열 등 한 베 나 정 맥의 협 착 증: 깊은 정 맥 혈전 증의 Murine 모델

요약

우리가 설명 여기에 열 등 한 베 나 정 맥 협 착 증 깊은 정 맥 혈전 증의 murine 모델. 이 모델이 혈액 흐름 제한, 인 간에 있는 정 맥 혈전 증의 주요 트리거 중 하나.

초록

깊은 정 맥 혈전 증 (DVT) 및 그것의 파괴적인 합병증, 폐 색 전 증, 높은 사망률과 심각한 건강 문제. 혈관에 혈전 형성의 메커니즘은 애매 한 남아 있다. 이동성 (예를 들어, 수술 또는 장거리 비행 후)의 부족은 DVT를 선도 하는 주요 요인 중 하나 이다. 이동성의 부족의 병 태 생리 결과 정 맥 밸브에 혈액 흐름 침체입니다. 여기, 모델은 혈전 증 운전 요인으로 이러한 흐름 소동을 설명 합니다. 이 모델에서 부분 흐름 제한 (협) 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)에서 만들어집니다. IVC 루멘 48 h에 대 한의 약 90%의 폐쇄 혈전 인간 구조적으로 유사한의 개발에 결과. 유사성은: i) 대부분의 혈전 볼륨은 빨간색, 즉, 내 피 단층 iii) 비-걸치기, iv) 높은 플라즈마 D 이합체 수준, 그리고 v) 가능성을 방지 하기 위해 적혈구와 섬유 소, 흰 부분 (잔 줄)의 ii) 존재의 구성 저 분자 무게 헤 파 린에 의해 혈전 증입니다. 혈전과 가변 크기 포함 하는 야생-타입 마우스의 일정 비율 (0-35%)는 혈전을 생성 하지 않을 수 있습니다. 시각적인 관찰 및 측정, 혈전 혈전 개발의 역학을 모니터링 수 있는 초음파 등 비-침략 적 기술에 의해 구상 될 수 있습니다. 점에서 짧은 시간 (1-6 h) intravital 현미경 직접 관찰 하는 이벤트 (예를 들면, 혈관 벽 세포의 모집)에 적용할 수 있습니다 혈전 형성을 앞. 세계의 여러 팀에서이 방법의 사용은 DVT 개시의 기본 메커니즘을 폭로 하 여 그 예방에 대 한 도움이 될 수 있는 잠재적인 대상을 식별 가능 했다.

서문

깊은 정 맥 혈전 증 (DVT) 깊은 정 맥에 혈전의 개발은 일반적으로 (그러나 뿐만 아니라) 다리에. 폐 색 전 증으로 접속사에 (PE; 정 맥 혈전 색 전 증, VTE로 함께 지정) 그것은 매년 약 900000 미국에서 개발 하 고 심각한 건강 문제와 경제적인 문제^1,2를 나타냅니다. PE, DVT, 합병증 발생 한 혈전 초기 위치에서 분리 되 면 호흡기 부족 및 죽음을 일으킬 수 있습니다 폐에 도달. 사망자 VTE 초과 에이즈, 유 방 암, 교통 사고, 결합 된³에서 사망 합니다.

