

概要

生体内で大人の心筋細胞間の細胞間接触に基づく電気シンシチウムとして働きます。さらに、心臓線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、炎症細胞¹のような隣接する細胞に影響を与えています。心筋細胞の細胞内組織を適応能力を研究するために心臓肥大、心不全、分離ラット心室の栽培が主要な最初のステップみたように負荷条件を変更心筋 (ARVC) は必要な^2,3,4です。歴史的には、心筋細胞最初から分離された鶏胚心^5,6.数年後、終末分化した心筋細胞の最初の分離は、カルシウム枯渇⁷を使用して記述されていた。ただし、これらの大人の心筋細胞はカルシウム耐性をなかったし、したがって、機能アッセイには使用できませんでした。最後に、1976 年に新しいプロトコルと有効にパウエル ツイスト生理的条件⁸下大人の心室心筋細胞を調査します。最初のステップとして彼らは低カルシウム濃度とステップワイズ法で生理学的濃度 ca がその後増加の下で成人の心筋細胞を分離しました。今日、分離と大人の心筋細胞の培養のためのほとんどのプロトコルはこのカルシウム プロトコルで動作し、高密度細胞接触¹の酵素の消化力のコラゲナーゼを使用します。

育成に成功した、牛胎児血清 (FCS) またはオンコスタチン M (OSM) が必要です。ARVC 実行、デ- と再-differentiation 筋分解と改革^9,10、11,12を含む広汎な構造変更をします。このプロセスは再発現胎児型遺伝子、β-ミオシン重鎖 (β-MHC) のような伴われる拡散^4,11、とも呼ばれる、偽足のような構造体の形成と肥大から知られています。¹³。 さらに、swiprosin-1 (EFHD2)、新たに同定されたタンパク質は栽培 ARVC¹¹の再分化の過程で大きな役割を果たしています。その結果、文化 ARVC 文化^2,4,14の 2 〜 3 週間後の収縮を自発的に表示する、広範囲にわたる多セルに変換します。

最近の発見は、心臓再脱 differentiation 模倣文化の条件下で発生すると機能を生体内で見られる心臓改造^10,15時に明らかにしました。心筋リモデリングは、心疾患¹⁶の間にキーのプロセスです。心疾患は、工業化社会で死の主な原因で、まだ、大人の心筋細胞の生物学の理解を深めることが重要です (人; 2015)。ARVC の分離と培養は新たな戦略と心臓疾患の治療のための薬を開発することができます。この原稿分離 ARVC の耕作のためのプロトコルが提供されます。さらに、このメソッドのいくつかの重要な部分は、ディスカッション セクションでハイライトされます。

プロトコル

ケアと、米国国立衛生研究所 (NIH 文書番号 85-23、1996 の改正) によって公開された実験動物の使用の調査ガイドによると。一般に、雄 wistar ラット 3 〜 4 ヶ月の熟成、250-350 g の平均重量はこのプロトコルに使用されます。1 つのラット心は 20 の培養皿には十分 (皿あたり 1 mL; 内径: 35 mm) おおよそセル密度が 1.5 倍の 10 ⁴ セル/1000 mm ²

。

1 です。 メディアの準備および試薬

1. クレアチン、カルニチン、タウリン培地 (CCT 中)
   注: CCT 媒体中 199 クレアチン、カルニチン、タウリンの添加に基づく複雑な媒体であります。
   1. 準備 1 L 中 199: 3.6 g Hepes と 1 h のミックスを追加します。655.5 mg クレアチン (5 mM)、395.4 mg カルニチン (2 mM)、および 625.5 mg タウリン (5 mM) を追加します。カルニチン、タウリンを変更する pH < 7。汚染細胞、例えば 血管内皮細胞や線維芽細胞の増殖を抑制する、するために培地に 10 μ M シトシン β-D-アラビノを追加します。7.4 と滅菌フィルター媒体に (2 mM) を NaOH で pH を調整します。4 CCT 媒体を保存 ° C
2. パウエル媒体
   1. 1 L パウエル中で溶解する 6.43 g 塩化ナトリウム (110 mM) 0.19 g KCl (2.5 mM)、0.16 g KH ₂ PO ₄ (1.2 mM)、0.3 g MgSO ₄ 7 H ₂ O (1.2 mM)、5.96 g Hepes (25 mM) と 1.98 g D (+)-アクア滅菌でグルコース一水和物 (10 mM)。7.4 と滅菌フィルター媒体 (2 M) を NaOH で pH を調整します。ストア パウエル培地で 4 ° C
3. 塩化カルシウム (CaCl ₂)
   1. 100 mM CaCl ₂ ソリューション (50 mL) を準備し、500 μ L CaCl ₂ を含む因数を準備します。-20 で因数を凍結 ° C
4. 培地の準備
   1. 準備 3 細胞培養媒体: 中古めっき中、めっき中、洗濯中。すべての 3 つの媒体 (表 1) のための基礎として使用 CCT 媒体。CCT 培地 1 ml の培養皿あたりを計算します。したがって、20 の文化料理 20 mL CCT メディアの準備 (内部の直径: 35 mm).
   2. 細胞培養プレート: コートの各細胞培養プレート (内径: 35 mm) 前播種培地 1 ml。使用する前にコーティング プレート 37 ° C 一晩、少なくとも 2 時間を格納します
   。

2。大人の心筋細胞の単離

1. 蛍光準備灌流システム
   1. 熱メッキ媒体と洗濯中 37 ° C Defreeze 500 μ L CaCl ₂ の管およびコラゲナーゼの 25 mg で重量を量る
   。
   2. フラッシュ滅菌は、アクアと蛍光灌流システムその後 5 分間システムを循環するパウエル媒体を聞かせてください。
   3. いずれかの空気泡とガス 95% 酸素媒体なし 80 ml パウエル中蛍光灌流システムを入力します
   。
   4. 40 ml パウエル中管 (50 mL) を準備、37 ° C に熱するし、95% の酸素とガスします
   。
   5. カニューレに削除された心を取り付けるための長さ約 25 cm のスレッドを準備します
   。
   6. は、アルコール (70% ボリューム) にかみそりの刃を脱脂してチョッパーに固定します。チョッパーにプラスチック製のディスクをクランプします
   。
2. 心の抽出
   1. と 4 ~ 5% イソフルレン雄 wistar ラットを麻酔し、頚部転位と犠牲します。腹部断肋骨アーチの後ろに腹部を開くし、開く胸腔内横隔膜を切ってはさみのペアは同じと
   。
   2. は、胸腔内に高度頭蓋胸腺上切断して心臓、肺、胸腺を削除します。すぐに冷たい食塩水に材料を転送します
   。
   3. 解剖はさみ (大) と心臓から肺、胸腺を削除し、カプセル鉗子で材料を遠ざけているか、によっては新しい食塩に後者転送します
   。
3. 分離
   1. カプセル鉗子と解剖はさみ (大小) を使用して心から胸腺、気管、脂肪と結合組織の残基のような余分な組織を削除します。大動脈を明らかにし、第 1 および第 2 鰓建築間解剖はさみ (大小) と断絶
   2. 蛍光灌流システムの滴下を開始します。蛍光灌流システムのカニューレに中心を置き、ワニ クランプと後で準備されたスレッドに最初じっと見つめます。それは血の自由まで心をすすぎします
   。
   3. 5-6 mL 暖かいパウエル中 25 mg コラゲナーゼを溶かし、12.5 μ L CaCl ₂ (30 μ M) を追加しています
   。
   4. は滴下心を蛍光灌流システムに接続されているガラス漏斗を移動することによって循環を閉じて解決コラゲナーゼを灌流システムに追加します。毎秒 1 滴のドロップ速度と 25 分間灌流を開始
      。 注: 灌、心が膨らむし、蝋のような外観を取得します
   。
   5. は 25 分後に灌流を停止し、中心部を蛍光灌流システムから取り外します。心臓から大動脈、アトリア、および結合組織を削除し、右と左の心室を開きます
   。
   6. 90 ° の角度に 2 回心臓を切る (切断幅: 0.7 mm; 速度: 0.15 cm/s)。10 の 2 つのメスを使って手動でこのプロセスを繰り返す s 両側
   。
   7. は、新しいチューブ (50 mL) に灌流中の 12 mL を転送します。37 で別の 5 分間この媒体およびダイジェストのセルにセル スラリーを注ぐ ° c. ミックス ソリューション毎分
   。
   8. 新しいチューブ (50 mL) にナイロン メッシュ (200 μ m) を通して消化の心臓を持つソリューションにフィルターを適用します
   。
   9. は、上清 29 x g で 3 分間破棄でフィルタ リング ソリューションを遠心し、12.5 μ L CaCl ₂ (250 μ M) 細胞ペレットを含む 6 mL 暖かいパウエル培地を追加します。滑らかな揺れ動きを通じてペレットを再懸濁します。再び 2 分破棄上清の 29 x g で遠心し、6 mL 暖かいパウエル媒体 25 μ L CaCl ₂ (500 μ M) で置換を追加します。穏やかな揺れ動きを通じて細胞ペレットを溶解し、12 mL 暖かいパウエル媒体含む 120 μ L CaCl ₂ (1 mM) を追加します。3 回目 16 × g で 1 分間遠心します。再度、上清を削除します
   。
   10. 細胞ペレットを混ぜてあらかじめ加温めっき中です
   。
   11. は、培養皿からプレめっき媒体を削除します。メッキ各培養プレートに、分離心筋細胞を含む培地 1 mL を転送します。インキュベート, 37 ° C で新鮮な分離心筋
   12. は、培養皿からメッキ媒体を削除します。洗浄媒体各培養皿に 1 mL を追加し、媒体を変更することがなく 6 日に 37 ° C でプレートを蓄える
   。
   13. の異なった化学薬品と ARVC 治療の影響を調査するためまず洗浄媒体と、その後別の化学物質を追加することによってメッキ媒体を更新します
       。 注: 光学顕微鏡レベルで評価: 各セルの準備と 150 に 300 心筋細胞が光顕で一日監視必要があります。外見によるとグループにすべてカウント心筋細胞を分割 (例えば、 " 棒状 "、" ダウン ラウンド "、" 拡散 " と " 異常な外観 ")。カテゴリ " 拡散 " 偽足のような構造を持つすべての心筋細胞が含まれています。" 異常な外観 " 不規則な表面を持つすべて ARVC しない検出のまま細胞膜が含まれています
   。

