JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לצבירת ראיות תומך ברעיון כי אגרגטים חלבון פתוגניים המשויך מחלות ניווניות להפיץ בין תאים עם תכונות כמו פריון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת ויזואליזציה בהפצת לתא של פריון כמו אגרגטים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה.

Abstract

צבירת חלבון הוא מאפיין מרכזי של רוב מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD) נוירודגנרטיביות (ALS). אגרגטים חלבון קשורים קשר הדוק עם neuropathology במחלות אלה, למרות המנגנון המדויק שבו צבירת חלבון aberrant משבש הומאוסטזיס סלולרית רגילה לא ידוע. מתעוררים נתונים מספקים תמיכה חזקה על ההשערה את צבירות פתוגניים לספירה, PD, HD, ALS יש קווי דמיון רבים כדי prions, שהינם חלבונים בלבד מדבקים אחראי encephalopathies spongiform מדבקות. Prions עצמית שכפל באמצעות תבניות ההמרה של מקופלת מקורי גירסאות של החלבון אותו, גורם התפשטות פנוטיפ צבירה. איך prions וחלבונים כמו פריון לספירה, מהלך PD, HD ו- ALS מתא אחד למשנהו הוא כיום שטח של חקירה אינטנסיבית. כאן, מתואר מודל דרוזופילה melanogaster המאפשר ניטור של שידור כמו פריון, מתא לתא של אגרגטים מוטציה huntingtin (Htt) המשויך HD. מודל זה מנצל כלים רבי-עוצמה מניפולציה transgene ביטוי ברקמות דרוזופילה שונות רבות, מנצל חלבון cytoplasmic מתויג fluorescently ישירות דוח העברת פריון כמו מוטציה אגרגטים Htt. חשוב מכך, הגישה שנתאר כאן יכול לשמש כדי לזהות גנים הרומן משעולים המתווכות התפשטות של אגרגטים חלבון בין סוגי תאים שונים vivo בתוך. מידע ממחקרים אלה ירחיב את ההבנה מוגבלת של המנגנונים פתוגניים אשר מושתתות מחלות ניווניות ולחשוף הזדמנויות חדשות התערבות טיפולית.

Introduction

ההשערה פריון נקבע כי הסוכן זיהומיות אחראי מדבקות spongiform encephalopathies (למשל, מחלת קרויצפלד - יעקב בבני אדם, scrapie כבשים, מחלה כרונית לבזבז צבאים, איילים, "מחלת הפרה המשוגעת" בבקר ) מורכב אך ורק של חלבון של חומצות גרעין1. מחלות פריון, החלבון פריון הסלולר (PrPC) ההנחה היא שנוצרה, יציב קיפול (PrPSc) מאוד בטא גיליון עשיר, באפשרותך להפיץ עצמית על ידי המרת וגיוס monomeric מולקולות PrPC לתוך עמילואיד יציב אגרגטים. PrPSc אגרגטים להשתמש במנגנון הזה המשכפלת להפיץ בין תאים שונים באורגניזם, אפילו בין אורגניזמים נפרדים2.

חלבון misfolding צבירת היא גם תכונה מרכזית של רוב מחלות ניווניות (מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS))3. מערך הרכבות אינטרה - או תוספת - cellular מצטברים חלבונים במחלות אלה קשורה מאוד cytotoxicity4 ומתקדמת לאורך שבילים מאוד הדירים מחלות ספציפיות דרך המוח לאורך זמן5, 6. את הדפוסים הללו של התפשטות מציע כי אגרגטים פתוגניים הקשורים עם הפרעות אלה יש תכונות כמו פריון. כעת קיימת תמיכה חזקה כמו פריון שידור של אגרגטים הקשורים לספירה, PD, HD ו- ALS - הם מתפשטים מן-לתא ותבנית השינוי הסתגלותי של צורות monomeric של החלבון זהה של תאים בעבר לא מושפע7, 8.