외에 DVT를 일으키는 주요 요인 이유, 알려진 암 등 외상, 이동성 ^4,5의 부족 이다. 이 수술 (특히 정형 외과), 마비, 장거리 항공편 또는 다른 이유에서 발생할 수 있습니다. 혈관에 혈액의 흐름 근육 펌프에 따라 달라 집니다과 그러므로 정체 혈액에 사지 immobilization 결과 정 맥 밸브에 혈전 증에 이르게 합니다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 이러한 혈액 흐름의 왜곡^6,7을 정리 하입니다. 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)에서 부분 흐름 제한 조건 인간의 정 맥 밸브에는 혈전의 형성에서 결과 인간의 혈전⁶구조에 비슷한 만든 모방 합니다. 혈전의 큰 부분 빨간색 이며 적혈구, 섬유 소, 혈소판의 구성 됩니다. 혈전 작은 "흰 부분" "의 선 잔" 인간의 정 맥 혈전에 설명 된 닮는 (그림 1), 혈소판에 풍부 하 게 있다. 혈전의 두 부분 포함 또한 호 중구⁸, 첫 번째 셀 미래 혈전^6,9의 사이트에서 모집 중입니다. 반면 흰 부분에 호 중구 그물⁸없는 것 빨간 부분에서 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 추방. 마찬가지로 인간의 DVT를 마우스에 혈전 증 동반 된다 높은 플라즈마 D 이합체 수준 (그림 2). 저 분자 무게 헤 파 린 (enoxaparin), 환자에 있는 DVT 예방에 사용 되는 또한 쥐에 혈전 증을 방지 합니다. 이 방법의 중요 한 장점은 인간의 DVT¹⁰의 특징은 내 피 노출⁹의 부재입니다. 이 기능을 사용 하면 IVC 협 보다, 혈전 증의 예를 들어 유도 DVT의 임상으로 더 관련 모델 제 2 철 염화 물, 내 피 노출을 유도 하 고 있는 혈전 혈소판^11, 의 우위 하 게 구성 하 여 ^12,13. IVC는에 완전 한 스테이 시스의 모델은 여러 팀^14,,1516선호 합니다. 협, 잔여 흐름, 선박에서 유지 달리 스테이 시스의 응용 프로그램은 완전히 흐름 멈추고 따라서 혈전 증 사이트를 체계적으로 관리 물질의 접근을 제한 한다. 또한, 그것은 혈전 증 협 착 증 및 혈 행에 의해 유도 된 기본 메커니즘은 다른 것 같다: 협 지역의 염증의 개발에 결과 (endothelium, Weibel Palade 본문 내용의 릴리스, 면역 세포의 채용의 활성화와 혈관 벽에 혈소판) 반면에 스테이 시스가 오히려 혈전 증을 일으킬 것 "immunothrombosis"^6,,917, 원인 기반, 특히 조직 요소와 다른 응고 및 fibrinolysis 관련 메커니즘^18,,1920. 따라서, 협 착 증 및 스테이 시스 모델 비록 그들의 메커니즘을 확실히 겹칠 수 있습니다 정 맥 혈전 개발의 약간 다른 측면을 반영 합니다. DVT^21,22 의 전해 IVC 모델 (EIM)만 부분적으로 가려지는 혈관 벽 혈전을 유도 합니다. 따라서, 혈전 성장에 다른 약물의 조직 관리의 효과 테스트 하기 위해 편리 하다. 그러나,이 모델에이 메커니즘의 병 태 생리 관련성을 적어도 명백한 만드는 전기 전류에 의해 IVC 벽 무결성 (바늘의 삽입)의 파열 및 혈전 증의 유도 가정 합니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 동물 복지의 윤리적인 검토 기관 및 영국 홈 오피스 (영국, 프로젝트 라이센스 40/3745)에 의해 승인 되었다. 마우스 C57BL/6 배경, 8-12 주 오래 된, 두 남녀의 19-25 g 몸 무게에 사용 됩니다.

1. 동물 마 취

1. 유도 챔버에 마우스를 놓고 5% isoflurane 100% 산소의 혼합물에 의해 마 취를 유도 합니다. 0.5 L/분의 유량 기다릴 마우스 완전히 이동 중지 될 때까지 사용 하 고 호흡의 주파수의 드문 된다.
2. 상공에서 마우스를 제거 하 고 전기 깎기로 복 부를 면도. 복에서 복 부 구멍의 오염을 피하기 위해 가능한 철저 하 게 머리를 제거 합니다.
3. 부정사 위치에 마우스를 놓고 마우스의 코 마 취 시스템에 연결 하는 콘에 배치 합니다. 2-3% (정확한 % 약간 다를 수 있습니다 동물 동물에서) isoflurane % 감소. 동물 평소 하지만 피하 헐 떡이 고 보다 낮은 되 고 그것의 호흡 속도와 자 고 있는지 확인 합니다. 경우 헐 떡이 고, 0.5 %isoflurane% 감소.
   1. 적절 한 anesthetization를 확인 하 고 부정적인 경우에 수술을 시작 하는 페달 반사를 확인 하십시오. 건조를 방지 하기 위해 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.
4. 안티-살 균 솔루션 적용 (1 %Hibitane) 마우스의 복 부 고 외과 사이트 (예를 들어, 원형 패션에 밖으로 안쪽)의 잠재적인 재 오염을 제외 하는 방법에는 꽃 봉 오리는 메 마른 목화를 사용 하 여 영역에. 3 회 반복 한다.

2. 응용 IVC 협 및 마우스 복구

참고: 모든 악기 뿐만 자료 (면봉, 거 즈, 식 염 수 등)로 수술 영역을 접하는 살 균 되어야 합니다. 연산자는 수술 전에 스크럽 하 고 멸 균 장갑과 가운을 절차 중에 착용 해야 합니다. 현미경 핸들 살 균 호 일에 포장 되어야 합니다.

1. 수술 전에 및 전체 실험 기간 동안 마우스 방지 통증 치료를 제공 합니다. 예를 들어 buprenorphine 0.1 mg/kg 피하 30 분 전에 수술 하 고 다음 12 시간 마다 동물 안락사 될 때까지 사용 합니다. 혈전 증이 방법에서 개발로 마찬가지로 살 균 염증,는 premedication으로 항 염증 제 약물을 사용 하지 않습니다.
2. 무 균 드 레이프와 마우스를 커버 하 고 수술의 사이트 노출 드 레이프에 구멍을 만들. 가 위를 사용 하 여 복 부 중간, 흉 골에서 아래로 1.5 c m를 따라 절 개를 확인 합니다. 면봉을 사용 하 여 마우스의 왼쪽을 창 자 exteriorize 하 고 밖으로 건조 하지 않도록을 따뜻한 (37 ℃) 식 염 수에 젖은 멸 균 거 즈와 함께 그들을 커버.
3. IVC와 함께 왼쪽된 신장 정 맥 IVC의 융합의 사이트에서 꼬리 방향으로 쪽 지점 (있을 수 있습니다 0, 1 또는 2 그들의) 확인 합니다. 7-0 불활성 Prolene 봉합으로 가능한 IVC 가까이 모든 보이는 측면 지점 선
   1. 하려고 하지는 집게와 측면 지점 오히려 직접 들고 한 손에 집게와 그들을 둘러싼 지방 조직의 그들을 올려 고 다른 손에 집게와 지점 아래 터널을 확인 합니다. 다시 분기를 가까이 하지 마십시오.
4. 집게와 주변 조직을 잡고, 당겨 최대 IVC 및 긴장 사이 IVC는 대동맥 정확 하 게 는 IVC와 왼쪽된 신장 정 맥 사이의 각도에 작은 지역에서 생산 하는 왼쪽. IVC도 2-3 mm 아래 (꼬리 방향)에서 대동맥을 분리 하는 사실상 불가능 하다는 것을 고려.
5. 에 당신의 오른손은 IVC와 대동맥 사이의 구멍 집게 팁 분기 움직임을 사용합니다. 명심에서 하십시오 더 많은 운동 했다고, 선박 손상의 더 높은 기회. 이상적으로, 3-5의 움직임의 수를 최소화 하십시오.
6. 길이 약 2 m의 7-0 불활성 Prolene 봉합의 조각을 준비. IVC 주변에서 연산자의 왼쪽에는 마우스의 복 막 구멍에 그것을 배치 합니다.
7. 당겨는 IVC와 왼쪽 다시. 팁은 IVC의 다른 쪽에 표시 오른쪽 집게 팁은 IVC와 대동맥 사이의 구멍에 삽입 합니다. (그림 3A) 구멍을 통해 봉합 및 다시 당기기를 가져가 라.
8. 임시 매듭 봉합을 하지만 그것을 닫지 마십시오. 30g 바늘 ("스페이서") 걸으로 매듭으로 구부려 놓고 지금 (그림 3B) 닫습니다.
9. (그림 3C) 스페이서를 제거 합니다.
10. 창 자는 목화와 함께 복 막 구멍에 다시 버드와 그것에 그들을 동등 하 게 배포를 반환 합니다.
11. 연속 루프를 사용 하 여 6-0 vicryl 봉합과 복을 닫습니다. 매듭으로 처음과 마지막 루프를 닫습니다.
12. 가까운 피부 금속 물림 쇠를 사용 하 여입니다.
13. 따뜻한 (37 ° C)의 0.5 mL 마우스 주입 피하는 유기 체의 액체 균형을 복원 하려면 포도 당 염 분.
14. 따뜻한 (25 ° C) 챔버 또는 룸에는 개별으로 마우스를 배치 하 고 음식을 넣어 안에 물 젤. 마우스는 (일반적으로, 약 1 h) 완 치 될 때까지 관찰 합니다.

결과

여기에 IVC 흐름 왜곡에 의해 유도 된 DVT의 모델 설명 되어 있습니다. 유도 IVC에 협 착 증의 왜곡을 시작 및 혈액 흐름의 그리고 후에 (이 경우 48 h) 동안 침체 결과 혈전, 구조적으로 유사한 인간 DVT의 개발에 혈전 (그림 1A). 내부는 IVC 혈전의 존재는 시각적으로 쉽게 감지 (그림 1B). 모델 및 인간의 DVT 사이 중요 한 유사성은 높은 플라즈마 D 이합체 수준 (그림 2). D-이합체 섬유 소 강 직의 제품 이며 혈액의 존재는 활성 thrombotic 과정 것 나왔다.

모델은 그림 3A-C단계 제공 됩니다. IVC는 신중 하 게 노출 하 고는 IVC와 대동맥 사이의 구멍을 만든 봉합 (Prolene 7-0)는 IVC 아래 구멍을 통해 뽑아. 다음는 IVC는 출혈 봉합에 의해 스페이서 (30g 바늘, 그림 3D)에 있는 공백 제거 후. 이 절차는 약 90%에 대 한 허용 특허 나머지 10%를 떠나 IVC 루멘의 폐쇄. 그러면 결국 혈전 증으로 이어지는 혈액 흐름 침체.

그림 4 모델, 가변 혈전 크기의 주요 단점을 보여 줍니다. 이러한 혈전 동일한 실험에서 가져온 모든 동일한 근원, 나이 및 유사한 체중의 야생 타입 남성 쥐에서 수행. 비록 모든 쥐의 혈전 (혈전 증의 유 병 율 100%)을 생산, 그들의 크기는 명확 하 게 넓은 범위에서 변화 한다.

그림 1: 48 h 제한/협 후 대표적인 혈전. (A) 전형적인 혈전 후 48 h IVC 협. 참고 빨간색 (적혈구 농축)과 화이트 (혈소판 농축) 부품. (왼쪽)와 (B) IVC 또는 (오른쪽)는 혈전 없이. 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : IVC 협 응용 프로그램 후 D-이합체 플라즈마 레벨 상승. 마우스는 IVC 협을 받게 했다. 혈액 표시 시간 포인트에서 찍은, 3.8% 나트륨 시트르산, 플라즈마와 안정된 1:9 원심 분리 (2300 x g, 5 분)에 의해 준비 되었다 및 D 이합체 수준 제조업체의 지침에 따라 ELISA 키트에 의해 결정 되었다. 원형 지정 운영 하는 가짜 쥐, 십자가 지정 IVC 협. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 제한/협 쥐에 있는 DVT의 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC) 모델에서 흐름. 모델의 연속 단계 제공 됩니다. (A)는 IVC와 대동맥 사이의 구멍은 하 고는 봉합 주위는 IVC 통해 가져온. (B) 매듭 스페이서 (30g 바늘)에 닫힙니다. (C) 는 공백 제거: 외과 의사 보고 마우스를 닫기 전에 마지막 보기. 노란 점선은 IVC를 정합니다. 어브 왼쪽된 신장 정 맥에 대 한 의미합니다. 스케일 바 = 0.2 m m. (D) 스페이서 (30g 바늘). 스케일 바 = 2 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 . 혈전 크기의 다양성
마우스는 48 h IVC 협을 받게 했다. 제시는 혈전 얻은 동일한 실험에서. 스케일 바 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

여기, 혈액 흐름 왜곡, DVT에 대 한 주요 트리거 요소를 모방한 IVC 협의 프로토콜 제공 됩니다. 48 h 이내 C57BL/6 마우스의 65-100%, 2-6 h^6,,823 내 쥐의 25-50%에서 혈전의 개발을 유도 하는 IVC의 협 (Brill, 게시 되지 않은 데이터, 2016). 방법의 주요 한계는 혈전 크기²⁴ (그림 4), 단기 (6 h) 및 장기 (48 h) IVC 협 후 관찰 되는 변화. 이러한 변화에 대 한 이유 (그 같은 조건, 공백, 같은 마 취 등, 사용 하는) 무명 남아 있지만 하나 그 해부학 추측 수 있습니다 마우스 (예를 들어, 너비 IVC, 번호 및 측면 및 후면의 위치 사이 변이 지점)이이 현상을 기반이 됩니다. 혈전 크기에 변화에서 주요 결과를 혈전 증 유행 한 혈전와 쥐의 (%)를 만든다. 혈전 증 유행 우발 테이블 및 피셔의 정확한 테스트를 사용 하 여 비교할 수 있습니다. 실험 중 하나 때 예외가 podoplanin 억제 항 체의 주입 ⁷관찰 후와 같은 혈전 증 발병 률 감소 혈전 크기.

이 방법은 정 맥 혈전 증 개시 공부 때 특히 유용 하다. 그것은 혈관 벽의 혈전 증으로 결국 이어지는 세포의 모집 등에서 초기 이벤트를 조사 하 고 있습니다. 약의 프로 또는 안티 thrombotic 효과 혈전 증 보급 되 고 기본 판독으로이 모델을 사용 하 여 평가할 수 있습니다. 48 h에 대 한 협 6 h 협 prothrombotic 표현 형 경우 사용할 수 있는 반면 안티 thrombotic 형 공개에 적용 됩니다. 혈전과 주변 IVC 벽의 조직학 분석 또한 수행할 수 있습니다.

질문 여부 측면 분기 한다 출혈 또는 특허 왼쪽 열려 남아 있습니다. 한 그룹 측 분기의 결 찰 혈전 크기를 증가 하지 않는다와 IVC 결 찰 사이트에 1.5 m m 보다 더 사이드 지점의 위치는 극적으로 혈전 개발²⁵손상 나타났습니다. 측면 지점 폐쇄 그들에 내 피 손상을 유발 하 고 또한 수술²⁶시간을 증가 수 있습니다. 우리의 손에서 측면 지점 폐쇄의 부족 실질적으로 혈전 증 발병 률 (최저 48 h 협; 후 10-30% 감소 가자 미, 미 출판) 따라서 우리는 모든 보이는 측면 지점 선 고.

이상적으로, 마우스 같은 배경에 하지만 서로 다른 소스에서 약간 다른 혈전 증 유행 있을 수 있습니다 littermate 컨트롤을 사용 해야 합니다. (예, 생화학) 매개 변수에 DVT 자체의 효과 공부 하는 경우 가짜 운영 하는 동물을 사용 해야 합니다. 운영 하는 가짜 쥐 같은 절차를 거쳐야 하지만 IVC 주위 합자 느슨하게 폐쇄와 협 착 증을 생산 하지 않고 거기 왼쪽.

이 프로토콜에서 가장 빈번한 실수 (중요 한 단계) 대동맥과 일반적으로 출혈 귀착되는 약간 낮은 하지만 혈관 사이의 각도로 정확 하지 IVC 분리 하는 노력 이다. 경우는 출혈, 마우스의 좋은 복구 가능성 되 고 실험을 중지 하 고 동물을 안락사 하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 쥐 잘 복구, 안에 이동한 실질적으로 무게를 잃지 않습니다. 우리 둘 다 남성과 여성 20 g 위의 쥐를 사용 하는 것이 좋습니다 하 고 싸움 하 고 부상을 피하기 위해 실험의 끝까지 수술 후 개별 장에 동물 (특히 남성)를 유지. 그것은 남성 쥐 암컷²⁷보다 더 큰 혈전 생성 DVT의 또 다른 (전해) 모델에 보고 되었습니다. 데이터의 분석 하지 상당한 차이 혈전 증 유행 남성 및 여성 쥐 (가자 미, 미 출판)을 공개 했다. 따라서, 연구원은 두 남녀의 쥐에 IVC 협 모델을 사용 하 여 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.

스테이플 봉합의 몇몇 수 수 배제 하지 특히 긴 실험 (주 그리고 더 이상). 따라서, 마우스 봉합 무결성을 위해 특별히 하루에 적어도 두 번 확인 해야 하 고 케이지 침구에 혈액 자취의 외관에 특별 한 주의 주어져야 한다.

그것은, 다른 동물 모델 처럼는 IVC의 협 인간으로 번역 면에서 한계가 있다 주목 해야한다. 예를 들어 murine IVCs 필요가 없습니다 밸브, 반면 인간의 DVT 정 맥 밸브 내부 개발. 또한, 인간은 혈관에는 중요 한 메커니즘 가속 혈 되 고 근육 펌프와 수직 척추 방향이 있다. 반면, 쥐 혈액 심장에 반환을 지 원하는 근육 펌프의 척추 방향 수평 역할 있다. 이러한 한계는 인간의 질병에 마우스 데이터를 변환할 때 고려 되어야 한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 mice	Charles River		8 - 10 weeks old, bothe genders
Scissors	WPI	15922
Scissors	WPI	14003
Dumont 5/45 forceps	FST	11251-35
7-0 Prolene suture	Ethicon	W8725
6-0 Vicryl suture	Ethicon	W9981
Cotton buds	Spar
Millswabs sterile	Millpledge veterinary	611950
Drapes	Kruuse	141765
Glucose Saline-Aqupharm3	Animal Care	XVD589
Clear H20 HydroGel 98% sterile water	Clearh2o
Buprenorphine	National Veterinary Supplies
Isoflurane vaporizer	General Anaesthetic Services
IsoFlo 100% W/W inhalation vapour, liquid	National Veterinary Supplies
Sterilizer Steri350	Inotech
Microscope Olympus SZX10	Olympus