Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

Résumé

Ce protocole décrit un système d’expression de protéine induite par le choc de chaleur (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9), qui peut être utilisé pour exprimant des protéines étrangères ou évaluation de l’activité anti-apoptotique de protéines étrangères potentiels et leur tronqué amine acides dans les cellules d’insectes.

Résumé

Le système d’expression de gène transitoire est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer l’analyse fonctionnelle de protéines dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Ce système a été développé pour des gènes étrangers expriment sous le contrôle du promoteur baculoviral dans les plasmides d’expression transitoire. En outre, ce système peut être appliqué à un test fonctionnel du baculovirus lui-même ou des protéines étrangères. Le système d’expression génétique transitoire plus largement et commercialement disponible est développé basé sur le promoteur du gène précoce immédiat (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Cependant, un niveau faible expression de gènes étrangers dans des cellules d’insectes a été observé. Par conséquent, un système d’expression de gène transitoire a été construit pour améliorer l’expression de la protéine. Dans ce système, les plasmides recombinants furent construits pour contenir la séquence cible sous le contrôle du Drosophila chaleur choc 70 (Dhsp70) promoteur. Ce protocole présente l’application de cette chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His (épitope V5 avec 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cellule système (cellules sf9) ; ce système est disponible non seulement pour l’expression des gènes mais aussi pour évaluer l’activité anti-apoptotique des protéines de candidat dans des cellules d’insecte. En outre, ce système peut être soit transfecté avec un plasmide recombinant ou transfectées conjointement deux plasmides recombinants potentiellement fonctionnellement antagonistes dans des cellules d’insecte. Le protocole montre l’efficacité de ce système et fournit un cas pratique de cette technique.

Introduction

Deux systèmes d’expression de protéines ont été couramment utilisées pour produire des protéines : systèmes d’expression de protéine procaryote (système d’expression géniqueEscherichia coli ) et des systèmes d’expression protéine eucaryote. Un système d’expression de protéine eucaryote populaire est les baculovirus expression vector system (BEVS)¹. Les baculovirus ont été utilisées comme agents de lutte biologique dans le monde entier d’agricoles et sylvicoles nuisibles. Dans les dernières décennies, les baculovirus ont été élaborés comme des outils biotechnologiques pour les vecteurs d’expression protéique ainsi. Le génome des baculovirus composé d’ADN à double brin circulaire et enveloppé de nucléocapsides². À ce jour, plus de soixante dix-huit baculovirus isolats ont été séquencées³. Se fondant sur la cascade temporelle des baculoviral expressions de gènes dans des cellules d’insecte hôte, la transcription des gènes pouvait être classée dans quatre cascades temporelles, dont précoces immédiats, gènes retardé, début, fin et très fin⁴.

BEVSs ont été désignées pour que les promoteurs de gènes très fin (c.-à-d.polyèdre ou p10 promoteur) ont été utilisées pour conduire les gènes cibles, tandis que le baculovirus recombinant a été généré par recombinaison homologue. Expression des protéines étrangères dans des cellules d’insecte de baculovirus recombinant est similaire à celle des protéines de mammifères aux modifications post-traductionnelles (adaptées pour la production de glycoprotéines). Ainsi, le baculovirus a été largement utilisé^5,6,7. Toutefois, l’une des limites sont la présence de différentes voies de la N-glycosylation dans des cellules d’insecte⁷.