הרוב המכריע של מחקרים חוקרת פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון עד כה בוצעו באמצעות מודלים בתרבית של תאים תרבות, איפה אגרגטים להעביר לתוך הציטופלסמה של תאים נאיביים מן המרחב חוץ-תאית או מתא אחר הציטופלסמה,9,10,11,12,13,14,15, או על ידי הזרקת חומר המכיל צבירה לתוך מוח העכבר וניטור צבירה המראה מחוץ הזרקת באתר16,17,18,19,20,21,22, 23. לאחרונה, חיות הטרנסגניים שימשו כדי להדגים אגרגטים תאיים התפשט לתאים אחרים בתוך המוח שלם24,25,26,27, 28,29,30. כאן, אנו מתארים שיטה עבור פריט חזותי ישיר של העברת הצבירה בין תאים בודדים במוח שלם של melanogaster דרוזופילה. דרוזופילה דגמי HD/polyglutamine (polyQ) מחלות פותחו לראשונה לפני כמעט שני עשורים31,32 , סיפקו הרבה תובנות המנגנונים פתוגניים העומדים בבסיס הפרעות אלה שלא יסולא בפז 33. HD הוא הפרעה ניווניות תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה דומיננטי autosomal בגן כי הקודים חלבון huntingtin (Htt)34. מוטציה זו גורמת הרחבה של מתיחה polyQ ליד של Htt אמיני, מעבר לסף מסוים פתוגניים של ~ glutamines 37, גורם החלבון כדי misfold צבירה35,36. פראי-סוג Htt חלבונים המכילים < glutamines 37 ב מתיחה זו להשיג לקפל מקורית שלהם, אבל יכולה להיגרם כדי צבירה בעת מגע פיזי ישיר עם Htt צבירה "זרע"12,27,37. אנו מנצלים את זה homotypic, nucleated צבירה של Htt פראי-סוג כמו הבדיקה להעברה כמו פריון וכניסה cytoplasmic מוטציה האגרגטים Htt שמקורם בתאים אחרים.

קביעת מנגנוני על ידי אגרגטים פריון כמו איזה נסיעות בין תאים יכול להוביל הזיהוי של הרומן מטרות טיפוליות למחלות ניווניות חשוכות מרפא. אנחנו לוקחים את היתרון של מחזור חיי מהירה, קלות שימוש, ללקוחות שלנו גנטי של דרוזופילה melanogaster להגדרת מנגנונים מולקולריים-לתא התפשטות מוטציה אגרגטים Htt. האסטרטגיה שלנו ניסיוני מעסיקה שתי מערכות בינאריות ביטוי זמינה דרוזופילה, את ומבוססת Gal4 ספציפי נגד הזרם הפעלת רצף (Gal4-UAS) מערכת38 את פותח לאחרונה QF-QUAS מערכת39. זיווגים אלה שתי מערכות עצמאיות מאפשר הגבלת הביטוי של מוטציות ובני פראי-סוג transgenes Htt אוכלוסיות תאים נפרדים בתוך לטוס באותו ה40. באמצעות גישה זו, נבחן פריון כמו התפשטות של מוטציה Htt על-ידי ניטור הפצה מחדש של Htt פראי-סוג cytoplasmic ממצב שלה בדרך כלל ' מאטום לשקוף ', מסיסים למצב צבור, תוצאה ישירה של מגע פיזי עם מוטנט הקבועים מראש Htt צבירה "זרע". המרה של פראי-סוג Htt מאת mutant Htt יכול להיות אישרו שימוש ביוכימי או טכניקות biophysical כי הדו ח אינטראקציות חלבון-חלבון, כגון קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה להעביר (סריג)9,27,41 .

חשוב, אנחנו יכולים גם לגשת מספר רב של כלים גנטיים דרוזופילה לזיהוי גנים ו/או מסלולים המתווכות פריון כמו התפשטות אגרגטים חלבון. השתמשנו לאחרונה בגישה זו כדי לחשוף את תפקיד מפתח עבור הקולטן נבלות פני שטח התא, דרייפר42,43, בהעברת אגרגטים Htt מוטציה של אקסונים עצביים בקרבת מקום עכשיו, phagocytic דונלד ב דרוזופילה המרכזית מערכת העצבים (CNS)27. לפיכך, הגישה הגנטית דימות מבוססות כי אנו מתארים כאן יכול לחשוף מידע חשוב ביולוגיים בסיסיים על תופעה מחלות רלוונטיות פשוטה לשימוש אבל אורגניזם מודל רב עוצמה, דרוזופילה.

