Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Zusammenfassung

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Zusammenfassung

Übersetzung von mRNA in Proteine ist ein komplexer Prozess mit mehreren Schichten der Verordnung. Es wird oft angenommen, dass Veränderungen in der mRNA-Transkription in der Proteinsynthese Änderungen, aber viele Ausnahmen eingehalten worden. Vor kurzem hat sich eine Technik namens Ribosom Profilierung (oder Ribo-Seq) eine leistungsfähige Methode entwickelt, die Identifizierung, mit hoher Genauigkeit ermöglicht, welche Regionen der mRNA in Proteine und Quantifizierung des Übersetzungsdienstes der Genom-weite Ebene umgesetzt werden. Hier präsentieren wir Ihnen eine generalisierte Protokoll für genomweite Quantifizierung der Übersetzung mittels Ribo-Seq angehende Hefe. Darüber hinaus ermöglicht Kombination Ribo-Seq-Daten mit mRNA Fülle Messungen gleichzeitig Übersetzung Effizienz von Tausenden von mRNA Transkripte in der gleichen Probe zu quantifizieren und Änderungen dieser Parameter als Reaktion auf experimentelle vergleichen Manipulationen oder in verschiedenen physiologischen Zuständen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Ribosom Fußabdrücke mit Nuklease Verdauung, Isolierung von intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe über Saccharose gradient Fraktionierung und Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für tiefe Sequenzierung zusammen mit entsprechenden Qualitätskontrollen notwendig, genaue Analyse der in Vivo Übersetzung zu gewährleisten.

Einleitung

mRNA Übersetzung ist eines der grundlegenden Prozesse in der Zelle, die eine wichtige bei der Regulierung der Proteinexpression Rolle. Daher wird die mRNA Übersetzung als Reaktion auf verschiedene interne und externe physiologischen Reize ^1,2streng kontrolliert. Allerdings bleiben die Mechanismen der translationalen Verordnung erforschten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung. Das übergeordnete Ziel der Ribosom Profilerstellungs-Technik ist, zu studieren und die Übersetzung von spezifischen mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen zu quantifizieren. Diese Technik nutzt Next Generation Sequencing, um Ribosom Belegung im gesamten Genom quantitativ zu analysieren und ermöglicht die Überwachung der Rate des Protein-Synthese in Vivo auf der einzigen Codon Resolution ^3,4. Derzeit, diese Methode bietet die modernsten Mittel zur Messung der Niveaus von Protein Übersetzung und hat sich als ein nützliches Discovery-Tool die Informationen, die von anderen derzeit verfügbaren Techniken, z.B. Microarrays offenbart werden kann nicht oder Übersetzung Status Array-Analyse (TSAA) ⁵. Als Ribosom Profilierung Berichte über die kombinierte Veränderungen in Abschrift Ebenen und translationale Ausgabe bietet es auch viel mehr Sensibilität gegenüber anderen Methoden.

Dieser Ansatz basiert auf Tiefe Sequenzierung des Ribosom-geschützte mRNA Fragmenten ³. Während der Protein-Übersetzung, Ribosomen zu schützen ~ 28 nt Teile der mRNA (so genannte Fußabdrücke) ⁶. Durch die Bestimmung der Reihenfolge der Fragmente Ribosom geschützt, kann Ribo-Seq ordnen Sie die Position der Ribosomen auf die übersetzten mRNA und ermitteln, welche Regionen der mRNA Protein ^3,7aktiv übersetzt werden dürften. Darüber hinaus können wir die Übersetzung von mRNA quantitativ messen, durch zählen der Anzahl der Spuren, die zu einem bestimmten mRNA-Transkript ausgerichtet.

Um das Ribosom-geschützten Fragmente zu isolieren, sind Zelle Lysates zunächst mit einem Inhibitor der Übersetzung, die Ribosomen, gefolgt von Ribonuklease Verdauung stall behandelt. Während kostenlose mRNA und Teile der übersetzten mRNAs nicht geschützt von Ribosomen von Ribonuklease abgebaut werden, können die Ribosom geschützt mRNA Fragmenten durch Reinigung intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe wiederhergestellt werden. Diese mRNA Fußabdrücke sind dann in cDNA Bibliothek umgewandelt und durch tiefe Sequenzierung (Abbildung 1) analysiert. Parallel zur Profilerstellung Ribosom ist intakt mRNA aus derselben Probe extrahiert und sequenziert. Durch Vergleich des Übersetzung von Ribo-Seq mit mRNA Fülle Messungen identifiziert, können wir identifizieren Gene, speziell Up - oder Down-reguliert auf der Ebene der Übersetzung und Übersetzung Effizienz der mRNA auf Genom-weite Ebene zu berechnen. Während des Protokolls, die in diesem Artikel beschriebenen spezifisch für Hefe ist, sollte es auch nützlich für Forscher, die versuchen, das Ribo-Seq-Protokoll in andere Systeme zu etablieren.

