היצרות של הכלילי התחתון: מודל מאתר של פקקת ורידים עמוקה

Summary

נתאר כאן היצרות ב הכלילי התחתון כמודל מאתר של פקקת ורידים עמוקה. מודל זה recapitulates הגבלת זרימת דם, אחד הגורמים המפעילים העיקריים של פקקת ורידים בבני אדם.

Abstract

עמוק הווריד טרומבוזה (פקקת) וסיבוך ההרסניות שלה, תסחיף ריאתי, בעיה בריאותית חמורה עם תמותה גבוהה. מנגנוני היווצרות כגון בורידים נותרים מעורפלים. חוסר ניידות (למשל, לאחר ניתוח או טיסות למרחקים) הוא אחד הגורמים העיקריים שהובילו DVT. התוצאה pathophysiological של חוסר ניידות היא זרימת דם תקיעות שסתומי ורידים. . הנה, מודל מתואר המחקה כזה הפרעות זרימה כגורם נהיגה פקקת. במודל זה, נוצרת זרימה חלקית שהגבלת (היצרות) הכלילי התחתון (IVC). סגירה של-90% של לומן IVC במשך 48 שעות תוצאות התפתחות מבנית דומים לאלה בבני thrombi. הדמיון: i) רוב אמצעי האחסון כגון הוא אדום, קרי, מורכב כדוריות דם אדומות, פיברין, ii) נוכחות של חלק לבן (שורות זון), טפט אנדותל iii) ללא-חשופה רמות מוגברות iv) פלזמה D-דימר, v) אפשרות למנוע פקקת מאת הפארין. מגבלות כוללות גודל משתנה thrombi ואת העובדה כי אחוז מסוים של פראי-סוג עכברים (0 - 35%) לייצר כגון. בנוסף התצפית הויזואלית מדידה, thrombi אולי ניתן לאבחן על ידי טכנולוגיות לא פולשנית, כגון בדיקת אולטרה סאונד, אשר מאפשר ניטור את הדינמיקה של התפתחות כגון. נקודות זמן קצר יותר (h 1-6), מיקרוסקופיה intravital ניתן להחיל ישירות לצפות אירועים (למשל, גיוס של תאים לקיר כלי) מקדים כגון היווצרות. השימוש בשיטה זו על-ידי מספר צוותים ברחבי העולם הפכה אותו ניתן לחשוף מנגנונים בסיסיים של DVT החניכה לזהות מטרות אפשריות שעשוי להיות מועיל עבור מניעת שלו.

Introduction

פקקת ורידים עמוקה (DVT) היא הפיתוח של thrombi בורידים עמוקים, בדרך כלל (אך לא רק) ברגליים. ב במילות חיבור עם תסחיף ריאתי (PE; איזור ביחד כמו פקיקי ורידי, VTE) זה מתפתח אצל האמריקאים כ 900,000 מדי שנה ומייצג של חמור נושא הבריאות ובעיה חסכוני^1,2. PE, סיבוך של DVT, מתרחשת כאשר כגון מקבל תלוש ממקום מושבו ההתחלתי, מגיע אל הריאות, דבר העלול לגרום אי ספיקה נשימתית ומוות. מספר ההרוגים של VTE חורג התמותה לאיידס, השד סרטן ותעבורה תאונות, משולב³.