Par conséquent, un nouveau système d’expression baculovirus, le système d’expression génétique transitoire, a été développé. Ce système exprime des gènes étrangers dans le lecteur de baculoviral promoteurs précoces immédiats (c’est à dire 1 promoteur) dans des cellules d’insecte. En utilisant ce système, la protéine-cible peut être exprimée immédiatement sous le contrôle du promoteur c’est à dire 1 tout en modifiant la voie N-glycosylation dans des cellules d’insecte, résultant en une meilleure oligosaccharides liés à N⁷. En outre, baculoviral gènes précoces immédiats sont transcrits par l’ARN polymérase II la cellule-hôte et ne nécessitent pas de n’importe quel facteur viral pour activation⁴. Par conséquent, protéines étrangères peuvent être exprimées dans des cellules d’insecte dans de brefs délais. À ce jour, le transitoire, système d’expression génique est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer des tests fonctionnels de protéine dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Le système peut être appliqué pour analyser la fonction de baculovirus ou de protéines étrangères. Parmi les systèmes d’expression génétique transitoire disponibles dans le commerce repose sur les promoteurs de gènes précoces immédiats (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (promoteurs de OpIE2 et OpIE1).

Cependant, le plus faible niveau d’expression de gènes étrangers dans des cellules d’insecte était toujours un problème lorsque le système d’expression de gène transitoire axée sur le promoteur OpIE a été utilisé^8,9,10. Ainsi, un autre système d’expression de gène transitoire a été construit selon le promoteur de la drosophile chaleur choc protéine 70 (hsp70) gène^8,9. Le promoteur de hsp70 fonctionne plus efficacement que le promoteur baculoviral IE lorsque induite par choc thermique dans des cellules d’insecte¹⁰. Dans ce système, les gènes cibles ont été exprimés dans le lecteur de 70 (Dhsp70) promoteur de Drosophila chaleur choc. Des gènes étrangers peuvent être facilement clonés dans le plasmide d’expression génétique transitoire par clonage des méthodes basées sur la PCR. En outre, le contrôle du moment pour l’expression des gènes peut être effectué par induction de choc thermique.

Dans ce rapport, nous suivons la démarche et exprimer trois troncatures différentes du gène baculoviral (inhibiteur de l’apoptose 3, iap3 de Lymantria xylina MNPV) en utilisant le système d’expression de protéine transitoire axée sur le choc thermique et d’appliquer ces protéines exprimées sur l’analyse de l’activité anti-apoptotique. Ce système peut exprimer soit rapidement de protéines étrangères ou être davantage appliqué à l’évaluation de l’activité de la protéine anti-apoptotique dans les cellules sf9, tout en ayant le potentiel pour être appliquée à d’autres tests d’activité protéine.

Protocole

1. les préparatifs

1. Culture cellulaire insectes
   1. Préparer 50 mL de milieu de culture cellulaire. Pour ce faire, ajouter 500 µL d’antibiotiques (amphotéricine B = 0,25 µg/mL, la pénicilline = 100 unités/mL, streptomycine = 100 µg/mL) et 5 mL de sérum bovin fœtal inactivés par la chaleur dans le milieu de culture sans sérum cellulaire (sans antibiotiques ou FBS).
      Remarque : Faire chauffer le sérum de veau fœtal à 65 ° C pendant 30 min dans un bain d’eau avant utilisation.
   2. Maintenir Spodoptera frugiperda (Lepidoptera : Noctuidae), des cellules d’insecte sf9. Détacher environ 80 % des cellules du flacon de culture cellulaire 25 cm² en agitant le flacon et vérifiez sous microscopie optique. Ensuite, transférer 50 % de la suspension cellulaire dans un nouveau flacon de culture 25 cm² cellulaire et permettent les cellules attacher pendant 15 min à température ambiante. Remplacez le support par 5 mL de milieu de culture cellulaires fraîches et de grandir dans un incubateur à 28 ° C. Cellules de passage tous les 2 à 3 jours selon la croissance cellulaire.
2. Préparation des plasmides pour la transfection de cellules
   1. Insérez les fragments d’ADN cible (par exemple, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gène et ses constructions de suppression) dans pDHsp/V5-His par PCR-based clonage méthode¹¹. Vérifier la croissance des colonies transformées en colonie PCR à l’aide de la PCR Master Mix (2 X) et l’amorce de pDhsp-F2/Op-IE2R défini. Confirmez les séquences de plasmide en service commercial de séquençage.
      Remarque : Le tableau 1 répertorie les amorces utilisées pour PCR et les constructions correspondantes.
   2. La culture unique séquencé des colonies bactériennes, qui contiennent les constructions de plasmide susmentionnés (étape 1.2) dans 200 mL LB moyen contenant choisi antibiotiques (50 µg/mL), respectivement.
   3. Extraire les plasmides de la cultivé e. coli à l’aide de Kit de plasmide Midi selon les instructions de fabricant¹².
3. Préparer médium placage en mélangeant 1,5 mL de milieu de culture cellulaire et 8,5 mL de milieu de culture sans sérum cellulaire.
4. Préparer le milieu de culture cellulaire de l’actinomycine D (ActD) en ajoutant 1,5 µL de ActD stock (1 mg/mL) dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (concentration finale = 150 ng/mL). Conserver à 4 ° C.

