הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

Summary

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

Abstract

אחת הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע אנליזה פונקציונלית חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות מערכת ביטוי גנים ארעית. מערכת זו פותחה כדי גנים זרים אקספרס תחת השליטה של האמרגן baculoviral ב ביטוי ארעי פלסמידים. יתר על כן, מערכת זו ניתן להחיל על assay פונקציונלי של baculovirus עצמו או חלבונים זרים. מערכת ביטוי נרחב ביותר מבחינה מסחרית זמינים ג'ין ארעי מפותח בהתבסס על האמרגן מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). עם זאת, נצפתה רמה נמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים. לכן, מערכת ביטוי גנים ארעי נבנה לשיפור ביטוי חלבון. במערכת זו, פלסמידים רקומביננטי נבנו כדי להכיל את רצף המטרה תחת השליטה של דרוזופילה חום הלם 70 (Dhsp70) האמרגן. פרוטוקול זה מציג את היישום של זה חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו (V5 epitope עם היסטידין 6) /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9); מערכת זו זמינה רק עבור ביטוי גנים אלא גם להערכת פעילות אנטי-מוות של המועמד חלבונים בתאי חרקים. יתר על כן, מערכת זו יכולים להיות transfected שגם עם פלסמיד רקומביננטי אחד או transfected משותפת לשני פלסמידים רקומביננטי אויבת פוטנציאלית פונקציונלית בתאי חרקים. הפרוטוקול מדגים את היעילות של מערכת זו ומספק במקרה המעשי של טכניקה זו.

Introduction

שתי מערכות ביטוי חלבון נפוץ השתמשו לייצור חלבונים: פרוקריוטים חלבון ביטוי (Escherichia coli ג'ין ביטוי מערכת) ומערכות איקריוטים חלבון הביטוי. מערכת אחת של ביטוי חלבון איקריוטים הפופולרי הוא מערכת (BEVS)¹וקטור ביטוי baculovirus. Baculoviruses שימשו כסוכנים הדברה ביולוגית ברחבי העולם החקלאיים ואת יער מזיקים. בעשורים האחרונים, baculoviruses פותחו ככלים ביוטכנולוגי וקטורים ביטוי חלבון גם כן. הגנום של baculoviruses מורכב כפול גדילי DNA מעגלי ומעטפת nucleocapsids². עד היום, יותר מאשר seventy-eight baculovirus היה מבודד ברצף³. בהתבסס על המפל הטמפורלי של ביטויים ג'ין baculoviral בתאי חרקים המארח, שעתוק הגן ניתן לסווג ארבעה מפלי הזמנית, כולל מיידית מוקדם, מוקדם-נדחתה, מאוחר, מאוחר מאוד גנים⁴.

BEVSs נקבעו כך היזמים הגן באיחור (כלומר, פאון או p10 יזם) שימשו כדי להסיע את הגנים היעד, בזמן baculovirus רקומביננטי נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגית. ביטוי של חלבונים זרים בתאי חרקים על-ידי baculovirus רקומביננטי דומה לזה של חלבונים בתרבית של שינויים post-translational (מתאים לייצור גליקופרוטאין). לפיכך, baculovirus כבר בשימוש נרחב^5,6,7. עם זאת, מגבלה אחת היא הנוכחות של מסלולים שונים N-גליקוזילציה ב תאים חרקים⁷.

לכן, baculovirus ביטוי מערכת חדשה, מערכת ביטוי גנים ארעי, פותחה. מערכת זו מבטא גנים זרים תחת הכונן של היזמים מוקדם-מיידי baculoviral (כלומר-1 יזם) בתאי חרקים. באמצעות מערכת זו, חלבון המטרה ניתן מיד לבטא תחת השליטה של ie-1 יזם תוך שינוי מסלול N-גליקוזילציה בתאי חרקים, וכתוצאה מכך oligosaccharides N-מקושרים יותר⁷. יתר על כן, הגנים מוקדם-מיידי baculoviral משוקלטים על-ידי התא המארח RNA פולימראז II, אינם דורשים כל גורם ויראלי עבור הפעלה⁴. לכן, חלבונים זרים יכולים להתבטא בתאי חרקים תוך זמן קצר. עד כה, והחולף מערכת ביטוי גנים הוא אחד הטכנולוגיות החשובות ביותר לביצוע מבחני פונקציונלי חלבון במערכת baculovirus במבחנה תא תרבות. ניתן להחיל את המערכת כדי לנתח את הפונקציה של baculovirus או חלבונים זרים. אחת ממערכות ביטוי גנים ארעי זמינים מסחרית מבוסס על היזמים מוקדם-מיידי ג'ין (IE) של Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2, OpIE1 היזמים).

עם זאת, הרמה הנמוכה ביטוי של גנים זרים בתאי חרקים היה עדיין בעיה כאשר המערכת הביטוי מבוסס-יזם ג'ין ארעי אופי הייתה בשימוש^8,9,10. לפיכך, מערכת נוספת של ביטוי גנים ארעי נבנה בהתבסס על האמרגן של דרוזופילה חום הלם חלבון 70 (hsp70) ג'ין^8,9. האמרגן של hsp70 עובד ביעילות רבה יותר מאשר יזם baculoviral IE כאשר המושרה על ידי הלם חום בתאי חרקים¹⁰. במערכת זו, הגנים היעד שבאו לידי ביטוי תחת הכונן של דרוזופילה הלם חום (Dhsp70) 70 יזם. גנים זרים יכולים להיות בקלות משובטים לתוך פלסמיד ביטוי גנים ארעי על ידי שיטות שיבוט מבוסס ה-PCR. יתר על כן, השליטה של התזמון של ביטוי גנים יכול להתבצע על ידי אינדוקציה הלם חום.

בדו ח זה, אנו בצע את הגישה ולבטא את שלוש truncations שונים של הגן baculoviral (מעכב של אפופטוזיס 3, iap3 מן Lymantria xylina MNPV) באמצעות מערכת ביטוי חלבון ארעי מבוסס-הלם חום, ביטוי חלבונים אלה יחולו על ניתוח פעילות אנטי-מוות. מערכת זו יכול לבטא גם חלבונים זרים במהירות או יותר להחיל על הערכת פעילות אנטי-מוות החלבון בתאים sf9, בעודכם נהנים גם את הפוטנציאל שיוחל מבחני פעילות חלבונים אחרים.

Protocol

1. תכשירים

1. תרבית תאים חרקים
   1. להכין 50 מ של התא תרבות בינוני. כדי לבצע זאת, הוסף µL 500 של אנטיביוטיקה (המפוטריצין = 0.25 µg/mL, פניצילין = 100 יחידות/mL, סטרפטומיצין = 100 µg/mL) ו 5 מ של חום-לא פעיל העובר שור סרום ללא סרום תא בינוני תרבות (ללא FBS או אנטיביוטיקה).
      הערה: מחממים את הנסיוב שור עוברית-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים לפני השימוש.
   2. לשמור על זחל כנימה frugiperda (פרפראים: תנשמיתיים), תאים חרקים sf9. ניתוק ca. 80% של תאים מן 25 ס מ² תא תרבות הבקבוק ע י ניעור את הבקבוק, לבדוק תחת מיקרוסקופ אור. לאחר מכן, להעביר 50% של התליה תא חדש 25 ס מ² תא תרבות בקבוקון ולאפשר את התאים לצרף למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להחליף את המדיום מ ל תא טריים תרבות בינונית ולצמוח בתוך אינקובטור ב 28 º C. מעבר תאים כל 2-3 ימים בהתאם גדילת התאים.
2. הכנה של פלסמידים תא תרביות תאים
   1. להוסיף שברי DNA המטרה (למשל, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 ג'ין וקבועים שלה מחיקה) לתוך pDHsp/V5-שלו על ידי מבוססי ה-PCR שיבוט שיטה¹¹. בדוק הצמיחה של טרנספורמציה המושבות על-ידי המושבה PCR באמצעות PCR מאסטר מיקס (2 X) ופריימר pDhsp-F2/אופ-IE2R את הגדר. לאשר את רצפי פלסמיד באמצעות שירות מסחרי רצף.
      הערה: טבלה 1 מציגה את צבעי בסיס המשמש PCR של המבנה המתאים.
   2. תרבות בודדת ברצף חיידקי מושבות, אשר מכילים מבנים פלסמיד הנ ל (שלב 1.2) ב 200 מ ל LB בינוני המכיל נבחרת אנטיביוטיקה (50 µg/mL), בהתאמה.
   3. לחלץ את פלסמידים בתרבית e. coli באמצעות Midi פלסמיד ערכת לפי הוראות היצרן¹².
3. מכינים ציפוי בינוני על ידי ערבוב 1.5 mL תא תרבות בינוני ו- 8.5 מ של התא ללא סרום תרבות בינוני.
4. להכין ואקטינומיצין D (ActD) תא תרבות בינוני על-ידי הוספת µL 1.5 ActD מניות (1 מ"ג/מ"ל) לתוך 10 מ"ל של התא תרבות בינוני (ריכוז סופי = 150 ng/mL). חנות ב 4 º C.