Protokoll

1. Vorbereitung extrahieren

1. Streak Hefestämme von gefrorenen Vorräte für einzelne Kolonien auf YPD Platten (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose und 2 % Agar). 2 Tage inkubieren Sie die Platten bei 30 ° C.
2. Hefe aus einer YPD-Platte (verwenden Sie eine einzelne Kolonie) in 15 mL YPD Medium (Hefeextrakt 1 %, 2 % Pepton, 2 % Glukose) in einem 50 mL konische Zentrifugenröhrchen impfen und wachsen über Nacht mit schütteln (200-250 u/min) bei 30 ° C.
3. Verdünnen Sie Kultur in 500 mL YPD Medium in einem 2 L sterile Kolben, so dass die OD₆₀₀ < 0,1. Wachsen Hefezellen unter Schütteln bei 30 ° C für 3-5 h bis OD₆₀₀ = 0,5 (Mid Log-Phase).
4. Sammeln Sie Zellen durch Filterung durch 0,45 μm Membranfilter mit Filter Glasaufbau Halter. Kratzen die Pellets mit einem Spatel, Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C. Die erwartete Größe des gefrorenen Pellet ist ~ 0,2 - 0,5 g.
   Achtung: Flüssigstickstoff ist extrem niedrige Temperatur; angemessenen Schutz zu tragen.
5. Bereiten Sie einen frischen Lysis Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, MgCl₂, 5 mM 100 μg/mL Cycloheximide, 0,5 mM DVB-t, 1 % Triton x-100) unmittelbar vor der Verwendung, halten Sie auf dem Eis.
6. Genommen Sie 3 Chromstahl Perlen (3,2 mm) in einem Edelstahlrohr 1,8 mL. Pre-chill in flüssigem Stickstoff und gefrorenen Pellets hinzufügen, abdecken mit einer Silikon-Gummikappe. Homogenisieren die Probe durch Cryogrinding für 10 s bei 4200 u/min; Wiederholen Sie 10-Mal. Chill-das Rohr in flüssigem Stickstoff für mindestens 10 s zwischen jeder Runde.
   Hinweis: Es ist wichtig, immer die Probe gefroren zu halten.
7. Fügen Sie 1 mL Lyse-Puffer, mischen Sie gut durch pipettieren. Übertragen Sie in eine neue 1,5 mL Tube.
8. Zentrifuge bei 20.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Während der Arbeit auf dem Eis, übertragen Sie den Überstand in eine neue 1,5 mL Tube. Eine neue 1,5 mL Tube für Poly-mRNA-Isolierung übermitteln Sie 100 μL der lysate. Gehen Sie sofort zur RNA-Isolierung oder Blitz Einfrieren in flüssigem Stickstoff das Rohr. Maßnahme OD₂₆₀ der übrigen lysate, die für Footprint Extraktion verwendet wird, und flash Einfrieren der Rohre in flüssigem Stickstoff. Speichern der Lysates bei-80 ° C.

2. Bilanz Extraktion

1. Vorbereitung der Saccharose Steigungen
   1. Erarbeiten Sie Lösungen für 50 %, 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Saccharose in Gradient Puffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 100 μg/mL Cycloheximide, 0,5 mM DVB-t).
   2. Pipette 2,2 mL bereit 50 % Saccharose Puffer an der Unterseite der 13,2 mL dünnwandige Polyallomer Röhre und frieren die Lösung für 10 min bei-80 ° C (Abbildung 2). Dann Schicht 2,2 mL 40 % Saccharose Puffer auf den gefrorenen 50 % Saccharose Puffer, und für 10 min bei-80 ° c eingefroren Nach den gleichen Anweisungen Schicht 30 %, dann 20 %, und schließlich 10 % Saccharose puffert oben auf der jeweils anderen. Verhindern Sie, dass Luftblasen während Schichtung. Halten Sie die Steigungen bei-80 ° C bis zur Verwendung. Die Saccharose Steigungen sollten mindestens einen Tag vor dem Experiment vorbereitet und bei-80 ° C.
2. Nuklease Verdauung
   1. Auftauen der Saccharose Steigungen am Vorabend Experimente bei 4 ° C.
   2. Zelle lysate (Footprint Probe) auf Eis auftauen. Übertragen Sie eine aliquote Zelle lysate, enthält 50 OD₂₆₀ Einheiten zu einem neuen 1,5 mL Schlauch geben und frische Lysis Puffer bis zu 1 mL. Speichern Sie die restlichen lysate bei-80 ° C. Fügen Sie 10 μl RNase ich (100 U/μl) und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur mit sanften Drehung auf ein Kopf-über-Kopf-Rotator.
   3. (Optional) Klären Sie die Proben bei 20.000 x g für 5 min bei 4 ° C und erholen Sie den Überstand in ein neues 1,5 mL Röhrchen zu.
3. Ultrazentrifugation
   1. Sanft Schicht lysate Proben an die Spitze eines 10-50 % Saccharose Gradienten.
   2. Ultrazentrifugen der Polyallomer Röhren bei 210.000 x g (35.000 u/min) bei 4 ° C für 3 h mit SW-41 Ti Rotor.
4. Gradient Fraktionierung Systemeinrichtung
   1. Schalten Sie die Komponenten und ermöglichen Sie die UV-Monitor zum Aufwärmen für mindestens 30 min.
   2. Wenn mit einem digitalen Recorder-Software starten Sie die Software auf dem Computer, legen Sie das Diagramm Skalierungsgrenzen auf -0,01 und 1.
   3. Füllen Sie die Spritze mit Chase Lösung (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 60 % Saccharose), entfernen Sie eventuelle Luftblasen in der Spritze und Kanüle.
   4. Installieren einer Ultrazentrifuge Rohres gefüllt mit RNase-freies Wasser. Durchbohren Sie das Rohr mit der Kanüle, bis zwei schwarze Flecken zu sehen. Starten Sie die Spritzenpumpe bei 1 mL/min.
   5. Während das Wasser die Durchflusszelle durchläuft, Taste "Auto Zero" auf dem UV-Monitor Basislinie auf 0 einstellen. Stellen Sie die Empfindlichkeit der UV-Monitor zu "2.0 AU". Nach eine stabilere Basislinie eingerichtet wurde, die Spritzenpumpe zu stoppen. Wiederherstellen Sie die Chase-Lösung und entfernen Sie der Ultrazentrifuge Rohr zu.
5. Monosome Isolierung
   1. Installieren Sie und durchbohren Sie die Ultrazentrifuge Röhrchen mit der Saccharose-Gradient. Starten Sie die Spritzenpumpe bei 1 mL/min, sammeln Sie 1 mL Fraktionen Überwachung ein₂₅₄ Werte zu. Pool-Fraktionen vertreten die 80er Jahre Monosome Höhepunkt in einem Rohr, halten Sie auf dem Eis (Abbildung 3).
   2. Chase Lösung die Messzelle erreicht, schalten Sie Spritzenpumpe aus. Chase Lösung zu erholen und der Ultrazentrifuge Rohr zu entfernen. Wiederholen Sie für den Rest der Proben ab Schritt 2.5.1 Fraktionierung.
      Hinweis: Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie die Fraktionierung System mit mindestens 30 mL der RNase-freies Wasser. Schlauch, Spritze und alle austauschbaren Komponenten mit warmem Wasser gründlich zu waschen.
   3. Filtern der Brüche durch 0,5 mL zentrifugale Filter (100 kDa MWCO) bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C und die Durchströmung zu verwerfen, wiederholen, bis Volumen ist < 100 μL. 400 μl des Release-Puffers (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA, 40 U/mL RNase-Inhibitor) hinzufügen. Mix von pipettieren, brüten auf Eis 10 min und übertragen Sie das Gerät in eine neue Kollektion-Röhre. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C und die Durchströmung zu sammeln.
6. Fußabdruck Fragment Reinigung
   1. Die Durchströmung mit Fußabdruck RNA Fragmente eine neue 1,5 mL tube, fügen Sie 20 μL 20 % SDS (um eine Endkonzentration von 1 %), mischen, indem Sie pipettieren zu übertragen.
   2. Fügen Sie 1 Volumen von Säure-Phenol: Chloroform (pH 4,5), Wirbel für 10 s.
      Achtung: Säure-Phenol: Chloroform ist giftig, vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Inhalation.
   3. Bei 65 ° C für 5 min erhitzen, auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C gelegt, die wässrige Phase (oben) auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
   4. Fußabdruck-RNA-Fragmente durch Hinzufügen von 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt.

Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(3) Poly-mRNA-Extraktion

1. Insgesamt RNA-Extraktion
   1. Tauen Sie ein 100 μL aliquoten Zelle lysate (Gesamt-RNS -Probe) auf Eis auf, fügen Sie 300 μl 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und 20 μL 20 % SDS (um eine Endkonzentration von 1 %), mischen, indem Sie pipettieren.
   2. Fügen Sie 1 Volumen (400 μl) von Säure-Phenol: Chloroform (pH 4,5) und Vortex für 10 s.
   3. Bei 65 ° C für 5 min erhitzen, auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C gelegt, die wässrige Phase (oben) auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
   4. Führen Sie eine zweite Phenol Extraktion. Fügen Sie 1 Volumen von Säure-Phenol: Chloroform (pH-Wert 4,5), Wirbel für 10 S. Hitze bei 65 ° C für 5 min auf Eis für 1 min. Zentrifuge der Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die wässrige Phase auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
   5. Überstürzen Sie sich die RNA. Dafür fügen Sie 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
2. Poly-mRNA-Isolierung
   1. Die RNA-Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C zentrifugiert, Ethanol zu entfernen. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und Pellet für 5 min der Luft trocknen lassen.
   2. Das Pellet in 300 μL der Lyse/Bindung Puffer aus dem poly(A) mRNA Isolierungskit auflösen. Fahren Sie mit Poly-mRNA-Extraktion nach poly(A) mRNA isoliert Kit des Herstellers Protokoll.
   3. Die mRNA-Proben durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
3. mRNA-Fragmentierung
   1. Zentrifugieren Sie die mRNA-Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 sec, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit Gel-Tip und das Pellet für 5 min lufttrocknen.
   2. Aufschwemmen Sie mRNA in 18 μl RNase-freies Wasser, fügen Sie 2 μl 10 x RNA Fragmentierung Puffer. 5 min bei 94° c inkubieren Rohr zu Eis zu übertragen.
   3. Durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(4) dephosphorylation

1. Footprint und fragmentierten mRNA Proben mit T4-Polynukleotid-Kinase zu behandeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einem Gel laden Tipp. Das Pellet für 5 min der Luft trocknen lassen.
2. Aufschwemmen Sie das Pellet in 7,75 µL Wasser, fügen Sie 1 µL 10 x T4 Polynukleotid Kinase Puffer, 1 µL T4-Polynukleotid-Kinase (10.000 U/mL) und 0,25 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL). 1 h bei 37 ° c inkubieren
3. (Optional) Vorab laufen Sie eine 15 %-TBE-Harnstoff-Gel bei 180 V für 15 min mit 1 X TBE Puffer.
4. 10 µL jeder Fußabdruck und mRNA Probe 10 µL 2 X TBE-Harnstoff Probenpuffer hinzufügen. Bereiten Sie ein Beispiel für ein Steuerelement mit 1 µL 10 µM obere Größe Marker Oligonukleotid (32 nt), 1 µL 10 µM geringer Größe Marker Oligonukleotid (28 nt), 8 µL Wasser und 10 µL 2 x TBE-Harnstoff Probenpuffer für Footprint Proben. Bereiten Sie ein Beispiel für ein Steuerelement mit 1 µL 10 µM RNA Marker Oligonukleotid (63 nt), 9 µL Wasser und 10 µL 2 x TBE-Harnstoff Probenpuffer für mRNA Proben.
5. Die Proben und Kontrollen 3 min bei 75 ° C inkubieren, spin-down, auf Eis gelegt, für 1 min. jede Probe in 2 Brunnen des 15 % FSME-Harnstoff Gels, getrennten RNA-Fragmente durch Gelelektrophorese bei 180 V 1 h laden.
6. Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen.
7. Mit einer blauen Licht Transilluminator, schneiden die richtige Band zwischen 28 und 32 nt Marker für Fußabdruck Proben (Abb. 4A) und rund Proben 50-70 nt für mRNA (Abbildung 4 b) mit einer sauberen Rasierklinge. Frieren Sie die Polyacrylamid-Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.
8. Extrahieren Sie RNA aus dem Polyacrylamid-Gel wie folgt. Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2 min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren RNA mit 300 µL Elution Buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,0, 2 mM EDTA), fügen Sie 1 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.
9. Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(5) 3'-Adapter Ligation

1. Zentrifugieren Sie die Footprint und mRNA Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
2. Das Pellet in 4.75 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen, 2 µL 50 % PEG8000, 1 µL 10 X T4 RNA Ligase Puffer, 1 µL 3'-Adapter (100 ng/µL), 0,25 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL) 1 µL T4 RNA Ligase 2 abgeschnitten KQ (200.000 U/mL). Inkubation über Nacht bei 16 ° C.
3. Am nächsten Morgen, entfernen Sie das überschüssige des Adapters durch Zugabe von 0,5 µL 5'-Deadenylase (10 U/µL) und 0,5 µL Rec J Exonuclease (10 U/µL) direkt an die Ligatur-Reaktion. 30 min. bei 30 ° c inkubieren
4. Die Proben auszufällen. Hierzu fügen Sie 30 µL Nuklease-freies Wasser, 1 µL Glykogen (10 mg/mL), 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5) und 2,5 Bände von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(6) reverse Transkription

1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
2. Aufschwemmen Sie das Pellet in 11,5 µL Nuklease-freies Wasser, 0,5 µL 8 µM reversen Transkription Grundierung (RT Primer) und 1 µL dNTP-Mix (10 mM). 5 min bei 65 ° C inkubieren, auf Eis legen.
3. Fügen Sie 4 µL 5 X ersten Strang Puffer, 2 µL 0.1 M DTT, 0,5 µL RNase-Inhibitor (20 U/µL), 0,5 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL). 30 min bei 48 ° C, 1 min bei 65 ° C, 5 min bei 80 ° c inkubieren
4. Nicht überstürzen und gehen Sie sofort auf die Hydrolyse von RNA, durch Zugabe von 0,8 µL 2 M NaOH, 30 min bei 98 ° c inkubieren Hinzufügen von 0,8 µL 2M HCl Reaktion zu neutralisieren.
5. Die Proben auszufällen.

Hierzu fügen Sie 20 µL Nuklease-freies Wasser, 1 µL Glykogen (10 mg/mL), 1/10 Volumen der NaOAc (pH 5,5) und 2,5 Bände von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze. Das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.

Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 µL Nuklease-freies Wasser, fügen Sie 5 µL 2 X Probenpuffer FSME-Harnstoff. 3 min bei 75 ° C inkubieren, spin-down, für 1 min auf Eis gelegt.

(Optional) Bereits laufen Sie eine 10 %-TBE-Harnstoff-Gel bei 180 V für 15 min mit 1 X TBE-Puffer.

Laden Sie die Probe auf 1 auch von der 10 %-TBE-Harnstoff-Gel. Trennen Sie die Produkte der reversen Transkription Reaktion durch Gelelektrophorese auf 180 V 50 min. Als Kontrolle bereiten Sie eine Probe mit 1 µL 2,5 µM RT Primer, 1 µL 2,5 µM 128 nt Marker Oligonukleotid, 3 µL Wasser und 5 µL 2 X TBE-Harnstoff Puffer zu probieren, und führen Sie auf einer separaten Spur des Gels.

Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen. Schneiden Sie mit einem blauen Licht Transilluminator Band rund 128 nt und höher (Abbildung 5) mit einer sauberen Rasierklinge. Frieren Sie die Polyacrylamid-Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.

Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren DNA mit 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.

Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.

(7) circularization

1. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und das Pellet für 10 min der Luft trocknen lassen.
2. Das Pellet in 16,75 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Fügen Sie 2 µL 10 x einzelsträngiger DNA (SsDNA) Ligase Puffer, 1 µL 50 mM MnCl_2, 0,25 µL SsDNA Ligase (100 U/µL). 1 h bei 60 ° C, 10 min bei 80 ° c inkubieren Nicht überstürzen Sie, und speichern Sie das Reaktionsprodukt SsDNA Ligatur bei-20 ° C.

(8) PCR-Bibliothek-Verstärkung

1. Während der Arbeit auf dem Eis, mischen die folgenden in einem PCR-Röhrchen: 146 µL Nuklease-freies Wasser, 2 µL 20 µM Forward Primer, 2 µL 20 µM indiziert Reverse Primer, 40 µL 5 x High Fidelity DNA Plymerase Puffer, 4 µL von dNTPs (10 mM), 4 µL SsDNA Ligatur Reaktionsprodukt , und 2 µL der High-Fidelity-DNA-Polymerase. Wählen Sie verschiedene indiziert Reverse Primer für jede Probe, die für die Sequenzierung gemultiplext werden. Übertragen Sie eine aliquote 50 µL des PCR-Gemisches in 4 neue PCR-Rohre.
2. Führen Sie die PCR-Amplifikation mit einer unterschiedlichen Anzahl von Zyklen (8, 10, 12, 14) mit folgenden Einstellungen:
   1 min bei 98 ° C erste Denaturierung
   8 bis 14 Zyklen:
   15 s bei 94 ° C
   5 s bei 55 ° C
   10 s bei 65 ° C
   2 min bei 65 ° C letzte Verlängerung
3. Das PCR-Produkt durch Hinzufügen von 1/10 Volumen von 3 M NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol ausgefällt. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und lufttrocknen Pellet.
5. Aufschwemmen Sie das Pellet in 8 µL Nuklease-freies Wasser, fügen Sie 2 µL nicht Denaturierung 5 x Probenpuffer Nukleinsäure. Laden Sie die Probe auf 1 auch von nicht-Denaturierung 8 % TBE Gel. Trennen Sie die DNA-Produkte durch Gelelektrophorese auf 150 V für 35 min. Als Kontrolle bereiten Sie eine Probe mit 0,5 µL 10 bp DNA-Leiter (1 µg/µL), 7,5 µL Wasser und 2 µL nicht Denaturierung 5 x Probenpuffer Nukleinsäure und führen auf eine separate Spur des Gels.
6. Fleck das Gel für 5 min mit einer Nukleinsäure-Gel Fleck (verdünnte 10.000 x im Wasser), vor Licht schützen. Schneiden Sie mit einem blauen Licht Transilluminator Band rund 150 bp für Fußabdruck Proben und rund 180 bp für mRNA Proben (Abbildung 6) mit einer sauberen Rasierklinge. Speichern Sie die Gel-Stücke bei-80 ° C für mindestens 10 Minuten.
7. Die Gel-Stücke bei 70 ° C für 2 min erhitzen, das Gel mit Einweg-Pellet Stößel zermahlen. Eluieren DNA mit 300 µL 20 mM Tris-HCl pH 7.0 und Inkubation bei 37 ° C für 3 h.
8. Probe bei 12.000 x g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, den Überstand zu sammeln und Niederschlag durch Hinzufügen von 1/10 Volumen des NaOAc (pH 5,5), 1/100 Volumen von Glykogen (10 mg/mL) und 2,5 Volumina von 100 % Ethanol. Inkubation bei-20 ° C für mindestens 1 h.
9. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C, entfernen Sie Ethanol zu. Spin-down 30 s bei Höchstgeschwindigkeit, entfernen Sie den Rest des Ethanols mit einer Gel-laden-Spitze und lufttrocknen Pellet. Zu guter Letzt Aufschwemmen Sie die Bibliotheken in 20 µL Nuklease-freies Wasser und fahren Sie mit Quantifizierung, Qualitätskontrolle und Sequenzierung.

9. Bibliothek Quantifizierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung

1. Vor dem Senden der Proben für die Sequenzierung, bestimmen Sie den Ertrag und die Qualität der PCR verstärkt Bibliotheken. Repräsentative Profile für Bilanz und mRNA Sequenzierung Bibliotheken sind in Abbildung 7dargestellt. Die erwartete Größe der PCR verstärkt Bibliothek ist 148-152 bp für Footprint Proben und 170-190 bp für mRNA Proben.
2. Wenn mehrere Proben mit verschiedenen Barcodes für die Sequenzierung gebündelt werden werden, führen Sie genaue Quantifizierung der Bibliotheken mit einem qPCR-basierte Sequenzierung Bibliothek Quantifizierung Assay.
3. Bündeln Sie die Bibliotheken in äquimolaren Verhältnisse. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Pools als 3 µL x Gesamtzahl der Proben, gebündelt werden. Bestimmen Sie die Lautstärke für jede Bibliothek, die hinzugefügt werden, so dass Bibliotheken in der äquimolaren Verhältnisse bis 10 nM Endkonzentration des Pools zu erreichen gemischt werden muss. Fügen Sie die berechneten Mengen jeder Bibliothek in ein neues 1,5 mL Röhrchen, durch Pipettieren mischen. Fügen Sie Wasser hinzu, um die berechneten Gesamtvolumen zu erreichen. Speichern von gepoolten Bibliotheken bei-20 ° C.
4. Senden Sie ein Aliquot der gepoolten Bibliothek mit 50 bp Einend-Sequenzierung laufen auf einer Plattform Illumina Sequenzierung sequenziert werden. Wir routinemäßig multiplex-12 Proben in einem einzigen Sequenzierung ausgeführt, welche Erträge ~ 200 Millionen pro Sequenzierung Bahn liest.
   Hinweis: Die endgültige Anzahl der Fußabdruck Lesevorgänge pro jede Probe gesammelt richtet sich nach der Menge des verwendeten ein- und rRNA Verschmutzungsgrad.

Ergebnisse

Detaillierten Rohrleitungen für bioinformatische Analyse der Ribosom Profilerstellungsdaten wurden ^8,9beschrieben. Darüber hinaus haben mehrere Forschungsgruppen entwickelt Bioinformatik für differenzielle gen Ausdruck Analyse und Aufbereitung von Sequenzierungsdaten, die spezifisch für Ribosom Profilerstellung Methode ^{10,11,12 ...}

Diskussion

Die Ribo-Seq-Ansatz ist eine leistungsstarke Technologie für die Analyse von mRNA Übersetzung in Vivo bei der Genom-weite Ebene ³entstanden. Studien mit diesem Ansatz, der ermöglicht die Überwachung von Übersetzung mit Single-Codon Auflösung, hat zu unserem Verständnis der translational Regelung beigetragen. Trotz seiner Vorteile hat Ribo-Seq mehrere Einschränkungen. Ribosomale RNA (rRNA) Fragmente sind immer Co gereinigten während Isolierung des Ribosom-geschützte Fußabdrücke...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μM membrane filters	Millipore	HVLP04700
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9261
0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)	Millipore	UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7.0	Invitrogen	AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C)	Invitrogen	15567-027
10X TBE buffer	Invitrogen	AM9863
10% TBE-urea gel	Invitrogen	EC6875BOX
15% TBE-urea gel	Invitrogen	EC6885BOX
2 M MgCl2	RPI	M24500-10.0
2X TBE-urea sample buffer	Invitrogen	LC6876
3M NaOAc, pH 5.5	Invitrogen	AM9740
5' Deadenylase (10 U/μL)	Epicentre	DA11101K
5X Nucleic acid sample loading buffer	Bio-Rad	161-0767
8% TBE gel	Invitrogen	EC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Invitrogen	AM9722
Blue light transilluminator	Clare Chemical Research	DR-46B
Chrome-steel beads, 3.2 mm	BioSpec Products	11079132c
Cryogrinder	Biospec product	3110BX
Cycloheximide	RPI	C81040-5.0
Data Acquisition System	DATAQ Instruments	DI-245
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	NEB	N0447L
Glycogen	Invitrogen	AM9510
Gradient fractionation system	Brandel	BR-184X
High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)	NEB	M0530S	Supplied with 5X Phusion HF Buffer
Next-generation sequencing library quantification kit	Kapa Biosystems	KK4824
Nucleic acid gel stain	Invitrogen	S11494
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Poly(A) mRNA isolation kit	Invitrogen	61011
Rec J exonuclease (10 U/μL)	Epicentre	RJ411250
Reverse transcriptase (200 U/μL)	Invitrogen	18080093	Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
RNA fragmentation buffer	NEB	E6186A
RNase I (100 U/μL)	Invitrogen	AM2295
RNase inhibitor (20 U/μL)	Invitrogen	AM2696
Silicone rubber caps	BioSpec Products	2008
ssDNA ligase (100 U/μL)	Epicentre	CL9021K	Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
Stainless steel microvials, 1.8 mL	BioSpec Products	2007
Sucrose	RPI	S24060-5000.0
SW-41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)	NEB	M0201S	Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)	NEB	M0373S	Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
Thermal cycler	Bio-Rad	1851148
Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL	Beckman Coulter	331372
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML
UV monitor	Bio-Rad	7318160
Saccharomyces cerevisiae strain BY4741	Open Biosystems	YSC1048