2. expression transitoire de la protéine

1. Cellule de semis
   1. Récolter les cellules sf9 en agitant le flacon de culture, renverser et tomber la suspension cellulaire au tube de 50 mL, transférer 10 µL dans hémocytomètre par une pipette P10. Compter le nombre de cellule sous un microscope optique.
   2. Plaque de 3 cellules sf9 de⁵ × 10 dans chaque puits dans une plaque 24 puits pendant 15 min à température ambiante. Remplacez le support par 0,5 mL de milieu de placage.
2. Transfection des plasmides
   1. Réactif de transfection de cellules diluées : diluer 8 µL de réactif de transfection de cellules dans 100 µL un milieu de culture sans sérum cellulaire et mélanger au Vortex pendant 1 s.
   2. Ajouter 2 µg d’ADN (pDHsp70-Ac-P35/V5-His pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His) plasmidique dans 100 µL de milieu de culture sans sérum cellulaire et mélanger au Vortex pendant 1 s (Figure 2).
   3. Combiner l’ADN de plasmide dilué et réactif de transfection de cellules dilué (210 µL) et mélanger au Vortex pendant 1 s. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
   4. Ajouter 210 µL du mélange de réactif de transfection d’ADN goutte à goutte sur les cellules par une pipette P1000. Incuber à 28 ° C pendant 5 h.
   5. Remplacer le médium placage avec 0,5 mL de milieu de culture cellulaire à l’aide d’une pipette P1000. Sceller la plaque 24 puits avec du ruban adhésif et incuber les cellules à 28 ° C pendant 16 h.
3. Les cellules transfectées de choc thermique : mettre la plaque dans un bain d’eau de 42 ° C (flottant à la surface de l’eau). Faire chauffer pendant 30 min et remettez la plaque 24 puits dans l’incubateur de 28 ° C.
4. Détection de l’expression des protéines
   1. Après 1 h ou choc thermique 5 h, laver les cellules avec 0,5 mL de solution tampon PBS 1 x brièvement trois fois.
      NOTE : Diluer 10 x tampon PBS 1 x tampon PBS en ajoutant 1 mL de tampon PBS 10 x 9 mL stérilisé ddH₂O
   2. Lyser les cellules avec 40 µL de 1 x SDS chargement colorant par pipetage de haut en bas.
      NOTE : Diluer 4 x SDS chargement colorant en mélangeant 30 µL de 1 x tampon PBS et 10 µL de 4 x SDS solution tampon.
   3. Chauffer les échantillons de protéine à 98 ° C pendant 10 min dans un bloc chauffant, tournez vers le bas pendant 1 min et mettre sur la glace pour l’analyse par transfert Western.
   4. Western blot assay
      Suivez la procédure d’essai par transfert Western du Eslami et Lujan¹³. Exécuter des gels de SDS-PAGE¹⁴: un gel soumis au bleu de Coomassie (contrôle de chargement pour vérifier que la quantité d’échantillons de protéines chargés dans chaque bien est égale au montant) et l’autre soumis à Western blot assay, selon Eslami et Lujan¹³ .
   5. Détecter des protéines de fusion V5 marquées avec des anticorps de lapin anti-V5 (5 mg/mL) (dilution 1 : 5000 dans un tampon TBST à travailler la concentration de 1 µg/mL) et chèvre anti-lapin IgG-raifort peroxydase de raifort (HRP) conjugué (0,8 mg/mL) (dilution 1 : 10000 dans un tampon TBST au travail concentration de 0,08 µg/mL).
      Remarque : Ajustez le pourcentage de polyacrylamide à 17,5 % lorsque le poids moléculaire de protéine d’être < 17 kDa.

3. anti-apoptotique analyse d’activité

1. L’apoptose cellulaire induite par le gène : répéter la procédure précitée de 2.1 à 2.3. Transfecter Co 1 µg d’ADN (gène d’inducteur de l’apoptose contenant) pDHsp/D-rpr/pavillon-His plasmidique avec 1 µg d’ADN plasmidique [pDHsp70/V5-His vector (témoin négatif), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (contrôle positif), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement.]. À 5 h chaleur après un traitement de choc, procéder à l’analyse de viabilité de cellules (Figure 2).
2. L’apoptose cellulaire induite par le produit chimique : répéter la procédure précitée de 2.1 à 2.3. À l’étape 2.1.2, plaque 1 x 10⁶ cellules sf9 dans chaque puits dans une plaque 6 puits. Transfecter 4 µg d’ADN plasmidique [pDHsp70/V5-His vector (témoin négatif), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (contrôle positif), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement.]. À un choc thermique après 5 h, traiter les cellules sf9 avec 2 mL de milieu de culture cellulaire ActD pendant 16 h et procéder à l’analyse de viabilité de cellules (Figure 2).
   Remarque : Volume minimum pour couvrir un puits de la plaque 6 puits est de 1 mL.
3. Réaliser les expériences dosage de l’activité anti-apoptotique ci-dessus, y compris les points 3.1 et 3.2 en géométrie.

4. analyse de viabilité de cellules

1. Laver les cellules traitées en ajoutant 1 mL de solution tampon PBS 1 x pour 1 min 3 fois. Remettre en suspension les cellules en pipette 1 mL 1 x la solution tampon PBS contenant 0,04 % bleu trypan et tache pendant 3 min à température ambiante. Transférer la suspension cellulaire dans un microtube 1,5 mL.
   Remarque : Diluer la solution de bleu de trypan 0,4 % en mélangeant 9 mL de PBS de 1 x tampon et 1 mL bleu trypan de 0,4 % solution.
2. Transférer 10 suspension de cellules colorées au bleu de trypan µL à l’hémocytomètre avec une pipette de P10 et de compter les cellules intactes viables sous un microscope optique.
3. Analyse statistique
   1. Calculer les données enregistrées et de présenter les moyens ± S.D. pour chaque chef d’accusation.
   2. Analyser les données en utilisant le test de Student bilatéral t par avec Microsoft Excel. Qualifier les données statistiquement significatives P-valeur < 0,05.

Résultats

Toute la longueur et autres deux troncatures (domaines BIR et anneau) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV étaient surexprimés dans les cellules sf9, basée sur la chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda cellulaire (cellules sf9). Le pDHsp/V5-His contenait un drosophile chaleur choc promoteur de la protéine, qui entraîne l’expression des gènes en aval à une température de 42 ° C condition en utilisant des facteurs de transcriptionnelles cellulaires et l...

Discussion

Le concept de système de pile à pDHsp/V5-His/sf9 axée sur le choc thermique a été décrite par Clem et al. , 1994,⁸. Comparaison du promoteur du gène baculoviral (IE1) et Drosophila hsp70 a montré que hsp70 avaient une plus grande efficacité en moustique cellules¹⁰. En outre, en raison de l’induction de choc thermique, le moment d’expression de la protéine pourrait être contrôlé précisément après le traitement de choc t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)