2. חלבון ביטוי ארעית

1. תא זריעה
   1. לקצור את התאים sf9 ע י ניעור תרבות את הבקבוק, להפלת ליפול התליה תא שפופרת 50 מ ל ו להעביר 10 µL hemocytometer על ידי פיפטה P10. לספור את מספר התאים במיקרוסקופ אור.
   2. צלחת 3 × 10⁵ תאים sf9 לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 24-ובכן למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את המדיום 0.5 מ של ציפוי בינוני.
2. תרביות תאים של פלסמידים
   1. תא שתדללו תרביות תאים ריאגנט: 8 לדלל µL של התא מגיב תקנים 100 µL תא ללא סרום תרבות בינוני, מיקס על ידי vortexing 1 s.
   2. להוסיף 2 µg של פלסמיד דנ א (pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו) לתוך µL 100 של התא ללא סרום תרבות בינונית, מערבבים על-ידי vortexing עבור 1 s (איור 2).
   3. לשלב ה-DNA פלסמיד מדולל ו ריאגנט תרביות תאים תאים מדולל (210 µL), ומערבבים על ידי vortexing עבור Incubate ס' 1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. להוסיף µL 210 של ה-DNA תרביות תאים ריאגנט התערובת dropwise על התאים באמצעות פיפטה P1000. דגירה-28 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
   5. החלף את המדיום ציפוי 0.5 מיליליטר תא תרבות בינונית בעזרת פיפטה של P1000. לאטום את הצלחת 24-ובכן עם קלטת, דגירה התאים ב 28 ° C עבור 16 h.
3. חום לזעזע את התאים transfected: לשים את הצלחת בתוך אמבט מים 42 ° C (צף על פני המים). חום במשך 30 דקות ולחזור את הצלחת 24-ובכן החממה 28 ° C.
4. זיהוי של ביטוי חלבון
   1. לאחר 1 h או 5 שעות הלם חום, לשטוף את התאים 0.5 מ ל 1 x PBS מאגר בקצרה שלוש פעמים.
      הערה: לדלל 10 x PBS מאגר 1 x PBS מאגר על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS 10 x 9 מ ל עיקור ddH₂O
   2. Lyse התאים עם µL 40 1 x מרחביות בטעינת צבע על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
      הערה: לדלל 4 x מרחביות הטעינה לצבוע על ידי ערבוב µL 30 1 x מאגר PBS ו 10 µL של 4 x מרחביות דוגמת המאגר.
   3. מחממים את דגימות חלבון ב 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בתוך גוש חום, ספין למטה עבור 1 דקות, לשים קרח תספיג וזמינותו.
   4. המערבי כתם assay
      בצע את ההליך של שיטת תספיג אסלאמי, Lujan¹³. לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ג ' לים-¹⁴: ג'ל אחד נתון כחול Coomassie מכתים (טעינת פקד לבדיקת כי כמות חלבון דגימות טעון בכל טוב שווה סכום) והשני שעבר Western כתם assay, על פי אסלאמי Lujan¹³ .
   5. לזהות חלבונים מתויג V5 פיוז'ן עם נוגדן anti-V5 הארנב (5 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:5000 במאגר TBST לעבוד ריכוז 1 µg/mL), עז ארנב אנטי איג-חזרת peroxidase (HRP) המספר המשלים (0.8 מ"ג/מ"ל) (דילול 1:10000 במאגר TBST לעבודה ריכוז 0.08-µg/mL).
      הערה: התאם את אחוז לזיהוי ל- 17.5% כאשר המשקל המולקולרי של חלבון להיות < 17 kDa.

3. אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay

1. ג'ין-induced תא אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. שיתוף transfect µg 1 של pDHsp/D-rpr/דגל-שלו פלסמיד DNA (גן המכיל משרן אפופטוזיס) עם µg 1 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. ב 5 שעות החום שלאחר טיפול בהלם, לנהל את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2).
2. תא כימית-induced אפופטוזיס: חזור על ההליך הנ ל מ 2.1 2.3. בשלב 2.1.2, צלחת עונה 1 פרק 10⁶ sf9 תאים לתוך מכל קידוח לתוך צלחת 6-. טוב. Transfect µg 4 של פלסמיד ה-DNA [וקטור pDHsp70/V5-שלו (בקרה שלילית), pDHsp70-Ac-P35/V5-שלו (בקרה חיובית), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-שלו, pDHsp70-Ly-IAP3-ביר/V5-שלו או pDHsp70-Ly-IAP3-טבעת/V5-שלו, בהתאמה.]. 5 שעות החום שלאחר הלם, יטפל בתאים sf9 עם 2 מ של ActD תא תרבות בינונית עבור 16 h, לערוך את הבדיקה הכדאיות של התא (איור 2).
   הערה: אחסון מינימלי כדי לכסות באר אחת צלחת 6-ובכן הוא 1 מ"ל.
3. לבצע לעיל אנטי-אפופטוטיים להיפגע פעילות assay הניסויים, כולל 3.1 ו- 3.2 triplicates.

4. תא הכדאיות assay

1. לשטוף את התאים שטופלו על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר PBS x 1 על 1 דקות 3 פעמים. Resuspend התאים על ידי pipetting 1 מ"ל-1 x-PBS-מאגר המכיל 0.04% trypan blue, כתם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. העברת התליה תא לתוך microtube 1.5 מ.
   הערה: 0.4% trypan blue הפתרון מדולל על ידי ערבוב 9 מ ל 1 x PBS מאגר 1 מ"ל 0.4% trypan blue פתרון.
2. להעביר hemocytometer עם פיפטה P10 10 µL trypan blue מוכתמת תא ההשעיה ולספור את התאים קיימא שלם תחת מיקרוסקופ אור.
3. ניתוח סטטיסטי
   1. לחשב את נתוני ההקלטות, להציג האמצעים של ± ש בכל סעיפי האישום.
   2. לנתח את הנתונים באמצעות-זנבית מבחן של התלמיד t על ידי Microsoft Excel. מגדירים נתונים משמעותיים מבחינה סטטיסטית P-הערך < 0.05.

תוצאות

אורך מלא, אחרים truncations שני (ביר וטבעת תחומים) של Ly-IAP3 מ- LyxyMNPV היו overexpressed בתאים sf9, בהתבסס על החום מבוסס-הלם pDHsp/V5-שלו /זחל כנימה frugiperda נייד מערכת (תא sf9). PDHsp/V5-שלו הכיל דרוזופילה חום הלם חלבון מקדם מכירות, אשר כוננים ביטוי גנים במורד הזרם בטמפרטורה של 42 ° C בתנאי באמצעות...

Discussion

המושג חום מבוססי הלם pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת תוארה לראשונה על ידי קלם. et al. ב 1994⁸. השוואה של יזם ג'ין baculoviral (IE1) ודרוזופילה hsp70 הראו שכי hsp70 היה יעילות גבוהה יותר של יתוש תאים¹⁰. יתר על כן, כתוצאה אינדוקציה הלם חום, העיתוי של ביטוי חלבון יכול להיות נשלט בד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)