3。例実験

1. 1. 共焦点レーザー顕微鏡による培養中に ARVC の分析の形態と構造変換を 大人の心筋細胞の免疫蛍光/蛍光染色 をします。ファロイジン TRITC を使用して F-アクチンの構造を調査する " ロッド形 "、" ダウン ラウンド " と " 拡散 " ARVC。メーカーによると染色を実行 ' s プロトコル。ファロイジン TRITC 染色のための例は参照 ا ら に指定します。 ¹¹. 蛍光/蛍光染色と違い実験的治療 (例えば の間培われた大人の心筋収縮装置のデ- と再 differentiation でSwiprosin-1、イオノマイシン) 調べることができます
   。
2. リアルタイム定量的 RT-PCR (qRT PCR)
   1. 異なる遺伝子の mRNA 発現の変化を調査する qRT PCR を行う (例えば、 OSM Swiprosin 1, β-MHC) ARVC の栽培中。拡大培養皿を使用して十分なサンプル サイズ (内径: 60 mm) 2 mL の量。ARVC 5 培養皿の 1 つのサンプルが得られます。MRNA の単離と製造元によると cDNA の変換 ' s プロトコル
   。
3. イムノブロット法
   1. ARVC の培養中に (例えば Swiprosin 1) 蛋白質発現の変化を調査するため西部のしみを実行します。サンプルあたり 1 つの培養皿 (1 mL) を使用します
   。

結果

アダルト文化における心筋細胞:図 1は、最後の洗浄後、新鮮単離アダルト心筋 2 h の概要を示します。すべての心筋細胞の約 75% は、棒状の形態を持っていた。残りの 25% は、円形の形態とない検出そのまま細胞膜 (図 1) 異常な外観を示した。まで栽培 (6 日目) の最後にすべての心筋細胞の 15% を示した広がり、...

ディスカッション

大人の心筋細胞生体内での挙動は他の細胞 (例えば、神経細胞、内皮細胞、線維芽細胞、炎症細胞) と電気シンシチウム彼らを形作る多くの相互作用を受けます¹。したがって、分離と培養 ARVC の専ら大人の心筋細胞のストレス適応の勉強が必要です。隔離・培養 ARVC の主な効果は、: 1) 細胞外マトリックスと細胞間の連絡先から切断します。2) 収縮刺激から切断...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Langendorff perfusion system	inhouse construction		double-walled with a water based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm	inhouse construction
Abdominal shears	Aeskulap	BC772R
Capsule forceps	Eickemeyer	171307
Dissecting scissor large	Aeskulap	BC562R
Dissecting scissor small	Aeskulap	BC163R
Mash with Polyamid	Neolab	4-1413	mash size 200 μm
plastic disc	Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II	Worthington	LS004177