הגורם שגורם DVT חוץ ידוע סיבות, כמו סרטן או טראומה, הוא חוסר ניידות ^4,5. ייתכן שהדבר נובע מכך ניתוח (במיוחד אורטופדיות), שיתוק, טיסות למרחקים ארוכים או סיבות אחרות. זרימת הדם בורידים תלוי משאבת השרירים, לכן האיבר תוצאות הנייח בדם קיפאון לזרום פנימה שסתומי ורידים, מה שמוביל פקקת. מטרת השיטה המתוארת במסמך זה הוא מסכם את הדברים כאלה דם זרימה עיוות^6,7. הגבלת זרימת חלקית ב הכלילי התחתון (IVC) מחקה התנאים שנוצרו בשסתומי ורידים האנושי ותוצאות היווצרות כגון דומה למבנה האדם thrombi⁶. חלק גדול כגון אדום, והיא מורכבת כדוריות דם אדומות, פיברין, התאגדות של טסיות. Thrombi יש קטן "החלק הלבן" מועשרים בטסיות הדם (איור 1), המזכירים פסי זון"המתואר thrombi ורידית אנושי. בשני חלקי כגון מכילים גם נויטרופילים⁸, אשר הם בין התאים הראשון בכדי להתגייס באתר של עתידיות כגון^6,9. נויטרופילים בהחלק האדום לגרש מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), ואילו נויטרופילים בהחלק הלבן נראה להיות רשתות⁸. באופן דומה ל- DVT אנושי, פקקת בעכברים מלווה פלזמה מוגבה רמות D-דיימר (איור 2). הפארין (enoxaparin), המשמש עבור טיפול מונע DVT בחולים, מונע גם פקקת בעכברים. יתרון חשוב של שיטה זו הוא היעדר חסיפה אנדותל⁹, שהוא מאפיין של DVT האנושי¹⁰. תכונה זו הופכת היצרות IVC דגם הרלוונטית קלינית יותר של DVT מאשר, למשל, אינדוקציה של קרישי דם על-ידי הברזל ותחמוצת כלוריד, אשר גורם אנדותל חסיפה, כאשר thrombi מכילים בעיקר טסיות^{11, 12,13}. דגם של הקפאה מלאה ב- IVC הוא המועדף על ידי מספר קבוצות^14,15,16. בניגוד היצרות, שבו זרימה שיורית נשמר בתוך הכלי, יישום של ההקפאה לחלוטין עצירה של זרימת, מגביל את הנגישות של חומרים מערכתית בניהול האתר פקקת. בנוסף, נראה כי המנגנונים שבבסיס פקקת הנגרם על ידי היצרות ו- stasis הם שונים: היצרות גורמת להתפתחות דלקת מקומית (הפעלה של אנדותל, שחרור של Weibel-Palade גוף תוכן, גיוס של תאים חיסוניים, טסיות הדם לקיר כלי) גורם^9,6,"immunothrombosis"¹⁷, ואילו stasis נראה לזירוז מעדיף פקקת, בפרט, על בסיס רקמות פקטור קרישה אחרים, מנגנונים הקשורים ופיברינוליזה^18,19,20. לפיכך, הדגמים היצרות ו- stasis משקפים שונה מעט היבטים של פיתוח כגון ורידים, למרות המנגנונים שלהם בהחלט לחפוף. דגם IVC electrolytic (EIM) של DVT^21,22 גורם כגון באופן חלקי בלבד occluding הקיר כלי. לכן, זה נוח לבדיקת השפעת ניהול מערכתי של תרופות שונות על כגון צמיחה. מודל זה, לעומת זאת, מבוסס על ההנחה שיבוש IVC קיר שלמות (החדרת מחט) אינדוקציה של קרישי דם על ידי זרם חשמלי, שהופך את הרלוונטיות pathophysiological של מנגנון זה לפחות לויכוח.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי חיה רווחה אתית סקירה הגוף ואת משרד הפנים בבריטניה (בריטניה, פרוייקט רשיון 40/3745). עכברים על רקע C57BL/6, 8-12 שבוע 19-25 גרם משקל, של שני המינים משמשים.

1. בעלי חיים הרדמה

1. במקום עכבר לתא אינדוקציה, לגרום הרדמה על ידי תערובת של 5% איזופלוריין 100% חמצן. קצב זרימה של חצי ליטר לדקה חכה עד העכבר לגמרי מפסיקה לנוע ושימוש תדירותו של נשימה הופך נדיר.
2. להסיר את העכבר מן החדר ולגלח את הבטן קוצץ חשמלי. הסרת שיער מהבטן יסודי ככל האפשר כדי למנוע זיהום של חלל הבטן.
3. הנח את העכבר במצב פרקדן ולמקם את האף של העכבר לתוך קונוס מקושרים למערכת הרדמה. להקטין את אחוז איזופלוריין ל 2-3% (האחוז המדויק אולי מעט שונים חיה חיה). ודא כי החיה שוכבת עם קצב הנשימה שלה להיות נמוך יותר מהרגיל אבל הימנעות מתנשף. אם להשתנק מתרחשת, להקטין את אחוז איזופלוריין ב- 0.5%.
   1. בדוק את רפלקס פדלים לאשר ההרדמה המתאים ולהתחיל ניתוח רק אם זה שלילי. הוטרינר משחה למרוח את העיניים למניעת יובש.
4. להחיל פתרון אנטי-אחרים (1% Hibitane) על העכבר של הבטן, לנגב האזור באמצעות כותנה סטרילי באד בדרך למעט פוטנציאל זיהום מחדש של האתר כירורגית (למשל, מבפנים להוציא בצורה מעגלית). חזור על 3 פעמים.

2. יישום של היצרות IVC ושחזור העכבר

הערה: כל הכלים באותה מידה כמו חומרים (צמר גפן, גזה, תמיסת מלח וכו) בא במגע עם אזור הניתוח חייב להיות סטרילי. המפעיל חייב יתנקה לפני הניתוח לבין ללבוש כפפות סטריליות והגלימה במהלך ההליך. מיקרוסקופ ידיות צריך לעטוף בנייר סטרילי.

1. לתת עכברים טיפול נגד כאבים לפני הניתוח במהלך תקופת הניסוי כולו. לדוגמה, השתמש הבופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג subcutaneously 30 דקות לפני הניתוח, ואז כל 12 שעות עד החיה היא מורדמים. כמו פקקת בשיטה זו מתפתחת באופן דומה לדלקת סטרילית, למנוע באמצעות תרופות אנטי דלקתיות כמו premedication.
2. מכסה את העכבר עם תלוי סטרילי, לעשות בו חור הכיסוי ותאבטחי לחשוף את האתר של הניתוח. בעזרת מספריים, לעשות חתך לאורך האמצע בבטן, 1.5 ס למטה מ בעצם החזה. בעזרת צמר גפן exteriorize המעיים בצד שמאל של העכבר, לכסות אותם עם גזה סטרילית טבולים תמיסת מלח חמים (37 מעלות צלזיוס) כדי למנוע ייבוש.
3. לזהות את IVC ואת סניפיה בצד (ייתכנו 0, 1 או 2 מהם) בכיוון סימטרית מהאתר של פיוז'ן של IVC עם הווריד של הכליה השמאלית. מאתרים ומפסיקים את כל הענפים גלוי בצד עם 7-0 התפרים Prolene אינרטי כמו קרוב IVC ככל האפשר.
   1. לא לנסות להחזיק הענפים בצד עם המלקחיים ישירות אלא למשוך אותם מחזיקות רקמת השומן הסובבים אותם עם מלקחיים ביד אחת ולגרום מנהרה מתחת הענף עם מלקחיים וביד השנייה. לא לסגור סניפים האחורי.
4. מחזיק הרקמות הסובבות עם מלקחיים, משוך את IVC למעלה ועזב בהפקת המתח באזור קטן בין של IVC את העורקים בדיוק על הזווית בין IVC את וריד הכליה השמאלית. קח בחשבון שזה כמעט בלתי אפשרי להפריד העורקים IVC אפילו 2-3 מ מ מתחת (לכיוון סימטרית).
5. באמצעות תנועות מתפצלים עם מלקחיים טיפים להפוך את יד ימין חור בין העורקים של IVC. יש לזכור כי התנועות יותר עשה, גבוה יותר הסיכוי לגרום נזק את כלי הקיבול. באופן אידיאלי, לנסות לצמצם את מספר תנועות 3-5.
6. להכין חלק 7-0 בתפר Prolene אינרטי של 2 ס מ. למקם אותו בתוך חלל הצפק של העכבר בצד שמאל של המפעיל בסביבה IVC.
7. משוך את IVC עזבו שוב. הכנס את העצות מלקחיים הנכון לתוך החור בין העורקים של IVC כך הטיפים להופיע בצד השני של IVC. קח את התפר ולמשוך אותו בחזרה דרך החור (איור 3א).
8. קשר זמני עם התפר אך אינו סגור. מקום 30G המחט ("כרווח") כפופות בקרס לתוך הקשר עכשיו אותו וסגור (איור 3ב).
9. הסר את מרווח (איור 3ג').
10. להחזיר המעיים בחזרה אל חלל הצפק עם כותנה באד ולהפיץ אותם באותה מידה בה.
11. סגור צפק 6-0 בתפר תפר נספג באמצעות לולאות רציפה. סגור את. לולאות הראשונה והאחרונה בתור קשר.
12. קרוב לעור בעזרת סיכות מתכת.
13. להחדיר את העכבר 0.5 מיליליטר חמים (37 מעלות צלזיוס) תמיסת גלוקוז subcutaneously כדי לשחזר את האיזון נוזלי של האורגניזם.
14. למקם את העכבר הכלוב בודדים חמים (25 ° C) קאמרית או חדר האוכל, ג'ל מים בתוך הכלוב. להתבונן עד העכבר הוא התאושש לחלוטין (בדרך כלל, סביב 1 h).

תוצאות

במסמך זה, מתואר דגם של DVT הנגרמת על ידי זרימת עיוות IVC. אינדוקציה של היצרות ב- IVC יוזם עיוות ותוצאות סטגנציה של זרימת הדם, לאחר זמן מה (במקרה זה, 48 h) בפיתוח של כגון, DVT מבנית דומה האדם thrombi (איור 1א'). הנוכחות של כגון בפנים IVC היא בקלות לזיהוי חזותי (איור 1B). הדמיון חשוב בין המודל לבין DVT האנושי הוא פלזמה מוגבה רמות D-דיימר (איור 2). D-דיימר הוא תוצר של פיברין השפלה, נוכחותו בדם מרמז כי תהליך קדחת פעיל קורה.

המודל מוצג שלב אחר שלב איור 3A-C. IVC חשוף בקפידה, חור בין העורקים של IVC מורכב ומשך התפר (Prolene 7-0) הוא דרך החור מתחת IVC. ואז IVC זה מאתרים מאת התפר מעל כרווח (30 גרם המחט, איור 3ד'), אחרי אשר מוסר את מרווח. הליך זה מאפשר כ- 90% סגירה של לומן IVC להשאיר 10% הנותרים פטנטים. פעולה זו מבטיחה סטגנציה בזרימת הדם המוביל בסופו של דבר פקקת.

איור 4 מדגים החיסרון העיקרי של המודל, כגון משתנה גודל. כל אלה thrombi התקבלו אצל אותו ניסוי מתבצע על עכברים זכר פראי סוג של מקור אחד, גיל, משקל הגוף דומה. למרות כל העכברים המיוצר thrombi (פקקת השכיחות של 100%), הגודל שלהם משתנה בבירור במגוון רחב.

איור 1: כגון נציג לאחר 48 שעות ההגבלה/היצרות. היצרות (A) כגון טיפוסי לאחר 48 שעות IVC. שימו לב אדום (שאושרו על-ידי תאי הדם האדומים) וחלקים לבן (מועשר טסיות). IVC (B) (משמאל) עם או בלי (מימין) כגון. גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : פלזמה D-דיימר רמות גבוהות לאחר היישום היצרות IVC. עכברים היו נענשים היצרות IVC. הדם נלקח בנקודות זמן המצוין, 1:9 התייצב עם 3.8% סודיום ציטרט, פלזמה הוכן על ידי צנטריפוגה (2,300 x g, 5 דקות), רמות D-דיימר נקבעו על ידי ערכת דיאגנוסטיקה לפי הנחיות היצרן. חוגים לייעד עכברים המופעלים באמצעות העמדת פנים, צלבים לייעד היצרות IVC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: לזרום הגבלת/היצרות במודל הנבוב נחות (IVC) של DVT בעכברים. שלבים רצופים של המודל מוצגים. (א) עשוי חור בין IVC את העורקים, בתפר עשה דרכו בסביבה IVC. (B) קשר סגורה מעל כרווח (30 גרם מחט). (C) מרווח מוסרת: התצוגה האחרונה המנתח רואה לפני סגירת העכבר. קו מקווקו צהוב demarcates של IVC. אירוו עומד על וריד הכליה השמאלית. גודל ברים = 0.2 מ מ. (ד) מרווח (30 גרם מחט). גודל ברים = 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 . השתנות כגון גודל.
עכברים היו נענשים היצרות IVC 48 שעות. הציג thrombi מתקבלים על אותו ניסוי. סולם ברים 2 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

. הנה, פרוטוקול שישקף היצרות IVC, אשר מחקה עיוות זרימת דם, גורם מפעילה מרכזי עבור DVT, מוצג. היצרות של IVC המניע לפיתוח thrombi 65-100% של C57BL/6 עכברים בתוך 48 שעות ו- 25-50% של עכברים בתוך h 2-6^6,8,23 (בריל A, שלא פורסמו נתונים, 2016). מגבלה משמעותית של השיטה הוא ההשתנות כגון גודל²⁴ (איור 4), אשר נצפית לאחר היצרות (48 שעות) IVC לטווח ארוך וגם לטווח קצר (6 שעות). הסיבות השתנות כזה (בהתחשב בעובדה זהה תנאים, כגון מרווח, הרדמה וכו ', משמשים) נותרים מעורפלים. אבל אחד יכול לשער אנטומי זה וריאציות בין העכברים (לדוגמה, רוחב של IVC, מספר ומיקום של הן בצד האחורי סניפים) ביסוד התופעה. ההשתנות כגון גודל הופך את שכיחות פקקת (אחוז של עכברים עם כגון) התוצאה העיקרית. פקקת שכיחות ניתן להשוות באמצעות טבלה לשעת חירום, בדיקה מדוקדקת של פישר. באחד הניסויים היה יוצא דופן כאשר מופחתת כגון גודל עם שכיחות פקקת אותו לאחר הזרקת נוגדנים עיכוב podoplanin נצפתה ⁷

שיטה זו שימושית במיוחד כאשר חניכה פקקת ורידים הוא למד. היא מאפשרת חקירת האירועים בתחילת הקיר כלי, כגון גיוס של תאים, המוביל בסופו של דבר פקקת. Pro - או אנטי - thrombotic השפעות הסמים שניתן להעריך באמצעות מודל זה עם שכיחות פקקת להיות הבדיקה העיקרית. היצרות במשך 48 שעות ישימה לחשוף של פנוטיפ נגד קדחת, ואילו היצרות 6-אייץ ' יכול לשמש אם הפנוטיפ prothrombotic צפוי. ניתן גם לבצע ניתוח היסטולוגית של כגון, IVC החומה המקיפה.

השאלה אם הצד מסתעף צריך להיות מאתרים או שמאלה פטנטים נשאר פתוח. קבוצה אחת הראו כי מצדו בצד סניפים אינה מגדילה כגון גודל, מיקום של ענף צדדי קרוב יותר מאשר 1.5 מ מ לאתר מצדו IVC פוגע באופן דרמטי כגון פיתוח²⁵. סגירת בצד סניפים עלול לגרום לפציעה אנדותל בהם, גם להאריך את הזמן של ניתוח²⁶. בידיים שלנו, חוסר סגירת סניף צד מקטין משמעותית שכיחות פקקת (ל 10-30% לאחר 48 שעות היצרות; בריל, לא פורסם) ולכן אנו מאתרים ומפסיקים את כל גלוי בצד סניפים.

באופן אידיאלי, פקדים littermate אמור לשמש כמו עכברים, אפילו על רקע זהה אך ממקורות שונים, ייתכן השכיחות פקקת שונה במקצת. אם נלמד את ההשפעה של DVT עצמה על כל הפרמטרים (לדוגמה, הביוכימי), חיות המופעלים באמצעות העמדת פנים אמור לשמש. עכברים המופעלים שאם עוברים אותו הנוהל אבל הקשירה בסביבה IVC סגור באופן רופף והשאיר שם בלי לייצר היצרות.

הטעות בתדירות הגבוהה ביותר (שלב קריטי), פרוטוקול זה הוא מאמץ כדי להפריד בין העורקים, IVC לא בדיוק על הזווית בין כלי אבל נמוך במקצת, אשר בדרך כלל התוצאות דימום. כאשר דימום מסיבי מתרחש, התאוששות טובה של העכבר הופך לא סביר, מומלץ להפסיק את הניסוי, להרדימו. בדרך כלל, עכברים לשחזר היטב, לנוע בתוך הכלוב, לא באופן משמעותי במשקל. אנו ממליצים על שימוש בעכברים מעל 20 גרם עבור זכרים ונקבות, לשמור על בעלי חיים (בעיקר גברים) בכלובים בודדים לאחר הניתוח עד תום הניסוי כדי להימנע הלחימה ופציעה. דווח במודל אחר (אלקטרוליטי) של DVT כי עכברים זכרים לייצר thrombi גדולים יותר מאשר הנקבות²⁷. ניתוח של הנתונים שלנו לא חשפה את הפרש משמעותי פקקת השכיחות בין זכר ונקבה עכברים (בריל, לא פורסם). לכן, חוקרים מעודדים לביצוע ניסויים באמצעות מודל היצרות IVC על עכברים של שני המינים.

מגלה הרבה תפרים או סיכות לא ניתן לפסוק כל ניסויים ארוך במיוחד (בשבוע ולא יותר). לפיכך, עכברים צריך להיבדק לפחות פעמיים ביום במיוחד עבור שלמות התפירות, תשומת לב מיוחדת יש לתת הופעת סימני דם על מצעים הכלוב.

יצוין כי, כמו מודל בעל חיים אחר, היצרות של IVC יש המגבלות מבחינת תרגום בני אדם. לדוגמה, IVCs מאתר אין שסתומים, ואילו DVT האנושי מתפתח בתוך שסתומי ורידים. כמו כן, לבני האדם יש אנכי אוריינטציה בעמוד השדרה עם המשאבה שרירים להיות מכניזם חשוב, האצת זרימת הדם בורידים. לעומת זאת, עכברים יש כיוון עמוד השדרה אופקי עם אין תפקיד של המשאבה שריר בתמיכה הדם בחזרה ללב. יש לקחת בחשבון מגבלות אלה בעת תרגום נתונים העכבר כדי המחלה האנושית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River		8 - 10 weeks old, bothe genders
Scissors	WPI	15922
Scissors	WPI	14003
Dumont 5/45 forceps	FST	11251-35
7-0 Prolene suture	Ethicon	W8725
6-0 Vicryl suture	Ethicon	W9981
Cotton buds	Spar
Millswabs sterile	Millpledge veterinary	611950
Drapes	Kruuse	141765
Glucose Saline-Aqupharm3	Animal Care	XVD589
Clear H20 HydroGel 98% sterile water	Clearh2o
Buprenorphine	National Veterinary Supplies
Isoflurane vaporizer	General Anaesthetic Services
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid	National Veterinary Supplies
Sterilizer Steri350	Inotech
Microscope Olympus SZX10	Olympus