JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

Abstract

תרגום של mRNA לחלבונים הוא תהליך מורכב מעורבים בכמה שכבות של רגולציה. לעיתים קרובות ההנחה כי השינויים בתעתיק mRNA לשקף שינויים בסינתזה של חלבון, אך נצפו חריגות רבות. לאחרונה, טכניקה שנקראת פרופיל הריבוזום (או Ribo-Seq) התפתחה שיטה רב עוצמה המאפשר זיהוי, עם רמת דיוק גבוהה, באילו אזורים של mRNA מתורגמים חלבונים, כימות של תרגום ברמת הגנום כולו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מוכללת על הגנום כולו כימות של תרגום באמצעות Ribo-Seq ניצני שמרים. בנוסף, שילוב של Ribo-Seq נתונים עם מדידות שפע mRNA מאפשר לנו בו זמנית לכמת יעילות התרגום של אלפי mRNA תעתיקים במדגם זהה ולהשוות בין שינויים בפרמטרים האלה בתגובה ניסיוני מניפולציות או במצבים פיזיולוגיים שונים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הדור של ריבוזום עקבות שימוש נוקלאז עיכול, בידוד של הריבוזום שלם-טביעת מתחמי ויה fractionation הדרגתיות סוכרוז, והכנה של ספריות DNA רצף עמוק יחד עם המתאים פקדים איכות הדרושים כדי להבטיח ניתוח מדויק של תרגום ויוו .

Introduction

תרגום ה-mRNA הוא אחד התהליכים הבסיסיים בתא, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי חלבון. לפיכך, תרגום mRNA מפוקחת בתגובה לגירויים פיזיולוגיים שונים פנימיים וחיצוניים 1,2. עם זאת, מנגנוני רגולציה translational נשארים understudied. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור כימות ברמת הגנום של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום. המטרה הכוללת של ריבוזום פרופיל הטכניקה היא ללמוד ולכמת את התרגום של mRNAs ספציפיים בתנאים שונים הסלולר. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי לנתח באופן כמותי את הריבוזום תפוסה ברחבי הגנום ומאפשרת ניטור הקצב של חלבון סינתזה ויוו codon יחיד ברזולוציה 3,4. כיום, בשיטה זו מספק את האמצעים המתקדמים ביותר למדוד את הרמות של תרגום החלבון, הוכיחה להיות כלי גילוי שימושי להצגת מידע אשר אינם יכולים להתגלות על ידי טכניקות אחרות הזמינות כעת, למשל מיקרו-מערכים או תרגום המדינה מערך ניתוח (TSAA) 5. כמו הריבוזום פרופיל דוחות על שינויים בשילוב רמות התעתיק והפלט translational, הוא גם מספק הרבה רגישות לעומת שיטות אחרות.

גישה זו מבוססת על רצף עמוק של המוגנים ריבוזום mRNA שברי 3. במהלך תרגום החלבון, ריבוזומים להגן על ~ 28 חלקים nt של mRNA (הנקרא עקבות) 6. על-ידי קביעת הרצף של השברים המוגנים ריבוזום, Ribo-Seq ניתן למפות את המיקום של הריבוזומים על mRNA מתורגם, לזהות באילו אזורים של mRNA נוטים להיות מתורגם באופן פעיל חלבון 3,7. בנוסף, אנו יכולים באופן כמותי למדוד את התרגום של mRNA על-ידי ספירת מספר עקבות, ליישר תעתיק mRNA נתון.

על מנת לבודד את השברים המוגנים ריבוזום, lysates תא מטופלים בתחילה עם מעכב תרגום לעכב הריבוזומים ואחריו ribonuclease לעיכול. ואילו mRNA וחופשית חלקים מתורגם mRNAs אינו מוגן על ידי הריבוזומים הם נפגמים בשל ribonuclease, ניתן לשחזר השברים mRNA המוגנים ריבוזום וטיהור מתחמי הריבוזום שלם-טביעת רגל. עקבות אלה mRNA שהוסב ספריית cDNA, ואז נותחו על ידי רצף עמוק (איור 1). במקביל ריבוזום פרופיל, שלם mRNA המופק באותה דגימת זרע, וסודרו. על ידי השוואת רמת התרגום המזוהה על-ידי Ribo-Seq עם מדידות שפע mRNA, אנו יכולים לזהות גנים הנמצאים במפורש למעלה או למטה-מוסדר ברמה של תרגום, לחשב יעילות התרגום של mRNA ברמת הגנום כולו. בעוד הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא ספציפי שמרים, זה צריך להיות גם שימושי עבור חוקרים מי ינסה ליצור פרוטוקול Ribo-Seq במערכות אחרות.

Protocol

1. לחלץ הכנה

  1. פס שמרים זנים של מניות קפוא של מושבות יחיד על צלחות YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז ו-2% אגר). דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  2. לחסן שמרים מצלחת YPD (שימוש שמושבה בודדת) לתוך 15 מ"ל של מדיום YPD (תמצית שמרים 1%, peptone 2%, 2% גלוקוז) בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל ולגדול בן לילה ברעידות (200-250 סל"ד) ב- 30 ° C.
  3. לדלל תרבות לתוך 500 מ"ל YPD בינוני בבקבוקון סטרילי 2 ל', אז כי ה OD600 < 0.1. לגדל תאי שמרים עם לרעוד ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-5 שעות עד OD600 = 0.5 (יומן באמצע שלב).
  4. איסוף תאים על-ידי סינון דרך מסננים ממברנה μm 0.45, באמצעות אסיפה מסנן בעל זכוכית. לגרד את גלולה עם מרית, הקפאת פלאש בחנקן נוזלי, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. הגודל הצפוי של בגדר קפוא הוא ~ 0.2 - 0.5 ג'י.
    זהירות: חנקן נוזלי היא טמפרטורה נמוכה מאוד; לענוד הגנה הולמת.
  5. הכנת מאגר פירוק טריים (20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 140 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2, cycloheximide μg/mL 100, 0.5 מ מ DTT, 1% טריטון X-100) מייד לפני השימוש, לשמור על הקרח.
  6. לשים כרום-פלדה 3 חרוזים (3.2 מ מ) לתוך צינור נירוסטה 1.8 מ. להירגע מראש חנקן נוזלי להוסיף כדורי קפוא, לכסות עם כובע גומי סיליקון. Homogenize המדגם על ידי cryogrinding 10 s ב 4200 סל ד; חזור על פי 10. להרגיע את הצינור בחנקן נוזלי במשך לפחות 10 s בין כל סיבוב.
    הערה: חשוב תמיד לשמור את הדגימה קפוא.
  7. להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר, לערבב היטב על ידי pipetting. העברת לתוך צינור 1.5 mL החדש.
  8. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 5 דקות ב 4 º C. תוך כדי עבודה על קרח, להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש. להעביר צינור 1.5 mL לבידוד mRNA poly(A) 100 μL של lysate. פנה/י מיד לבידוד RNA או פלאש להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי. מדד יתר260 של שאר lysate, אשר ישמש להפקת טביעת רגל, פלאש להקפיא הצינורות של חנקן נוזלי. לאחסן את lysates ב-80 מעלות צלזיוס.