Protocol

1. צימוד Gal4 ו QF-בתיווך Htt Transgene ביטוי דרוזופילה

  1. לאסוף ו/או ליצור הטרנסגניים דרוזופילה melanogaster שורות המכילה רקמות ספציפיות Gal4 או ליטראות "מנהלי", כמו גם קווי המכיל פראי-סוג או מוטציה Htt transgenes במורד הזרם של Gal4-UAS38 או QF-QUAS39. ודא החלבונים באים לידי ביטוי מן transgenes הללו מאוחה חלבונים פלורסנט או מתויג epitope כדי לאפשר בידול של מוטציות ובני פראי-סוג Htt transgene מוצרי הזבוב באותו. ראה איור 1.
    הערה: אנחנו בדרך כלל משתמשים אקסון 1 שברי הגן האנושי Htt27. עם זאת, ניתן להפיק זבובים הטרנסגניים במקום לבטא את שברי Htt ארוך או גנים אחרים במידת הצורך.
  2. תוכנית האסטרטגיה גנטי כזה כי מוטציות ובני פראי-סוג transgenes Htt יתבטא אוכלוסיות תאים נפרדים, שאינם חופפים.
    1. אם הביטוי בחפיפה מתרחשת, מוטציות ובני פראי-סוג החלבונים Htt מסונתז בתאים באותו צבירה משותפת ולמנוע גילוי של אירועים כמו פריון. כדי למנוע זאת, להשתמש repressors ספציפי Gal4 ו ליטראות, Gal80 ו- QS40, בהתאמה (איור 1). בחירת שבשליטת נכה Gal4 ו/או ליטראות מנהלי יכול עזרה להגבלת ביטוי של מוטציה Htt לתאים mitotic פוסט, ביטול האפשרות כי חלוקת התא עשוי לתרום הפצת צבירה-לתא.
  3. באמצעות תנאים culturing סטנדרטיים, חבר את הזבובים ליצירת רומא המבטאים מוטציה Htt דרך ליטראות (או Gal4) ב- "תורם" תא האוכלוסייה ואוכלוסיית תא Htt דרך Gal4 (או ליטראות) ב- "נמען" פראי-סוג. לקבלת מפרטים טכניים מציג שילוב גנטי אפשרי, ראה איור 1 .
    הערה: מנהלי ההתקנים ליטראות, Gal4 שימשו כדי ליצור את הנתונים המוצגים בדמויות 1-4 וב -הפרסום הקודם שלנו27 כוללים הנהג נוירון (ולהתמכר) של קולטני ריח DA1, Or67d-ליטראות, ואת הנהג פאן-גליה, ריפו-Gal4.
  4. צור פקד זבובים במקביל המבטאים פראי-סוג Htt באוכלוסיות תא שתי ליטראות, Gal4-שכותרתו '.
  5. לאסוף צאצא. של גנוטיפ הרצוי ולאחר גיל החיות לפי הצורך.

figure-protocol-2016
איור 1 . הגישה הגנטית עבור ביטוי בשילוב של מוטציות ובני פראי-סוג transgenes Htt באמצעות מערכות בינאריות ביטוי QF-QUAS ו- Gal4-UAS. "תא A," מתויג mCherry מוטציה Htt בחלבון המכיל מתיחה polyQ באורך פתוגניים (Q91) מבוטא באמצעות מנהל התקן ליטראות ממוקם במורד הזרם של מקדם רקמות ספציפיות ("PA"). "תא B," Htt פראי-סוג YFP מתויגת המכילה מתיחה polyQ רגיל (Q25) מבוטא באמצעות מנהל התקן Gal4 נשלט על ידי רקמות ספציפיות יזם ב' (PB"). דמויות 2-4, Or67d-העל שימש לנסיעה ביטוי QUAS-HttQ91-mCherry DA1 ORNs, repo Gal4 השתמשו לבטא UAS-HttQ25-YFP עכשיו, דונלד כל27. חשוב לציין, HttQ91-mCherry מתבטאת רק בתאים המבטאים ליטראות מכוח הרצף QUAS ממוקמים במעלה הזרם של transgene. באופן דומה, HttQ25-YFP מתבטאת רק דרך Gal4, אשר מזהה באופן ספציפי את UAS. אם זוהתה בחפיפה בהפצה רקמות של הנהגים ליטראות, Gal4, יכול להיות מוצג transgenes קידוד QS בתאים המבטאים Gal4 ו Gal80 בתאים המבטאים ליטראות. הוספת תגיות חלבון פלואורסצנטי אל פראי-סוג של מוטציה Htt מאפשר בידול של שני החלבונים במהלך דימות ואת היכולת למדוד סריג בין התורם המתאים/מקבל זוגות (למשל, CFP/YFP או YFP/mCherry). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. ניתוח מיקרו, קיבוע של המוח למבוגרים דרוזופילה

הערה: הליך זה דיסקציה שונתה מן הפרסום הקודם44, והוא יכול לשמש כדי להתכונן המוח פלורסצנטיות ישירה הדמיה, האיתות fusions חלבון Htt-פלורסנט. שינויים בהליך זה יכול להיעשות עבור immunostaining המוח הם דנו בסעיף הבא.

  1. לאסוף את החומרים הבאים ומניחים על הקרח: תמיסת מלח באגירה פוספט המכיל 0.03% טריטון X-100 (PBS/T); microcentrifuge צינורות המכיל µL 970 של 4% paraformaldehyde (PFA) מקבע פתרון שהוכנו על ידי הוספת 200 µL 20% מחברים כדי 770 µL PBS/T; צלחת זכוכית שקופה המכיל טוב; pipet העברה חד פעמיות; שני מלקחיים ויבתר (אחד מס ' 3 ואחד מס ' 5).
  2. עזים ומתנגד הזבובים הבוגרים באמצעות CO2 ומעבירים אותם אל באר אחת של המנה זכוכית על קרח.
  3. בעזרת pipet העברה, להוסיף כמות קטנה (~ 500 µL) של PBS קר/T כדי טוב המכיל הזבובים גם באשר טוב ריק. להימנע מהחדרה בועות רבות מדי, כפי שהם יכולים להפריע הקרע.
  4. למקם את צלחת זכוכית על משטח שטוח מתחת למיקרוסקופ ויבתר ולהתאים את רמת ההגדלה עד לגוף לעוף ממלא את שדה הראיה, נמצא בפוקוס.
  5. מקם זוג של מקורות אור מתכווננת כך אור היא מאירה את שני הצדדים של המנה זכוכית. עיגון רקמה במעבדה מקופל מתחת לצלחת זכוכית כדי למחוק את חלקי הגוף/לציפורן בזמן.
  6. עם המלקחיים מס ' 3 ביד האחרת, להעביר זבוב אחד טוב המכיל PBS/ט לשתק הזבוב על ידי גרירה להחזיק את הבטן שלה עם הצד הבטני פונה כלפי מעלה.
  7. שמירה על הזבוב לגמרי שקועים PBS/T, להסיר את הראש לטוס עם המלקחיים מס ' 5 ביד הדומיננטית. הוסף עצה אחת של המלקחיים הזאת מתחת לציפורן בחלל קטן סמוך החדק בצד אחד של הראש לטוס. באבטחת האחיזה על הראש על-ידי צובט המלקחיים לאחוז של העין משני הצדדים.
  8. להסיר לטוס הראש מגופו על ידי משיכת המלקחיים שני בנפרד. לחשוף את הגוף לעוף על רקמה במעבדה הממוקמים בקרבת מקום. תחזיק את הלחץ על המלחציים דומיננטה-יד כך הראש לטוס אינו אבוד.
  9. עצה אחת עמדה של המלקחיים מס ' 3 בשאינם-הדומיננטי יד באותו מרחב קטן מתחת לציפורן בצד השני של החדק. ברגע באופן מוחלט, צבוט המלחציים לתפוס את העיניים באותו מיקום משני הצדדים של הראש.
  10. לאחר אחיזה הקוטיקולה הוא מאובטח, משוך בעדינות המלקחיים בנפרד ב- 180°. פעולה זו יקרע את הקוטיקולה ראש ללא נזק למוח. השאריות לציפורן להשליך על רקמה במעבדה.
    1. למרות אידיאלי, הקוטיקולה ראש לא מלא הוסרה בשלב אחד. במקרה זה, להסיר את הקוטיקולה--בחתיכות עד המוח נחשף במלואו. הקפידו לא נזק למוח על ידי הימנעות ממגע ישיר עם המלקחיים.
  11. מסירים את המוח גזור מן ה-PBS/T על-ידי גרירה משאפל קנה הנשימה המצורף, או כ רפה בעברית המוח לחלל שבין קצות המלקחיים על ידי נימיות.
    הערה: הסרת קנה הנשימה הוא אופציונלי, כפי שהוא נוטה לא יטשטשו האונות antennal על המשטח הקדמי של המוח שבו אנחנו בדרך כלל תמונה. עם זאת, אם קנה הנשימה להפריע הדמיה, להסיר אותם בקפידה כך המוח אינו פגום על-ידי מניפולציה זו.
  12. להעביר את המוח לעוף לתוך אחד הצינורות microcentrifuge המכיל מקבע פתרון על קרח. ודא כי המוח לניתוק של המלקחיים בתוך הפתרון מקבע.
  13. לאחר כל המוח צריך להיות גזור, מעמיד אותם בפני "קצר-תיקון" על ידי הנחת הצינורות סגור על nutator עבור ~ 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    הערה: שלב קיבוע קצר זה מבטיחה השכל קלות יותר לטפל בצעדים העוקבים אינן מתיישבות צידי הצינור microcentrifuge.
  14. להסיר את הרוב המכריע של הפתרון לשבועיים עם פיפטה P1000 וזורקים אותו.
    1. הימנע כ רפה בעברית המוח מהצינור במהלך זה, בכל שלב לאחר מכן לשטוף. הגדר את P1000 לאמצעי אחסון נמוכה יותר (למשל, 650 µL) ולהסיר את תגובת שיקוע בשני שלבים. בנוסף, להחזיק הצינורות microcentrifuge בקנה אחד עם מקור אור (למשל אורות תקורה) תוך כ רפה בעברית משופרת של המוח.
  15. להוסיף 1 מ"ל של PBS טריים/T המוח. לשטוף במהירות (< 1 דקות) בחושך, וארוקן את תגובת שיקוע של המוח, ולמחוק.
  16. לחזור על השטיפה עם PBS/T בחושך בטמפרטורת החדר בהתאם ללוח הזמנים הבא: 2 מהיר (< 1 דקות) שוטף, 1 X 5 דקות, 3 X 20 דקות, ו 1 X 1 h לשטוף. להבטיח מקסימום על צינורות microcentrifuge ומניחים הצינורות על nutator בין שוטף.
    1. אם דאפי מכתים רצוי, החלף לשטוף את h 1 הסופי עם הדגירה 1 X 30 דקות עם 250 ננוגרם למ"ל דאפי מדולל ב- PBS/T, ואחריו 2 X מהירה ו- 1 X 20 דקות שוטף.
  17. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את הרוב המכריע של שטיפת מאגר תגובת שיקוע, דואגת שלא להפריע את השכל, ומוסיפים µL 30 של ריאגנט antifade מבוססי גליצרול המוח. דגירה ב 4 ° C בחושך ללא תנועה במשך לפחות שעה עד 24 שעות.

3. שינויים בסעיף 2 שכל מבוגר Immunostaining

הערה: השתמש בפרוטוקול זה עבור הדמיה חלבונים שאינם-פלורסנט או חלבון פלואורסצנטי fusions עם פלורסצנטיות חלש.

  1. להגביר את הריכוז של טריטון X-100 ב- PBS/T על ידי 10-fold (PBS + 0.3% טריטון X-100) על כל צעד. הדבר מבטיח מספיק סבון מתנה permeabilize קרום התא ולאפשר נוגדנים לגשת מקומות תאיים.
  2. לתקן את המוח ב- 4% מחברים ב- PBS/T עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר ביצוע כל מנקי, דגירה המוח במאגר טריות חסימה (PBS/T + סרום עז רגילה 5% (הגדרות)) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  4. להסיר ולמחוק את המאגר חסימה. להוסיף 0.5 מ של נוגדן ראשוני פתרון למחזור שהכין כמו תערובת בסיס דילול העיקרי נוגדנים המתאימים במאגר חסימה טריים (ראו טבלה של חומרים נוגדנים הנפוצות ואת דילולים). דגירה המוח נוגדנים העיקרי על nutator לפחות 24 שעות ב 4 ° C בחושך.
  5. להסיר הפתרון נוגדן ראשוני של המוח באמצעות של P1000 ושריין בשפופרת טריים. להוסיף 1 מ"ל של PBS/T כדי לשטוף את המוח.
    הערה: הפתרון שמורות נוגדן ראשוני ניתן לאחסן ב 4 ° C עד ארבעה שבועות. לנו יש בהצלחה ממוחזר נוגדנים העיקרי עד פעמיים בניסויים הבאים.
  6. לשטוף את המוח במהירות (< 1דקות.) ב- PBS/T, וארוקן את תגובת שיקוע של המוח, ולמחוק. חזור על שטיפה מהירה זו פעם נוספת.
  7. המשך כביסה עם 1 מ"ל PBS/T בטמפרטורת החדר בהתאם ללוח הזמנים הבא: 1 X 5 דקות, 3 X 20 min ו- h 1 X 1 לשטוף. להבטיח מקסימום על צינורות microcentrifuge ומניחים הצינורות על nutator במהלך שוטף.
  8. לאחר השטיפה האחרונה להסיר את רוב תגובת שיקוע PBS/T ולהוסיף 0.5 מ של פתרון משני נוגדנים מוכנים כמו שילוב ראשיים על ידי דילול נוגדנים המתאימים במאגר חסימה טריים (ראו טבלה של חומרים נפוצים נוגדנים ו דילולים). דגירה המוח נוגדנים משניים עבור 24 שעות ב 4 ° C בחושך.
  9. חזור על שלבים שטיפת בשלבים 3.5, 3.6 ו- 3.7 לאחר דגירה עם נוגדנים משניים.
  10. לאחר השטיפה הסופית להסיר את הרוב המכריע של המאגר שטיפת ולוודא כי כל המוח ממוקמים בחלק התחתון של הצינור. להוסיף 30 ריאגנט antifade µL השכל. דגירה ב 4 ° C בחושך ללא תנועה במשך 16-24 שעות.

4. כל המוח הרכבה

  1. במקום בשקופית מיקרוסקופ זכוכית תחת מיקרוסקופ ויבתר בעלת תווית עם פרטים מזהים.
    הערה: לחלופין, המוח יכול להיות מותקן ישירות על גבי זכוכית מכסה כדי לגשת בשני הצדדים של המוח במהלך דימות. פרוטוקול המתאר הליך הרכבה כבר שפורסמו בעבר45.
  2. הסר את השכל כל שפופרת microcentrifuge באמצעות טיפ pipet קהות (שהוכנו באמצעות סכין גילוח להסרת התחתון ~ 1 ס מ טיפ µL 1-200) ולהעבירם למרכז השקופית. להעביר כמה ריאגנט antifade קטנה עם המוח ככל האפשר.
  3. השתמש מלקחיים למיקום המוח הכיוון הרצוי (למשל, הגבי מצביע לכיוון הפסגה של השקופית ושל השטח הקדמי פונה כלפי מעלה הדמיה האונה antennal). כאשר המכוונת את השכל, שקול את נתיב האור במיקרוסקופ כדי לשמש עבור הדמיה אותם.
  4. להסיר עודפי ריאגנט antifade השקופית באמצעות הפינה המחודד של רקמה במעבדה מקופל מבלי להפריע את השכל. תחליק את לשבת ~ 5-10 דקות בחושך כדי לאפשר את השכל לדבוק השקופית.
  5. להקיף את השכל לטוס עם ארבע חתיכות קטנות של שברי זכוכית מכסה להציב בכל צד של המוח את הטופס ריבוע זה ~ 19 מ מ x 19 מ"מ. מניחים קצה אחד של זכוכית מכסה 22 מ"מ x 22 מ"מ מס 1.5 מחוץ לאחד אלה חתיכות קטנות של זכוכית , והורד בעדינות את coverslip מעל המוח כדי להשלים את הגשר-הר.
  6. לאט לאט מדבקות/ברקודים ריאגנט antifade טריים כדי למלא את השטח מתחת coverslip, נזהר שלא להפריע את coverslip או את השכל. . תנגב את כל antifade עודף באמצעות הפינה המחודד של רקמה מקופלת מעבדה ללא פנייה ישירות את coverslip.
  7. להוסיף טיפה של לק ברור, יבוש מהיר לכל אחד בארבע פינות coverslip. אפשר להתייבש במשך ~ 10 דקות. לאחר מכן, חותם ארבעת הקצוות של coverslip עם לק כדי להקיף את השכל לגמרי.
  8. תמונת מוח באופן מיידי, או לאחסן ב 4 ° C עד מוכן.
    1. אם הדמיה פלורסצנטיות מהותי מן Htt-פלורסנט חלבון fusions, תמונה המוח בתוך 24 שעות ביממה עבור האות הטוב ביותר.

5. הדמיה וכימות פריון כמו שידור של אגרגטים

  1. תמונה שנטענה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 40 X או 60/63 X שמן המטרה לאסוף z-פרוסה תמונות דרך האזור של המוח שבו מנהלי ההתקנים שנבחרו Gal4 ו ליטראות באים לידי ביטוי (איור 2א, ב').
    1. לרגש את חלבון פלואורסצנטי fusions או חלבונים immunolabeled באמצעות לייזרים המתאים (למשל, 488 ננומטר עבור nm GFP/YFP/FITC או 552 עבור mCherry/Cy3). הגדר את windows זיהוי זה לכידת פלורסנט המרבי אות תוך צמצום ערוץ צולבות לדבר באמצעות מערכת זיהוי ספקטרלי גם או הלהקה ארוכה לעבור פליטה מסננים ספציפיים עבור כל fluorophore.
      הערה: להיות קשוב כאשר הדמיה אגרגטים חלבון. קל הפיקסלים במרכז כל צבירה כדי להפוך רווי, בפרט אגרגטים גדולים יותר. לנסות למזער רוויה בתמונה, אבל להיות מודע הסיכון של אובדן אות קטן צבורים זנים (איור 2B, C, D). מדי רווית יגדל תמונת הרקע, וכך קשה יותר לזהות puncta מבודדים. בדיקת הגדרות הדמיה שונות כדי למטב לפני לקיחת תמונות הסופי של כל ערכת נתונים.
  2. לנתח את הנתונים על-ידי לכימות puncta בודדים או באופן ידני על-ידי העברת דרך z-פרוסות בודדות (למשל, איור 2C ואיור 4א) או לאחר עיבוד הפרוסות קונאפוקלית 3 ממדים (איור 3 A, B).
    הערה: ניתן לבצע זאת ב J תמונה או תמונה אחרת בתוכנת עיבוד.
    1. אם מצרפי מופרדים היטב ויש רקע מינימלי פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה ניתוח התמונה באופן שיטתי לזהות, לכמת, ולנתח מצרפי ברורים "אובייקטים" או "משטחים" בשחזור תלת-ממד של (המחסנית קונפוקלי איור 3 B).
      הערה: התוכנה הפעולות המתוארות הן ספציפיות מכשיר, תוכנה המשמש כאן (ראה את הטבלה של חומרים).
      1. דמיינו סידרה z קונאפוקלית במצב צפייה תלת-ממד. השתמש באשף "ניתוח" כדי לזהות מקומות בודדים בערוץ הנבחר (למשל הערוץ האדום עבור HttQ91-mCherry אגרגטים באיור3). התאם את סף ומסננים לייצג באופן מדויק אגרגטים בגודל heterogeneously כל אובייקטים בודדים בתמונה.
      2. לאפשר "פיצול אובייקטים" תחת "בינארי עיבוד קדם מסנן" כדי להפריד בין אגרגטים הקשורים קשר הדוק הממוזגות aberrantly על ידי האלגוריתם תוכנה. שימו לב כי המספר הכולל של אובייקטים ומדידות המשויך שלהם הוא דיווח תחת "מדידות".
        הערה: שיטה זו לכימות תנועת אגרגטים Htt מוטציה היא לא נוטה פרוטוקול immunostaining כי המרכז של אגרגטים עמילואיד, בלתי חדירה כדי נוגדנים. כתוצאה מכך, מצרפי מופיעות על המיקרוסקופ כמבני טבעתי, התמונה ניתוח תוכנה אינו מסוגל לזהות ולהבחין במדויק אלה בודדים "כתמים".
    2. לכמת פראי-סוג Htt אגרגטים מאת ידנית עוברים דרך z-המחסנית וניקוד פראי-סוג Htt אגרגטים, מוודא אין אגרגטים כפול-ציון אם הם מופיעים יותר מפעם אחת פרוסה (איור 4א).
      הערה: גישה זו כימות ידני יכול לשמש כאשר המספר של אגרגטים כל ערימה קונאפוקלית סבירה (לדוגמא, 20-50). הוא גם מועיל כאשר התמונה ניתוח תוכנה לא יכול להבחין puncta בודדים לבין האות שמסביב אותו ערוץ (למשל, אות ' מאטום לשקוף ' Htt פראי-סוג בתאים הסמוכים) (איור 2B, C ואיור 4 A)-לכימות פראי-סוג Htt אגרגטים יכול גם להיות מאתגר כי מבנים נורמליים רבים במוח מופיעות punctate (למשל, תהליכי התא ואת הסינפסות). שיתוף לוקליזציה של אותות Htt פראי-סוג של מוטציה יכול לשמש כקריטריון הבחירה; עם זאת, ייתכן Htt מוטציה "זרעים" ליפול מתחת לגבול של זיהוי קונפוקלי. חלבון שאינו Htt זה ולא צבורים בתאים הנמען (למשל, ה-GFP) יכול לשמש כדי להדביק תווית לא קשורים punctate מבנים במוח.
  3. להשתמש התמונה ניתוח תוכנה לביצוע נוספות אפיון של אגרגטים בודדים. לדוגמה, לקבוע את התפלגות גודל של מצרפי (איור 3C), אחוז לוקליזציה שיתוף בין מוטציה פראי-סוג Htt חלבונים (איור 4א), או ישירות למדוד באמצעות קשת/קשתית (אינטראקציות חלבון-חלבון איור 4 B).
    1. לקבוע את התפלגות גודל של puncta בודדים באמצעות אלגוריתם זיהוי ספוט או משטח שמזהה באופן מדויק כל הגלויות צבירות ערוץ מסוים. להשתמש בתוכנה ניתוח התמונה כדי לקחת מידות הרלוונטיים של כתמים או משטחים, להשיג לדוגמה 'קוטר צבירה' '(איור 3 ג'), 'עוצמה' או 'עוצמה' מידע 'מידות' באשף "ניתוח" התוכנה שמתואר בשלב 5.2.1.
      הערה: איור 3C, אנחנו מדווחים ההתפלגות של קטרים עבור כל puncta HttQ91-mCherry שזוהתה של פקעית DA1 יחיד.
    2. לקבוע אחוז לוקליזציה שיתוף בין HttQ25-YFP אגרגטים HttQ91-mCherry על-ידי הזזת ידנית הפרוסה על ידי-פרוסות דרך קונאפוקלית z-ערימה (השיטה המדויקת ביותר). עם זאת, הקפידו לא לספור כל אגרגטים פעמיים. כדי למנוע זאת, רק לספור אגרגטים בפרוסה-z מסוים אם המטוס של המוקד הוא דרך מרכז הצבירה (איור 4א).
    3. חישוב יעילות סריג למצרפי HttQ25-YFP המושרה עם אות HttQ91-mCherry colocalized באמצעות שיטת photobleaching מקבל.
      1. ראשית, לחסל את פוטנציאל צולבות לדבר בין YFP וערוצי mCherry על-ידי יצירת זיהוי windows עבור אותות mCherry בלבד ולא YFP בלבד המייצרים אין אות בערוץ השני. באמצעות הגדרות אלה, קח 'לפני 'תמונה של puncta HttQ25-YFP בודדים, האות המשויכת שלהם HttQ91-mCherry ( איור 4B).
      2. לאחר מכן, photobleach mCherry לאותת על-ידי התאמת לייזר אדום (למשל, 552 ננומטר) ועד 100% עוצמת סריקה עד האות נעלם. לחזור להגדרות המשמש את 'לפני 'תמונה, ולקחת 'תמונה אחרי' של puncta זהה (איור 4B).
      3. חישוב מידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור כל punctum לפני ואחרי photobleaching באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.
      4. לחשב סריג יעילות על-ידי חיסור YFP התורם קרינה פלואורסצנטית נמדד 'לפני 'תמונה (YFPהראשונית) של קרינה פלואורסצנטית התורם YFP בתמונה' אחרי' (YFPהסופי). לחלק ערך זה על-ידי YFPהסופי, להכפיל ב- 100.
        הערה: סריג יעילות יכול להיות מחושב על ידי פיקסל פיקסל או הכוללת כל שצבירה HttQ25-YFP (איור 4B). מקבל photobleaching היא טכניקה שימושית במיוחד לצורך חישוב יעילות סריג כאשר האות mCherry המשויך לכל punctum HttQ25-YFP זה יהיה גבוה מספיק כדי לייצר YFP לזיהוי dequenching אחרי mCherry photobleaching.

תוצאות

השיטות המתוארות כאן להפיק נתונים להדגים פריון, כמו העברה של אגרגטים חלבון Htt מאוכלוסיה תא אחד למשנהו בתוך הזבוב ללא פגע CNS. המרה של Htt פראי-סוג של ' מאטום לשקוף ' punctate הוא ציין על-ידי קרינה פלואורסצנטית ישירה של חלבון כימרי זה YFP עכשיו, הנמען דונלד כתוצאה HttQ91-mCherry ביטוי ORNs התור...

Discussion

המספרים של חולים הסובלים ממחלות ניווניות ממשיך לגדול, יש צורך דחוף להגדיל את ההבנה של פתוגנזה מולקולריים של מחלות אלו כך ניתן לפתח טיפולים טובים יותר. כאן, אנו מתארים שיטות המאפשרות לניטור פריון כמו שידור של אגרגטים חלבון פתוגניים בין סוגי תאים שונים באורגניזם מודל, melanogaster דרוזופילה....

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים חברים של מעבדות Kopito לואו, פירס דיונים מועילים רבים במהלך פיתוח שיטות אלה. אנו מודים גם בריאן Temsamrit לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאוניברסיטת למדעים ונאמנויות צדקה של וו. סמית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4ThermoFisher ScientificAM9625Dilute to 1X
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
KimwipesThomas Scientific2904F24
20% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filteredLampire Biological Laboratories7332500Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFPAves LabsGFP-1020Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRedClontech632496Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-BruchpilotDevelopmental Studies Hybridoma Banknc82Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chickenThermoFisher ScientificSA1-7200Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbitLife TechnologiesA11011Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibodyLife TechnologiesA21235Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade ReagentLife TechnologiesS36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)Fisher Scientific12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm)Globe Scientific1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3Ted Pella503use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5Ted Pella505use in dominant hand
LAS X image analysis softwareLeica
Imaris image analysis softwareBitplane

References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133misfolding

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved