מנגנון רב שכבתי אולטרה נקי של איסוף פלנקטון ימית גודל Fractionated וחלקיקים מושעה

Summary

פלנקטון וחלקיקים מושעה לשחק תפקיד מרכזי המעגלים הביוגיאוכימיים באוקיינוס. כאן, אנו מספקים שיטה אולטרה נקי, נמוך מתח עבור האוסף בגדלים שונים של חלקיקים פלנקטון בים עם יכולת לטפל בכמויות גדולות של מי ים.

Abstract

חלוקות של יסודות קורט רבים באוקיינוס משויכים מאוד הצמיחה, מוות, ואת re-mineralization של פלנקטון ימית ואלו של חלקיקים מושעה/שוקע. כאן, אנו מציגים כל פלסטיק (פוליפרופילן ופוליקרבונט), רב-שכבתית סינון מערכת איסוף חומר על תנאי (SPM) בים. זה מכשיר דגימה אולטרה נקי כבר שעוצבו ופותחו במיוחד ללימודי יסוד קורט. בחירה קפדנית של כל חומרים מתכתיים וסילוק של הליך זרימה דרך בשורה ממזער כל זיהום מתכת אפשרי במהלך הדגימה. מערכת זו בהצלחה שנבדק ונמצא צבט לקביעת במתכות (למשל, Fe, Al, Mn, תקליטור, Cu, Ni) על חלקיקים בגדלים במימי האוקיינוס החוף ופתוח. תוצאות של ים סין הדרומי בתחנה בדרום מזרח אסיה בזמן-סדרות (מושבים) מצביעים על כך וריאציות ההשתנות היומית, התפוצה המרחבית של פלנקטון באזור euphotic יכול להיות בקלות נפתרה מזוהה. ניתוח כימי של fractionated-גודל החלקיקים במים עיליים של מצרי טאיוואן עולה כי החלקיקים גדול (> 153 מיקרומטר) בעיקר ביולוגית נשאבו, ואילו החלקיקים קטנים (10-63 מיקרומטר) היו מורכבים בעיקר מחומר אורגניים. מלבד תקליטור, ריכוזי מתכות (Fe, Al, Mn, Cu, Ni) ירד עם הגדלת גודל.

Introduction

חלקיקים באוקיינוס לשחק תפקיד חשוב הביוגיאוכימיים ימית¹. רוב המאפיינים של חלקיקים, כגון גודל, מינרלוגיה, קומפוזיציה, באפשרותך לשנות עמוקות מהגדרת גיאולוגית או hydrographical אחד עוד². בנוסף, חלוקות של אלמנטים באוקיינוס קשורים גם עם מחזור החיים של פיטופלנקטון ימית: צמיחה, מוות, שוקע ו- re-mineralization^3,4. חלקיקים ימיים span לפחות 4 סדרי גודל בגודלם, ועד כחיוניים חלקיקים אגרגטים גדולים (> 5 מ מ). רוב חלקיקי ביולוגית נגזרות, תהליכים כגון פירוק ויראלי, exudation, הפרשה, גלולה צואה ייצור, וכו '. חלקיקים אחרים נוצרות מן קרישה הפיזי של תאים, פסולת הסלולר או חומרים lithogenic¹. מאפיינים כימיים וביולוגיים שונים של חלקיקים לשלוט מחזורים גיאוכימיים והן תהליכים ביולוגיים המתרחשים על ובתוך חלקיקים^4,5,6. חלקיקים אלה הם בתי גידול חשוב, כמו גם מקורות המזון עבור אורגניזמים מסוימים, כגון זואופלנקטון או saprotrophs. בהתאם לכך, גורלו של חלקיקים לעיתים קרובות קשורה לגודל שלהם, אשר יכול להיות שונה על-ידי תהליכים ביולוגיים סביב חלקיקים.

דגימה חלקיקים ימיים בדרך כלל דורשת סינון, אך גישה זו מציגה של עמימות מסוימת בזיהוי המאפיינים של חלקיקים, כיוון חלקיקים ימיים לא הומוגנית הרכב וגודל. חלקיקים מושעה, מורכב בעיקר חלקיקים קטן ונמוך צפיפות הנמצאים כמעט באופן קבוע ההשעיה, מעורבבים עם כמויות משתנות של חלקיקים גדולים יותר, צפופה ההשעיה רק לתקופה קצרה של זמן, בהתאם לתנאי hydrodynamic ⁷. דיווחים ראשונים על ההרכב מתכת עקבות של פלנקטון דגימות נאספו tows פלנקטון או השעיית רשתות פלנקטון על כלי מחקר⁸. המחברים לעתים קרובות למצוא חלקיקי מתכת, שבבי בדגימות, צבע רומז בעיה חמורה של זיהום במהלך חלקיקים ימיים דגימה לניתוח כימי. אחרים מאמצים כוללים נטו גרירה על ידי גומי רפסודות או שימוש על פוליויניל כלוריד (PVC)-יד המנוף³. הקושי של אמינים הדגימה של חלקיקים מקשה התקדמות בהבנתנו ההרכב הכימי של חלקיקים ימיים, במיוחד עבור יסודות קורט. ככזה, הגיע מידע חיוני ביותר על הריכוז של יסודות קורט של פיטופלנקטון תרבות מחקרים^9,10. הכרה זו הניעה מדענים ימיים כדי ליצור שיטות חדשות ללימוד חלקיקים בים במשך שלושים השנים האחרונות¹¹.

Oceanographers השתמשו בטכניקות דיגום שונות, כולל סינון בחללית, בחיי עיר סינון, משקעים מלכודות¹¹. העיבוד של כמויות גדולות של מי-ים לאסוף דגימות שאינו נגוע עשויה להיות מאתגרת, במיוחד עבור אוקיינוס הפתוח העמוקים שבו ריכוז החלקיקים נמוכים מאוד (0.001 - 0.1 mg/L). יש גם צורך לסנן כמויות גדולות של מי הים כדי להשיג על כמות נאותה של חלקיקים למדידת ריכוזי מתכות מעקב. יש חוקרים השתמשו בשיטת גודל-fractionation כדי להפריד חלקיקים מושעה חלקיקים שוקעים. עם זאת, גודל החלקיקים, נקבוביות, צפיפות, צורה יכולה כל חלקיק השפעה שוקע המהירויות. משקעים מלכודות אינם כלים מעשיים כדי לאסוף חלקיקי מושעה, שכן אלה מיועדים חלקיקים שוקעים. לכן, חשוב לפתח שיטות דיגום וטיפול יכול לאסוף כמויות מספיקות של חלקיקים מושעה עם זיהום מזערי. לפיכך, גודל-fractionation על-ידי סינון בחיי עיר הוא עדיין מבטיח כלי בארגז דגימה של האוקיינוסים, מאז זה עשוי לחשוף מידע קריטי בדינמיקה של חלקיקים ימיים. כאן, אנו מתארים בהצלחה בדיקות מעקב-מתכת-clean, סינון רב שכבתית הכבידה דגימה המנגנון ניתן לטפל בנפחים גדולים (L 120-240) של מי ים על הסיפון במעבר אחד מ טפלון (PTFE) מצופה דגימה בקבוקי מים מערך דגימה רב בקבוק. מכשיר דגימה זו משתמשת המחומצנים ניילון סינטטי רשתות ברצף, הרשתות מוקפים בתוך גורם מכיל פוליקרבונט לאסוף בעדינות fractionated גודל מושעה ולעדכן פיטופלנקטון^{12,13, 14,15} (איור 1). מטרת עבודה זו היא לספק כלי טוב יותר ללמוד את השיוכים מתכת-החלקיקים ואת הדינמיקה התגובה שלהם בסביבות ימיות, ולשפר את ההבנה שלנו על גורלם של מגוון רחב של האצה, חלקיקים, במתכות האלו סביבות.

Protocol

להלן כללי התנהגות כוללת עבודה עם כימיקלים מזיקים. אנא קרא בעיון את גיליונות נתונים לבטיחות (זמנים תוססים) ופעל להנחיות הבטיחות כימי מוסדיים.

1. רב-שכבתית הכבידה סינון סמפלר הכנה

1. סמפלר ניקוי
   1. למלא את יחידת אבובים ולסינון 1% (w/v) של האנזים פרוטאז anionic פתרון דטרגנט, להשרות. זה 24 ח' סומק את הדוגם סינון כוח משיכה רב שכבתית עם אוסמוזה הפוכה מים מזוקקים כפול (RO-DDW) ביסודיות ולאחר מכן למלא אותו 0.1% (v/v) חומצת מימן כלורי (HCl, ריאגנט כיתה) ומשרים למשך 72 h.
   2. לשטוף ביסודיות את הדוגם סינון כוח משיכה רב שכבתית עם אוסמוזה הפוכה מים יונים מזוקקים (RO-DD-DIW) כפול שלוש עד חמש פעמים, לפחות 20 ליטר כל הזמן, ולאחסן מכלול בשקיות פלסטיק.
2. חלקיק מיכל ניקוי/הכנת הדוגמא
   1. השתמש פוליאתילן בצפיפות נמוכה (LDPE, 125 מ ל) או fluorinated אתילן פרופילן (FEP, 125 מ ל) בקבוקי כגורמים מכילים עבור חלקיקים. לנקות את הבקבוקים בהשריה קודם ותחטא אלקליין (מיקרו, 1%), ואז ב 50% (v/v) חומצה חנקתית (עב ס₃, ריאגנט כיתה), אז פתרונות HCl 10% (v/v) לפחות 24, 48 ו- 24 שעות, בהתאמה. יש לשטוף את הבקבוקים במים מיוננים (RO-DD-DIW) בין שני השלבים הספיגה.
   2. לאחר HCl הסופי השריה, לשטוף את הבקבוקים ביסודיות עם מים מיוננים (RO-DD-DIW), לייבש את הבקבוקים על ספסל נקי חדר נקי או מחלקה-100.
      לצרף את הבקבוק נקי הדוגם סינון כוח משיכה רב שכבתי, או חותם לנקות בקבוקי PE שקיות רוכסן, שקית כפולה אותם למשלוח.
3. מכלול של כוח משיכה רב שכבתית סינון סמפלר
   1. לחבר 4 מ 6 elastomer גומי סינתטי אשר בהתקשותו עמידים כימית זמן צינורות (מחוץ בקוטר של ס"מ 0.635) פתחי הכניסה כיוונית שש על גבי הדוגם.
   2. להרכיב את המסננים ניילון רשת שונים שלושה עם מיכלים מדגם פוליאתילן בצפיפות נמוכה (125 מ"ל LDPE) ברצף בחדר נקי (ספסל) לאחר ניקיון (ראה להלן), עם המסנן רשת 10 מיקרומטר הממוקמים מבחוץ, מסנן רשת מיקרומטר 63 ב התיכון, המסנן רשת מיקרומטר 153 מבפנים. הסעות, לאחסן את הדוגם סינון רב שכבתית הכבידה בשתי שכבות של שקיות פוליאתילן (PE), ולאחר מכן למקם אותו בתוך המיכל משלוח פוליפרופילן (PP).

2. דגימה

1. דוגמה אוסף
   1. עם ההגעה לאתר הדגימה, יש אדם אחד להסיר את הדוגם סינון כוח משיכה רב-שכבתית של מכולה על סיפונה של ספינת המחקר ופתח את השקית עם הדוגם. . אז, יש להם ללבוש את הכפפות PE, להתחבר הצינורות elastomer גומי סינתטי אשר בהתקשותו 4 מ 6 spigots מים בקבוקי 20 שישה מצופים L PTFE הדגימה על המערך דגימה רב בקבוק מוגברות, מדריך ממי הים לתוך יחידת סינון זו. ממי הים יזרום דרך אינלטס כיוונית, חלקיקי/הפלנקטון להיות בעדינות מופרד/fractionated דרך הרשתות ולא להתקבע 125 מ ל בקבוקים LDPE המאובטחות בבסיס של הרשתות.
   2. לאחר ממי הים יש זרמו דרך (בדרך כלל 120 L עבור מי הים לאורך החוף ו 240 L עבור מים באוקיינוס הפתוח), להסיר את כל הרשת ברצף (ראשית, את מיקרומטר 153, את מיקרומטר 63, ואז סוף סוף את 10 מיקרומטר) ב ספסל נקי class 100, ואז לרסס את הרשת עם מעקב-מתכת-clean 0.4 f מיקרומטר מי ים iltered שוטפת כל פלנקטון תקוע על השטח הפנימי של הרשתות. לאסוף את מי-ים עם מרוכז חלקיקי פלנקטון בבקבוקי פוליאתילן 125 מ.
   3. לפרק את הבקבוקים האלה מן הרשתות, ולסנן את הפתרונות עם מרוכז חלקיקי פלנקטון שוב דרך מכשירים המחומצנים סינון ואקום עם מראש שקל, אסיד-ווש 47 מ מ, 10 פילטרים µm גודל הנקבוביות פוליקרבונט תחת נמוך-ואקום תנאים (< 5 kPa).
   4. כדי לאסוף חלקיקי/פלנקטון קטן מ- 10 מיקרומטר, לחכות לפחות 20 L של מי ים לזרום דרך הדוגם, ואז אחרי זה, לאסוף שניים עד חמישה לליטר מים בתוך המיכל 5 L PE, לסנן את המים מדגם האלה על ידי מכשירים המחומצנים סינון ואקום עם נקבובית 0.4-מיקרומטר שנשקל מראש, אסיד-ווש, 47 מ מ, גודל פוליקרבונט מסננים.
   5. לאחר סינון אבק, לשטוף את המסננים מדגם מיד עם טוהר גבוהה DDW מים כדי להסיר את השאריות של מי ים, למזער את ההשפעה של מלחי ים על קביעת המשקלות חלקיקים/פלנקטון יבש. לשמור את אמצעי האחסון השטיפה רק כמה מיליליטר כדי למנוע פגיעה את הפלנקטון שביר.
   6. לאחר מכן, לאחר שלב זה השטיפה, בזהירות להסיר את המסנן מיחידת הסינון ואקום, לאחסן את המסננים מדגם המחומצנים, מראש שנשקל אקריליק פלסטיק צלחות פטרי, לאטום בשקיות פלסטיק לסגירה חוזרת. לשמור את התיקים במקפיא-20 הלעפה תרוטרפמט על הסיפון עד לשוב בחזרה מעבדה יבשתיים לצורך הדוגמה pretreatment ומהירות כימי ניתוח נוסף.

3. מדגם טיפול

1. להקפיא ייבוש והעיכול של חלקיקים
   1. מקם את המסננים עם דגימות של חלקיקים בבית הבליעה אספן של המכונה להקפיא ייבוש ולאחר להפעיל את המכונה. כאשר הטמפרטורה מכונת מגיע ל-40 ° C, להפעיל את משאבת ואקום של המכונה ולהתחיל ההקפאה ייבוש תהליכים.
      הערה: רמת ואקום צריך להישמר בהתמדה מתחת 0.12 mBar. אנא קרא בעיון את המדריך למשתמש, פעל לפי ההנחיות של היצרן עבור כל שלב.
   2. לאחר 72 h, כבה את המכונה להקפיא ייבוש, הסר את המסננים מיובשים, לשקול אותם. לאחר מכן, למקם את דגימת יבשים מסננים perfluoroalkoxy מראש שנשקל אלקאן (PFA) כלי (קיבולת 60 מ ל), וכן להוסיף 3 מ"ל של חומצה חנקתית מרוכזת הנדסה גנטית לתוך כלי^2,3,6,7.
   3. להדק את כלי עם מפתח ברגים מומנט על מומנט קבוע של 2.5 ק ג-מ', ולמקם את כלי בתנור שגרתי ב 130 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות עבור הסדרה הראשונה של מערכת העיכול. לאחר קירור, להסיר את כלי מהתנור, לפתוח את כלי הדם, ולהוסיף 2 מ ל חומצה הידרופלואורית הנדסה גנטית לתוך^6,73,2,כלי.
   4. להדק את כלי עם מומנט של 2.5 ק ג-מ', ולמקם את כלי בתנור שגרתי ב 130 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות, המהווה רצף עיכול השני. לאחר קירור, פתח את כלי והוסף 16 מ"ל של 4.5% חומצה בורית אולטרה טהור פתרון לתוך^6,73,2,כלי.
   5. להדק את כלי הקיבול מומנט קבוע של 2.5 ק ג-מ', לעכל את הדגימות בתנור ב 130 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות את הרצף הסופי לעיכול. לאחר קירור, שוקלים כל כלי, לקבוע את המסה הסופית ואת המסה ספציפיים של כל פתרון מתעכל להניב אמצעי digestant הסופי.
      הערה: מסה ספציפית נקבעת על ידי מדידת המשקל של בדיוק 1.00 מ של digestant.
   6. שופכים בזהירות את digestant לתוך 30 מ ל חומצה נקי בקבוק PE לניתוח מתכת מעקב נוסף.
2. ניתוח מעקב מתכת
   1. לקבוע מעקב מתכת ריכוזי (Cd, Cu, Fe, Mn, ני ו באל) בפתרונות מתעכל חלקיקים באמצעות ספקטרומטר (GF-AAS)⁶בליעה אטומית תנור גרפיט.
   2. כמו בדיקת דיוק, שימוש בחומר עיון מוסמך (CRM), כגון משקעים ימיים חומר עזר מקנדה נבחרת מחקר המועצה של משקעים estuarine בחומר עיון רגיל מן המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה של בארה ב, פלנקטון בחומר עיון משירות המדע והידע של הנציבות האירופית. התהליך נותן השחזור 95 107% של הערך מוסמך במתכות הניתנים ה-CRM.

תוצאות

עם הפיתוח לאוקיאנוגרפיה המודרנית, זה עכשיו מקובל להשתמש "טכניקות נקי" כדי לקבל מעקב מדויק מתכת ריכוזי חלקיקים ימיים או הפלנקטון. מאז רוב חלקיקי המים הטבעיים ב- mg/L נמוך לטווח µg/L, הטיפול של כמויות גדולות של מי ים הוא צורך לחקור את ההשפעות גיאוכימיים והביולוגיה במתכות על חלק...

Discussion

קבלת מעקב אמין ריכוזים מתכת על פלנקטון וחלקיקים מושעה במים טבעיים, אשר נמצאים בדרך כלל בריכוזים נמוכים מאוד, דורש זהירות רבה במהלך איסוף הדגימה, עיבוד, בשוטף ובשיפוץ, ניתוח, במטרה הפחתת זיהום. לכן, ההליכים כדי לעצב ולהכין ציוד דגימה, דוגמת מכולות וחומרים המשמש לאיסוף, הם דוגמאות תהליך קריטי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
thermoplastic elastomer (C-Flex) Tubings	Cole Palmer	EW-06424-67	O.D. 0.635 cm, Opaque White 1/8"ID x 1/4"OD, 25 ft/pack
LDPE Bottle (Nalgene)	ThermoFisher Scientific	2103-0004	125 mL, Nalgene Wide-Mouth LDPE Bottles with Closure
anionic protease enzyme detergent detergent (Tergazyme)	Alconox	1104-1	1×4 lb box (1.8 kg)
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	258148	Reagent grade
Nitric acid	Sigma-Aldrich	695025	Reagent grade
alkaline detergnet (Micro)	Cole Palmer	EW-99999-14	Micro-90 Cleaning Solution
polycarbonate filter, 47 mm, 0.4 µm	Sigma-Aldrich	WHA111107	Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, diam. 47 mm, pore size 0.4 μm, polycarbonate
polycarbonate filter, 47 mm, 10 µm	Sigma-Aldrich	WHA111115	Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, diam. 47 mm, pore size 10 μm, polycarbonate
PFA vessel, 60 ml capacity	Savillex	300-060-03	60 mL Digestion Vessel, Flat Interior, Flat Exterior, Buttress Threaded Top
Nitric acid, ultrapure	Seastar Chemicals	N/A	BASELINE Nitric Acid
HF, ultrapure	Seastar Chemicals	N/A	BASELINE Hydrofluoric Acid
Boric acid, ultrapure	Seastar Chemicals	N/A	BASELINE Hydrobromic Acid
polyethylene (PE) gloves	Safty Zone	GDPL-MD-5	Clear Powder Free Polyethylene Gloves
Multiple layer filtering and collecting device	Sino Instrumnets Co. Ltd	not available	Multiple layer filtering and collecting device, CATNET
10 um Nylon filters, Nitex	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX 10	Nitex - Standard Widths (40 - 44 inches)
60 um Nylon filters, Nitex	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX 60	Nitex - Standard Widths (40 - 44 inches)
150 um Nylon filters, Nitex	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX 150	Nitex - Standard Widths (40 - 44 inches)
torque wrench	Halfords	200238	Halfords Professional Torque Wrench 8-60Nm
multi-bottle sampling array, Rosette	General Oceanics	Model 1018	Rosette Sampler
PTFE-coated sampling bottles, GO-Flo	General Oceanics	108020T	GO-Flo water sampler teflon coated
Marine sediment reference materials	National Research Council Canada	MESS-3
Estuarine sediment standard reference material	National Institute of Standards and Technology	1646a
Plankton reference material	The European Commission's science and knowledge service	CRM414