2. טביעת רגל החילוץ

  1. הכנה של סוכרוז מעברי צבע
    1. היכונו פתרונות 50%-40%, 30%, 20%, 10% סוכרוז במאגר מעבר צבע (20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 140 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2, cycloheximide μg/mL 100, 0.5 מ מ DTT).
    2. פיפטה mL 2.2 מוכן 50% סוכרוז מאגר לתחתית הצינור polyallomer 13.2 mL קיר דק, להקפיא את הפתרון עבור 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס (איור 2). ואז שכבה 2.2 מ של 40% סוכרוז מאגר על המאגר קפוא 50% סוכרוז, ומקפיאים למשך 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס. בעקבות את אותן הוראות, השכבה 30%, ולאחר מכן 20%, ולבסוף 10% סוכרוז. אנשים רגילים על גבי אחד את השני. להימנע בועות אוויר בזמן לקרנל. לשמור על מעברי צבע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. סוכרוז מעברי הצבע צריך להיות מוכן לפחות יום אחד לפני הניסוי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.
  2. נוקלאז עיכול
    1. להפשיר את מעברי צבע סוכרוז בלילה שלפני ניסויים ב 4 º C.
    2. הפשרת תא lysate (טביעת רגל דוגמה) על קרח. העברה של aliquot של תא lysate המכיל 50 יחידות260 OD צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף מאגר פירוק טריים עד 1 מ"ל. חנות הנותרים lysate ב-80 מעלות צלזיוס. להוסיף 10 μL RNase אני (100 U μL) דגירה h 1 בטמפרטורת החדר עם סיבוב עדין על מסובב את הראש-בעננים.
    3. (אופציונלי) להבהיר את הדגימות-g x 20,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולשחזר את תגובת שיקוע לתוך צינור 1.5 mL החדש.
  3. Ultracentrifugation
    1. בעדינות שכבת lysate דוגמאות לחלק העליון של 10-50% סוכרוז הדרגה.
    2. Ultracentrifuge polyallomer צינורות ב g x 210,000 (35,000 סל"ד) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות באמצעות רוטור Ti SW-41.
  4. הגדרת מערכת fractionation מעבר צבע
    1. להפעיל את הרכיבים ולאפשר את הצג UV לחימום במשך לפחות 30 דקות.
    2. אם באמצעות תוכנה מקליט דיגיטלי, להפעיל את התוכנה על המחשב, לקבוע מגבלות שינוי קנה המידה של הגרף-0.01 ו- 1.
    3. . תמלא את המזרק עם צ'ייס פתרון (20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 140 מ"מ אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl2, 60% סוכרוז), להסיר את כל בועות אוויר בתוך מזרק בצינורית.
    4. התקן של צינור ultracentrifuge מלא במים נטולי RNase. פירס ברכבת התחתית עם הצינורית עד שני סימני שחור ניתן לראות. התחל את משאבת מזרק-1 mL/min.
    5. כמו המים עובר דרך התא זרימה, לחץ לחצן "אפס אוטומטי" על המסך UV כדי להתאים את הבסיס ל- 0. הגדר את הרגישות של צג ה-UV כדי "2.0 AU". לאחר תוכנית בסיסית יציבה הוגדרה, להפסיק את משאבת מזרק. לשחזר את הפתרון צ'ייס ולהסיר את הצינור ultracentrifuge.
  5. בידוד monosome
    1. התקן, לנקב את הצינור ultracentrifuge המכיל את ההדרגה סוכרוז. להתחיל את משאבת מזרק-1 mL/min, לאסוף את השברים 1 מ"ל ניטור של ערכים254 . בריכה שברים המייצגים את הפסגה monosome שנות ה-80 לתוך שפופרת אחת, לשמור על הקרח (איור 3).
    2. ברגע צ'ייס שהתמיסה התא זרימה, להפסיק את משאבת מזרק. לשחזר את צ'ייס פתרון ולהסיר את הצינור ultracentrifuge. חזור על fractionation עבור שאר הדגימות מתחיל בשלב 2.5.1.
      הערה: בסיום, לנקות את המערכת fractionation לפחות 30 מ של מים נטולי RNase. לשטוף ביסודיות אבובים, מזרק, כל הרכיבים נשלפים עם מים חמים.
    3. לסנן השברים דרך מסננים צנטריפוגלי 0.5 מ"ל (100 kDa MWCO) ב g x 12,000 10 דקות ב 4 ° C, למחוק את הזרימה דרך, לחזור עד שאמצעי האחסון < 100 μL. להוסיף 400 μL שחרור מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.0, 2 מ מ EDTA, 40 מעכב RNase U/mL). מיקס על ידי pipetting, דגירה על קרח 10 דקות ולהעביר את יחידת לתוך צינור אוסף חדש. צנטריפוגה ב g 12,000 x 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את הזרימה דרך.
  6. טביעת רגל פרגמנט טיהור
    1. העברת זרימה דרך המכיל טביעת רגל RNA הרסיסים mL 1.5 חדש צינור, להוסיף 20 μL של 20% מרחביות (כדי ריכוז סופי של 1%), לערבב על ידי pipetting.
    2. להוסיף נפח 1 של חומצה-פנול: כלורופורם (pH 4.5), מערבולת 10 s.
      התראה: חומצה-פנול: כלורופורם הוא רעיל, יש למנוע מגע עם העור, אינהלציה.
    3. מחממים-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לשים על קרח דק 1 צנטריפוגה המדגם ב g 12,000 x למשך 5 דקות ב 4 ° C, להעביר את פאזה מימית (למעלה) צינור 1.5 מ.
    4. לזרז קטעים RNA טביעת רגל על-ידי הוספת 1/10 נפח של NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול.
דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.

3. Poly(A) mRNA החילוץ

  1. סה כ החילוץ-RNA
    1. להפשיר aliquot 100 μL של תא lysate (RNA הכולל דוגמה) על קרח, מוסיפים 300 μL של μL pH 7.0 ו- 20 20 מ מ טריס-HCl של 20% מרחביות (כדי ריכוז סופי של 1%), לערבב על ידי pipetting.
    2. להוסיף נפח 1 (400 μL) של חומצה-פנול: כלורופורם (pH 4.5) ו מערבולת 10 s.
    3. מחממים-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לשים על קרח דק 1 צנטריפוגה המדגם ב g 12,000 x למשך 5 דקות ב 4 ° C, להעביר את פאזה מימית (למעלה) צינור 1.5 מ.
    4. מבצע החילוץ השניה של פנול. להוסיף נפח 1 של חומצה-פנול: כלורופורם (pH 4.5), מערבולת חום ס' 10 ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לשים על קרח דק 1 צנטריפוגה המדגם ב g 12,000 x למשך 5 דקות ב 4 ° C, להעביר את פאזה מימית צינור 1.5 מ ל.
    5. לזרז את הרנ א. על זה מוסיפים 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
  2. Poly(A) mRNA בידוד
    1. Centrifuge הדגימות RNA ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל העמסה, אוויר יבש בגדר במשך 5 דקות.
    2. להמיס בגדר ב- 300 μL מאגר פירוק/איגוד הערכה בידוד mRNA poly(A). המשך poly(A) הפקת mRNA לפי פרוטוקול poly(A) mRNA בידוד ערכת של היצרן.
    3. לזרז את הדגימות mRNA על-ידי הוספת 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
  3. פיצול mRNA
    1. Centrifuge הדגימות mRNA ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 שניות, להסיר את שארית האתנול עם ג'ל-טעינה עצה ואוויר יבש בגדר במשך 5 דקות.
    2. Resuspend mRNA ב 18 μL של מים נטולי RNase, להוסיף 2 μL של 10 x RNA פיצול המאגר. דגירה 5 דקות ב 94 º C. העברת צינור לקרח.
    3. לזרז על-ידי הוספת 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.

4. dephosphorylation

  1. פנקו טביעת רגל ודוגמאות mRNA מפוצלים עם T4 polynucleotide קינאז. בשביל זה, centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם ג'ל טעינת עצה. האוויר יבש בגדר במשך 5 דקות.
  2. Resuspend בגדר ב- 7.75 µL של מים, להוסיף 1 µL 10 x T4 polynucleotide קינאז מאגר µL 1 של T4 polynucleotide קינאז (10,000 U/mL), µL 0.25 של RNase מעכב (U 20/µL). דגירה h 1-37 מעלות צלזיוס.
  3. (אופציונלי) מראש להפעיל 15% ג'ל TBE-שתנן-180 V למשך 15 דקות באמצעות מאגר x TBE 1.
  4. להוסיף 10 µL של 2 X TBE-שתנן מדגם מאגר 10 µL של כל מדגם וטביעת mRNA. להכין דגימת הבקרה המכיל µL 1 של 10 מיקרומטר הגודל העליונה סמן oligonucleotide (32 nt), µL 1 של 10 מיקרומטר התחתונה גודל סמן oligonucleotide (28 nt), מים µL 8 ו 10 µL של 2 x TBE-שתנן מאגר דוגמאות לדגימות טביעת רגל. להכין דגימת הבקרה המכיל µL 1 של 10 מיקרומטר RNA סמן oligonucleotide (63 nt), מים µL 9 ו 10 µL של 2 x TBE-שתנן מאגר דוגמאות לדגימות mRNA.
  5. דגירה דגימות ופקדים 3 דקות ב 75 ° C, ספין למטה, לשים קרח על הגבלת 1 לטעון כל מדגם לתוך בארות 2 של הג'ל TBE-שתנן 15%, שברי RNA נפרד על ידי אלקטרופורזה בג'ל-180 V עבור 1 h.
  6. כתם הג'ל במשך 5 דקות עם כתם ג'ל חומצת גרעין (x 10,000 שתדללו במים), להגן מפני אור.
  7. שימוש transilluminator אור כחול, לחתוך הלהקה נכונה בין 28 ו- 32 סמני nt עבור דגימות טביעת רגל (איור 4A), בסביבות 50-70 nt עבור ה-mRNA דוגם (איור 4B) עם סכין גילוח נקי. להקפיא את החלקים לזיהוי ג'ל ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
  8. לחלץ RNA לזיהוי הג'ל כדלקמן. מחממים את החלקים ג'ל ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לטחון את הג'ל באמצעות גלולה חד פעמיות בקווקז. Elute RNA עם µL 300 • תנאי מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.0, 2 מ מ EDTA), להוסיף µL 1 RNase מעכב (20 U µL), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  9. Centrifuge המדגם-g x 12,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע, לזרז על-ידי הוספת נפח 1/10 של NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.

5. 3'-מתאם מצדו

  1. Centrifuge הדגימות mRNA וטביעת ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל-טעינה. האוויר יבש בגדר למשך 10 דקות.
  2. Resuspend בגדר ב µL 4.75 נוקלאז ללא מים, 2 µL של 50% PEG8000, µL 1 10 X T4 RNA ליגאז המאגר, µL 1 של 3'-מתאם (100 ng/µL), µL 0.25 של RNase מעכב (20 U/µL), µL 1 של T4 RNA ליגאז 2 מקוצרים KQ (200,000 U/mL). דגירה בין לילה ב-16 ° c
  3. למחרת בבוקר, להסיר את עודף של מתאם על-ידי הוספת 0.5 µL של 5'-deadenylase (10 U µL) ו- 0.5 µL של אקסונוקלאז Rec J (10 U µL) ישירות אל התגובה מצדו. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 30 ° C.
  4. לזרז את הדגימות. בשביל זה, להוסיף 30 µL של נוקלאז ללא מים, µL 1 גליקוגן (10 mg/mL), 1/10 נפח של NaOAc (pH 5.5) ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.

6. הפוך שעתוק

  1. Centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל-טעינה. האוויר יבש בגדר למשך 10 דקות.
  2. Resuspend בגדר ב- 11.5 µL של נוקלאז ללא מים, להוסיף 0.5 µL של 8 מיקרומטר שעתוק במהופך פריימר (RT פריימר) ו- µL 1 של dNTP מיקס (10 מ מ). תקופת דגירה של 5 דקות ב 65 ° C, מקום על קרח.
  3. להוסיף 4 µL של 5 X הראשון מאגר סטרנד, 2 µL של 0.1 M DTT, 0.5 µL של RNase מעכב (20 U/µL), 0.5 µL של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL). תקופת דגירה של 30 דקות ב 48 ° C, 1 דקות ב- 65 ° C, 5 דקות-80 מעלות צלזיוס.
  4. לא לזרז, להמשיך מיד הידרוליזה של RNA, על-ידי הוספת µL 0.8 של 2 M NaOH, דגירה 30 דקות ב 98 º C. להוסיף 0.8 µL 2M HCl כדי לנטרל. את התגובה.
  5. לזרז את הדגימות.
בשביל זה, להוסיף 20 µL של נוקלאז ללא מים, µL 1 גליקוגן (10 mg/mL), 1/10 נפח של NaOAc (pH 5.5) ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
  • Centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל-טעינה. האוויר יבש בגדר למשך 10 דקות.
  • Resuspend בגדר ב 5 µL של נוקלאז ללא מים, להוסיף 5 µL 2 X TBE-שתנן דוגמת המאגר. דגירה 3 דקות ב 75 ° C, ספין למטה, לשים קרח על 1 דקות.
  • (אופציונלי) מראש להפעיל ג'ל TBE-אוריאה 10% ב- 180 V למשך 15 דקות באמצעות מאגר X TBE 1.
  • לטעון את המדגם על 1 טוב של הג'ל TBE-שתנן 10%. הפרד את המוצרים של התגובה שעתוק במהופך על ידי אלקטרופורזה בג'ל-180 V למשך 50 דקות. כמו פקד, להכין מדגם המכיל 1 µL של 2.5 מיקרומטר RT פריימר, µL 1 של 2.5 מיקרומטר 128 nt סמן oligonucleotide, 3 µL מים, ו µL 5 של TBE X 2-אוריאה לטעום מאגר, לרוץ על מסלול נפרד של הג'ל.
  • כתם הג'ל במשך 5 דקות עם כתם ג'ל חומצת גרעין (x 10,000 שתדללו במים), להגן מפני אור. באמצעות transilluminator של אור כחול, לחתוך את הלהקה סביב 128 nt וגבוה יותר (איור 5) עם סכין גילוח נקי. להקפיא את החלקים לזיהוי ג'ל ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
  • מחממים את החלקים ג'ל ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לטחון את הג'ל באמצעות גלולה חד פעמיות בקווקז. Elute DNA עם 300 µL של 20 מ מ טריס-HCl pH 7.0, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
  • Centrifuge המדגם-g x 12,000, עבור 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע, לזרז על-ידי הוספת נפח 1/10 של NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.

    • 7. circularization

    1. Centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל העמסה, אוויר יבש בגדר למשך 10 דקות.
    2. Resuspend בגדר ב µL 16.75 נוקלאז ללא מים. להוסיף 2 µL של 10 x חד גדילי הדנ א (ssDNA) ליגאז מאגר, µL 1 של 50 מ מ MnCl µL2, 0.25 של ssDNA ליגאז (100 U µL). תקופת דגירה של h 1 ב 60 מעלות צלזיוס, 10 דקות ב- 80 מעלות צלזיוס. לא לזרז, ולאחסן את המוצר התגובה מצדו ssDNA ב-20 ° C.

    8. PCR ספריית הגברה

    1. בזמן עבודה על קרח, לערבב הבאות צינור ה-PCR: 146 µL של נוקלאז ללא מים, 2 µL של 20 מיקרומטר פריימר לפנים, 2 µL של פריימר באינדקס הפוכה ל- 20 מיקרומטר, µL 40 של 5 x אמינות גבוהה DNA plymerase מאגר, µL 4 של dNTPs (10 מ מ), 4 µL ssDNA מצדו תגובה המוצר , ו- 2 µL של אמינות גבוהה DNA פולימראז. לבחור פריימר באינדקס הפוך שונה עבור כל מדגם זה מרובב על רצף. העברה של aliquot 50 µL של תערובת PCR לתוך המבחנות חדש 4.
    2. לבצע הגברה PCR עם מספר משתנה של מחזורי (8, 10, 12, 14) באמצעות ההגדרות הבאות:
      1 דקות בדנטורציה הראשונית 98 ° C
      8 עד 14 מחזורים:
      15 s ב 94 ° C
      5 s-55 ° C
      10 s ב 65 ° C
      2 דקות שלוחה הסופי 65 ° C
    3. לזרז את המוצר PCR על-ידי הוספת 1/10 נפח של 3 מ' NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
    4. Centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל העמסה, אוויר יבש בגדר.
    5. Resuspend בגדר ב 8 µL של נוקלאז ללא מים, להוסיף 2 µL של הלא-denaturing 5 x חומצת גרעין דוגמת המאגר. לטעון את המדגם על 1 טוב של ג'ל TBE 8%-denaturing. הפרד את המוצרים ה-DNA על ידי אלקטרופורזה בג'ל ב-150 V במשך 35 דקות. כפקד, להכין מדגם המכילה 0.5 µL של סולם הדנ א 10 bp (µg 1/µL), מים µL 7.5 ו 2 µL של הלא-denaturing 5 x חומצת גרעין דוגמת המאגר, לרוץ על מסלול נפרד של הג'ל.
    6. כתם הג'ל במשך 5 דקות עם כתם ג'ל חומצת גרעין (x 10,000 שתדללו במים), להגן מפני אור. באמצעות transilluminator של אור כחול, לחתוך את הלהקה בסביבות 150 bp טביעת רגל ודוגמאות בסביבות 180 bp דגימות ה-mRNA (איור 6) עם סכין גילוח נקי. אחסן את החלקים ג'ל ב-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
    7. מחממים את החלקים ג'ל ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לטחון את הג'ל באמצעות גלולה חד פעמיות בקווקז. Elute DNA עם 300 µL של 20 מ מ טריס-HCl pH 7.0, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    8. Centrifuge המדגם-g x 12,000, עבור 5 דקות ב 4 ° C, לאסוף את תגובת שיקוע, לזרז על-ידי הוספת נפח 1/10 של NaOAc (pH 5.5), כרך 1/100 מערכו של גליקוגן (10 mg/mL), ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
    9. Centrifuge את הדגימות ב g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C, להסיר אתנול. ספין למטה 30 s במהירות מקסימלית, להסיר את שארית האתנול עם טיפ ג'ל העמסה, אוויר יבש בגדר. בסופו של דבר, resuspend של הספריות ב 20 µL של מים נטולי נוקלאז והמשך כמת, בקרת איכות ורצף.

    9. ספריית כימות ורצף תפוקה גבוהה

    1. לפני שליחת הדגימות של רצף, לקבוע את התשואה ואיכות ספריות מוגבר-PCR. נציג פרופילים עבור ספריות רצפי mRNA וטביעת מוצגים באיור 7. הגודל הצפוי של הספרייה מוגבר-PCR הוא 148-152 bp לדוגמאות טביעת רגל, 170-190 bp דגימות ה-mRNA.
    2. אם ניתן איחדו מספר דגימות עם ברקודים שונים עבור רצף, לבצע כימות מדויק של ספריות שימוש assay כימות ספריה של רצף מבוסס qPCR.
    3. מאגר של הספריות ביחסי equimolar. לחשב את הנפח הכולל של הבריכה כמו µL 3 x מספר דוגמאות כדי להיות איחדו הכולל. קבע את עוצמת הקול של כל ספריה צריך להתווסף כך ספריות מעורבבים את היחס equimolar כדי להשיג 10 nM ריכוז סופי של הבריכה. הוסף את נפחי מחושב כל ספריה לתוך צינור 1.5 mL החדש, לערבב על ידי pipetting. מוסיפים מים כדי להשיג את הנפח הכולל מחושב. לאחסן ספריות במאגר ב-20 ° C.
    4. שלח aliquot של הספרייה במאגר שנקבע באמצעות 50 bp יחיד-קצה רצף לרוץ על פלטפורמת רצף אילומינה. אנחנו באופן שגרתי מגה-פלקס 12 דוגמאות רצף יחיד להפעיל, אילו התשואות ~ 200 מיליון קורא לכל רצף ליין.
      הערה: המספר הסופי של קריאות טביעת רגל שנאספו עבור כל דגימה תלוי הכמות של החומר קלט ורמת זיהום rRNA.

    תוצאות

    צינורות מפורט לניתוח bioinformatic של ריבוזום פרופיל נתונים היו כפי שתוארה לעיל 8,9. בנוסף, מספר קבוצות מחקר פיתחו ושפור דיפרנציאלית של הביטוי מפענוח ועיבוד של רצף נתונים, שהם ספציפיים ריבוזום פרופיל שיטת 10,11,

    Discussion

    הגישה Ribo-Seq התפתחה טכנולוגיה רבת עוצמה לניתוח של mRNA תרגום ויוו הגנום כולו ברמה 3. מחקרים באמצעות גישה זו, אשר מאפשר ניטור תרגום עם רזולוציה יחיד-codon, תרם להבנת translational רגולציה. למרות יתרונותיה, Ribo-Seq יש מספר מגבלות. שברי Ribosomal RNA (rRNA) הם תמיד מטוהרים במשותף במהלך בידוד עקבות המו...

    Disclosures

    המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

    Acknowledgements

    עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AG040191 ו- AG054566 כדי VML. מחקר זה נערך בזמן VML היה נמען מענק מחקר עפר מן הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    0.45 μM membrane filtersMilliporeHVLP04700
    0.5 M EDTAInvitrogenAM9261
    0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C)Invitrogen15567-027
    10X TBE bufferInvitrogenAM9863
    10% TBE-urea gelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-urea gelInvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-urea sample bufferInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5InvitrogenAM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL)EpicentreDA11101K
    5X Nucleic acid sample loading bufferBio-Rad161-0767
    8% TBE gelInvitrogenEC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
    Blue light transilluminatorClare Chemical ResearchDR-46B
    Chrome-steel beads, 3.2 mmBioSpec Products11079132c
    CryogrinderBiospec product3110BX
    CycloheximideRPIC81040-5.0
    Data Acquisition SystemDATAQ InstrumentsDI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)NEBN0447L
    GlycogenInvitrogenAM9510
    Gradient fractionation systemBrandelBR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)NEBM0530SSupplied with 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing library quantification kitKapa BiosystemsKK4824
    Nucleic acid gel stainInvitrogenS11494
    Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
    Poly(A) mRNA isolation kitInvitrogen61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL)EpicentreRJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL)Invitrogen18080093Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
    RNA fragmentation bufferNEBE6186A
    RNase I (100 U/μL)InvitrogenAM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL)InvitrogenAM2696
    Silicone rubber capsBioSpec Products2008
    ssDNA ligase (100 U/μL)EpicentreCL9021KSupplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
    Stainless steel microvials, 1.8 mLBioSpec Products2007
    SucroseRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotorBeckman Coulter331362
    Syringe pumpNew Era Pump SystemsNE-300
    T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)NEBM0201SSupplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)NEBM0373SSupplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
    Thermal cyclerBio-Rad1851148
    Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
    UV monitorBio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae strain BY4741Open BiosystemsYSC1048

    References

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130RNA

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved