JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש בתור פיגומים סינטזות. החל מ- L-ליזין, אנחנו יוצרים אמינו מאת לתגובה אשד אנזימטי diastereoselective C-H חמצון על ידי dioxygenase ואחריו המחשוף חומצה קרבוקסילית moiety של חומצת אמינו הידרוקסיל המתאימים ביותר על ידי שילוב decarboxylase.

Abstract

אמינו הם תרכובות רב-תכליתי עם מגוון רחב של יישומים. למשל, הם שימשו בתור פיגומים כיראלי סינטזות. סינתזה שלהם על ידי קונבנציונאלי כימיה אורגנית לעיתים קרובות דורשת תהליכי סינתזה צעד מרובת מייגע, עם קשיים בשליטה על התוצאות סטריאוכימיים. אנו מציגים פרוטוקול enzymatically synthetize אמינו כהלים החל מ- L-ליזין זמינים 48 שעות. פרוטוקול זה משלב שתי תגובות כימיות שקשה מאוד לקיים על ידי סינתזה אורגנית קונבנציונלי. בחמצון שלב regio -, diastereoselective הראשון הקשר C-H בתהליכי של פי ליזין צד-שרשרת מזורז על ידי dioxygenase; חמצון regio, diastereoselective השני על ידי dioxygenase regiodivergent יכול להוביל להיווצרות של 1, 2-diols. בשלב האחרון, קבוצה קרבוקסילית של החומצה אמינית אלפא הוא ביקע מאת pyridoxal-פוספט (פיפ) decarboxylase (DC). שלב decarboxylative זה משפיע רק על פחמן אלפא של חומצת אמינו, שמירה על המרכז stereogenic הידרוקסי שהוחלפו בעמדה ביתא גמא. לכן שטיחות מועשר של כהלים אמינו המתקבלת. הפרוטוקול הופעלה בהצלחה semipreparative-גודל סינתזה של כהלים אמינו ארבע. ניטור של התגובות נערך על-ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לאחר derivatization על ידי 1-פטור-2, 4-dinitrobenzene. טיהור פשוטה על ידי מיצוי מוצק-פאזי (SPE) אפשרה את כהלים אמינו עם תשואות מצוינות (93% ל- > 95%).

Introduction

למרות היתרונות הגלומים biocatalysis, השילוב של צעדים biocatalytic מסלולים סינטטיים או מסלולים biocatalytic הכולל בעיקר נותר מוגבל אנזימטי רזולוציות קינטי. המסלולים היה בשימוש נרחב כצעד ראשון בסינתזה אסימטרית כימותרפיה-אנזימטי, אך biocatalysis מציעה אפשרויות רבות יותר של קבוצה פונקציונלית interconversions עם סטריאוסלקטיביות גבוהה1,2,3 . יתר על כן, כפי תגובות biocatalytic מתנהלים בתנאים דומים, לכן זה ריאלי לביצוע אשד תגובות ב-4,סיר אחד אופנה5.

כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש חיל עזר בצבא הרומי או פיגומים סינתזה אורגנית6. Moiety אמינו אלכוהול נמצא לעתים קרובות מטבוליטים משניים, חומרים פעילים תרופות (API). כהלים β-אמינו הראשי זמין מחומצות אמינו α המתאימים על ידי סינתזה קונבנציונלי, אלא גישה כיראלי כהלים וγ-אמינו או כהלים אמינו משניות קרובות דורשת מייגע מסלולים סינטטיים יחד עם רגיש שליטה של ה סטריאוכימיה7,8,9,10. עקב סטריאוסלקטיביות גבוהה שלה, biocatalysis עשוי לספק נתיב סינתטי עליון אלה אבני הבניין כיראלי11,12,13,14.

בעבר דיווחנו הסינתזה של מונו - ו di-הידרוקסי-L-lysines על ידי hydroxylation אנזימטי diastereoselective על ידי dioxygenases של הברזל (II) / תלויי-α-ketoacid oxygenase המשפחה (αKAO) (איור 1)15. בפרט, dioxygenase KDO1 החל מ- L-ליזין, מזרז היווצרות של (3S) - הידרוקסי נגזרת (1), תוך כדי (4R) - נגזרת (2) נוצרת על ידי התגובה עם KDO2 dioxygenase. Regiodivergent רצופים hydroxylations על ידי KDO1 ו KDO2 להוביל להיווצרותם של (3R, 4R) - dihydroxy - L-ליזין (3) בצורה הטהורה שטיחות. עם זאת, הטווח מוגבל המצע של אנזימים אלה פוגעת שלהם ניצול גדול סינתזה, ובמיוחד hydroxylation של אמינים פשוטה, כפי moiety חומצה קרבוקסילית α-מיקום של קבוצת אמינו חיונית עבור פעילות16.

figure-introduction-2341
איור 1: Biocatalytic המרות של L-ליזין. המרה לתוך (3S) - הידרוקסי - L-ליזין (1) על ידי KDO1 dioxygenase; (4R) - הידרוקסי - L-ליזין (2) על ידי KDO2 dioxygenase; ו- (3R, 4R) - dihydroxy - L-ליזין (3) התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים מזורז במרוכז על ידי dioxygenases KDO1, KDO2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Decarboxylation היא תגובה נפוצה חילוף החומרים17. בפרט, חומצת אמינו בקרי קבוצת מחשבים (EC 4.1.1) הן ללא קופקטור (pyruvoyl תלוית) או אנזימים תלויי-פיפ, לעודד את decarboxylation של חומצות אמינו לתוך polyamines המתאים חיידקים, אורגניזמים גבוה18,19 , 20 , 21 , 22. מונו - ו dihydroxy תרכובות (איור 3) 4–7, 10–11 שיתאימו cadaverine hydroxylated, diamine ב מתקבל על ידי decarboxylation של L-ליזין. Cadaverine הוא אבן בניין מפתח עבור התעשייה הכימית, ספציפי זה הוא רכיב של פולימרים פוליאמיד, פוליאוריתן. לכן, ייצור ביולוגי המבוסס על זה diamine ב ממשאבים מתחדשים משכה תשומת לב כחלופה המסלול מבוסס נפט, מיקרואורגניזמים שונים יש מהונדס למטרה זו. אלה מסלולים מטבוליים, ליזין DC (ולוויין) הוא האנזים מפתח. ולוויין הוא אנזים תלויי-פיפ השייכים אלנין racemase (AR) מבני המשפחה23. פיפ תלוית בקרי התחום (Dc-פיפ) ידועים להיות מאוד ספציפי המצע. עם זאת, כמה אנזימים הבעלים את היכולת של הפקרות קלה, להיות פעיל לקראת חומצות אמינו L-ליזין ו- L-ornithine, כמו לדוגמה ולוויין של Selenomonas rumirantium (ולווייןSrum), אשר יש קבועים קינטי דומה עבור ליזין ו ornithine decarboxylation24,25. המצע מורחבת זו ירידה לפרטים גורם אנזים זה הוא מועמד טוב decarboxylation של מונו - ו di-הידרוקסי-L-ליזין. בנוסף, כדי למצוא DCs הפעיל לכיוון נגזרות הידרוקסיל של ליזין, בדקנו את הקשר גנומית של הגנים קידוד אנזימים αKAO. ואכן, בתוך הגנום prokaryotic הגנים קידוד אנזימים המעורבים באותו מסלול biosynthetic הוחלף נגזר בדרך כלל שיתוף מותאמים אשכולות גנים. הגן KDO2 (מתוך Chitinophaga pinensis) נמצאה שותף מקומי עם גן קידוד בשם פיפ-DC (איור 2). לעומת זאת, אין גנים קידוד עבור DC נמצאה בעת ניתוח ההקשר גנומית של dioxygenase KDO1. החלבון פיפ-DC מ ג pinensis (DCCpin) נבחר לכן כמועמד מבטיח כדי לעודד את השלב decarboxylation של התגובה בהתאם להיררכית הקשרים.

figure-introduction-5209
איור 2: הקשר גנומית של ג'ין KDO2 ב. pinensis ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כתוצאה מכך, תיכננו תגובות אנזימטיות אשד מעורבים dioxygenases ו- DCs כדי להשיג את הסינתזה של כהלים אליפטיות כיראלי β, γ-אמינו מחומצות אמינו (איור 3). כפי שדווח בעבר, חמצון C-H על ידי את αKAO מציג מרכז הידרוקסי שהוחלפו stereogenic סה כ diastereoselectivity; כיראליות Cβ / וγ יישמרו בשלב decarboxylative, אשר משפיעה רק על פחמן Cα של ה moiety של חומצת אמינו16.

figure-introduction-6015
איור 3: ניתוח Retrosynthetic. (א) Retrosynthesis של β, γ-אמינו כהלים (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) L - הידרוקסי--ליזין, ו (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) ו- 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) מ L-ליזין. Retrosynthesis (B) של β, γ - β, diols אמינו אלפא (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (10) ו- (2R, 4S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 4-diol (11) החל מ- (5R)- הידרוקסי-L-ליזין, ו- (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (7) החל מ- L-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

החל מ- L-ליזין ו שלה (5R)-הידרוקסי נגזרת, אנו בזאת לדווח על שני/שלושה שלב, סיר אחד, תהליך אנזימטי שילוב dioxygenases פיפ-DCs כדי להשיג המטרה אמינו. ראש המנזר הסינתזה את המשקל מעבדה של מולקולות יעד, השיטה פותחה את המשקל אנליטיות כדי להתאים את תנאי ריאקציה, למשל, ריכוז אנזים, נדרש כדי לאפשר המרה מלאה של חומרי המוצא; אנו מציגים את הליך זה גם כן.

Protocol

1. אנזים הכנה

  1. אקספרס ולטהר חלבונים כמו שתואר לעיל26.
    הערה: חומרים התקבלו עם ריכוז סופי הבאים: αKAO של Catenulispora acidiphila, UniProtKB מזהה: C7QJ42 (KDO1), 1.35 מ"ג/מ"ל; ΑKAO מ ג pinensis, UniProtKB מזהה: C7PLM6 (KDO2), 2.29 מ"ג/מ"ל; פיפ-DCs מ ס rumirantium, UniProtKB מזהה: O50657 (ולווייןSrum), תא חינם לחלץ עם אנזים הכולל ב 12.44 מ"ג/מ"ל; פיפ-DC מ ג pinensis, UniProtKB מזהה: C7PLM7 (DCCpin), 2.62 מ"ג/מ"ל.

2. אופן ההכנה של פתרונות

הערה: כל הפתרונות שלהלן מוכנות במים יונים.

  1. להכין 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5; התאם עם 5 מ' של NaOH.
    הערה: במהלך השלב התאמת חומציות, ללבוש כפפות מגן, ביגוד מגן, הגנה העין והגנה הפנים (P280). במקרה של מגע עם העיניים (P305, P351, P338), לשטוף בזהירות עם מים מספר דקות הסרת עדשות מגע במידת האפשר. המשך שטיפה ולקרוא באופן מיידי של מרכז רעל או רופא (P310). הקוד P מתייחס המשפט זהירות (הזארד class וקטגוריה; ראו, למשל, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
  2. להכין 100 מ מ L-ליזין, 100 מ מ (5S) - הידרוקסי - L-ליזין, חומצה α-ketoglutaric 150 מ מ, ascorbate נתרן 100 מ מ, 10 מ מ אמוניום סולפט iron(II) hexahydrate (מור מלח), 100 מ מ pyridoxal 5-פוספט (פיפ) ו 100 מ מ dithiothreitol (DTT).
  3. להכין 1 מ', 2 מ' ו- 6M של חומצת מלח (HCl) פתרון HCl 37% (שנהנתם פתרון 12 מ'), ביצוע ההוראות בטיחות אותו כמו אלו המתוארים 2.1.
    הערה: הפתרונות של α-ketoglutaric חומצה, סודיום אסקורבט אמוניום iron(II) סולפט hexahydrate חייב להיעשות טרי ביום של שימוש. הפתרון ליזין ניתן לאחסן במשך מספר חודשים בטמפרטורת החדר. הפתרון פיפ ניתן לאחסן במשך חודש-4 מעלות צלזיוס. הפתרון DTT ניתן לאחסן במשך חודש אחד ב-20 ° C.

3. אנליטית-סולם תגובות

  1. פיתוח שיטות עבור התגובה decarboxylation של (5R) - הידרוקסי - L-ליזין
    1. להוסיף µL 11 של 1 מ' פתרון של HEPES מאגר pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) כדי microtube 2 מ ל. לאחר מכן, הוסף µL 22 מ"מ (5S) L - הידרוקסי--ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 2.2 µL של 100 מ מ פיפ (ריכוז סופי 1 מ מ), ו µL 2.2 מ"מ DTT (ריכוז סופי 1 מ מ).
      הערה: במקרה של תגובה עם ולווייןSrum, התוספת של DTT הוא לא הכרחי.
    2. הוסף את פיפ-DC מטוהרים (הריכוז הסופי 0.1 מ"ג/מ"ל). להשלים עם H2O עבור נפח סופי של 220 µL.
    3. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
      הערה: לנער את התערובת התגובה עם מכסה פתוח באוויר הפתוח מבטיח של חמצון טוב של התקשורת התגובה. לכן לא צורך בועה חמצן בתקשורת התגובה.
    4. לאסוף 10 µL של תערובת התגובה כדי להיות מנותח על פי הנוהל ניטור התגובה שמתואר בשלב 6. הדגימות רצוי derivatized, ניתח ישירות לאחר הדגימה.
  2. פיתוח שיטות עבור התגובה אשד אנזימטי שילוב צעד hydroxylation מזורז על ידי αKAO עם decarboxylation על ידי פיפ-DC
    1. להוסיף µL 11 של 1 מ' של HEPES מאגר pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) כדי microtube 2 מ ל. לאחר מכן, הוסף µL 22 של 150 מ מ של α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 5.5 µL של 100 מ מ של סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 22 µL 10 מ מ של מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ מ), ו- µL 22 מ"מ של L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ).
    2. להשלים עם H2O עבור נפח סופי של 220 µL, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 3.2.3.
    3. להוסיף את האנזים αKAO מטוהרים הנדרש לפי רגיוסלקטיביות יישוב: KDO1 על hydroxylation במצב C-3 או KDO2 תפקיד C-4 של L-ליזין. הריכוז הסופי של האנזים מטוהרים (0.05-0.5 mg/mL) היה נחוש לאפשר המרה מלאה ב שנהנתם 3 h.
    4. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
    5. להוסיף µL 2.2 מ"מ של פיפ (הריכוז הסופי ~ 1 מ מ) ו- µL 2.2 מ"מ של DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ"מ).
      הערה: במקרה של תגובה עם ולווייןSrum, התוספת של DTT הוא לא הכרחי.
    6. להוסיף פיפ-DC מטוהרים בריכוז מאפשר המרה מלאה ב- 18 ח': ולווייןSrum -הריכוז הסופי המשוער של 0.1 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO1, DCCpin -הריכוז הסופי המשוער של 0.5 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO2.
    7. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח-300 סל ד עבור 18 h.
    8. להפעיל שגרת ניטור כמו שלב 3.1.4.
  3. פיתוח שיטות עבור התגובה אשד אנזימטי המשלב שני צעדים hydroxylation מזורז על ידי αKAOs עם decarboxylation על ידי פיפ-DC
    1. להפעיל צעדים 3.2.1-3.2.2.
    2. להוסיף KDO1 ריכוז סופי של 0.05 מ"ג/מ"ל. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
    3. להוסיף KDO2 הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד עבור 18 h.
    4. הפעל את שלב 3.2.5.
    5. להוסיף את פיפ-DC DC מטוהריםCpin הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד עבור 18 h.
    6. הפעל את השגרה ניטור כמו שלב 3.1.4.

4. חצי מפוח סיר אחד התגובה Biocatalytic

הערה: תגובות אנזימטיות מתבצעות על 0.1 mmol של L-ליזין בכוס באוויר הפתוח 250 מ ל הבקבוק Erlenmeyer עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל.

  1. סינתזה של המעו ף monohydroxylated
    1. להוסיף 0.5 מ ל 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) הבקבוקון. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של 100 מ מ L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ).
    2. להשלים עם H2O עבור נפח סופי של 10 מ"ל, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 4.1.3.
    3. להוסיף את האנזים αKAO מטוהרים הנדרש לפי רגיוסלקטיביות יישוב: KDO1 על ריכוז סופי של 0.075 ק מ"ג/מ"ל עבור hydroxylation במצב C-3 או KDO2-ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל תפקיד C-4 של L-ליזין. ריכוז האנזים מטוהרים הסופי נקבע כדי לאפשר המרה מלאה ב שנהנתם 3 h.
    4. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד למשך פרק הזמן המתאים. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה hydroxylation הושלמה (להפעיל את כל השלבים מפורטים בשלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.1.5. זמן תגובה אופייני הוא 3 שעות.
    5. להוסיף תערובת התגובה αKAO µL 100 מ"מ פיפ (ריכוז סופי ~ 1 מ"מ). לאחר מכן, הוסף µL 100 מ"מ DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ מ), למעט בעת שימוש ולווייןSrum.
    6. להוסיף פיפ מטוהרים-DC: ולווייןSrum ב הריכוז הסופי המשוער של 0.05 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO1 או DCCpin -הריכוז הסופי המשוער של 0.5 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO2.
    7. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, 300 סל ד, עבור 18 h ולהמשיך ישירות אל השלבים מפורטים בשלב 4.3.
  2. סינתזה של הנגזרת dihydroxylated
    1. להוסיף 0.5 מ ל 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ), 1 מ"ל של 100 מ מ L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ) , 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ). להשלים עם H2O עבור נפח סופי של 10 מ"ל, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 4.2.2.
    2. להוסיף KDO1 ריכוז סופי של 0.075 ק מ"ג/מ"ל. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, 300 סל ד למשך פרק הזמן המתאים.
    3. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה hydroxylation הושלמה (ראה שלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.2.5. זמן תגובה אופייני הוא 3 שעות.
    4. להוסיף 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ).
    5. להוסיף KDO2 הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד עבור 18 h.
    6. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה dihydroxylation הושלמה (ראה שלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.2.7. זמן תגובה אופייני הוא 18 h.
    7. להוסיף 100 µL 100 מ מ של DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ מ), למעט בעת שימוש ולוויין אתSrum.
    8. להוסיף את DC מטוהריםCpin הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית.
    9. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד עבור 18 h.
  3. מרווה
    1. לקרר את תערובת התגובה על ידי הצבת הזכוכית 250 מ ל Erlenmeyer הבקבוק באמבט קרח.
    2. להוסיף בזהירות, מעל שנהנתם 1 דקות, 0.25 mL של HCl M 6 ע י ניעור באופן ידני בעדינות את תערובת התגובה מקורר. פעל לפי הוראות הבטיחות אותו כמו אלה שתוארו בשלב 2.1.
    3. להעביר התערובת חומצי לתוך צנטריפוגה חרוט למטה 50 מ ל צינור באמצעות כוס פסטר פיפטה מצויד עם נורת, ואז צנטריפוגה-1,680 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    4. למשוך את תגובת שיקוע ולשמור בצד בבקבוקון סיבוב המדרגה 250 מ.
    5. להוסיף 10 מ ל מים יונים ברכבת התחתית התחתונה חרוט צנטריפוגה המכיל בגדר. מערבולת להשעות מחדש בגדר.
    6. צנטריפוגה ב g 1,680 x, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות.
    7. למשוך את תגובת שיקוע והוסף אותו אל הבקבוק העגול-התחתון 250 מ ל המכיל את תגובת שיקוע הראשון (שלב 4.3.4).
    8. להקפיא את supernatants שנאספו על ידי טבילה + בקבוקי שתייה צידניות לתוך חנקן נוזלי ביד קבוע, מתערבל, להעביר מיד את הבקבוקון יריעה benchtop מייבש ההקפאה כדי למנוע את החומר מפשיר.
    9. בתום התהליך להקפיא ייבוש (לילה), הסר את הבקבוק. את המייבש ההקפאה.

5. טיהור של כהלים אמינו מן תערובת התגובה אנזימטי גולמי

  1. שרף חילוף יונים
    1. להמיס את המוצר הליחה הכמות המינימלית של מימית 0.1 M של HCl (שנהנתם 4 מ"ל) עד חלקיקים מוצקים כבר אינם גלויים לעין-עירומה.
    2. תנאי sulfonic חומצה קבוצה פונקציונלית קטיון שרף, רשת 200-400, בעמודה זכוכית (20 x 250 מ מ) על ידי eluting בלחץ אטמוספירי מ' 1 HCl (עמודה 4 כרכים) ואחריו 0.1 M HCl (4 כרכים עמודה; טור אמצעי = 10 מ ל).
    3. לטעון את המדגם בקפידה בחלק העליון של השרף על הקירות של העמודה זכוכית באמצעות micropipette 1,000 µL. לאחר מכן, לשטוף ברכבת התחתית התחתונה חרוט צנטריפוגה שהכיל את המוצר הגולמי שלוש פעמים עם 1 מ ל 0.1 M של HCl תמיסה מימית לכל לשטוף, לטעון את אמצעי האחסון שטיפה הנוצרת על גבי העמודה באותה דרך.
    4. Elute עם שאינו ליניארי הדרגתיות: 4 כרכים עמודה של 0.1 M HCl, 4 כרכים עמודה של מים, 4 כרכים עמודה של 5% NH4הו, 4 כרכים עמודה של 10% NH4הו, 4 כרכים עמודה של 15% או NH-4, 4 כרכים עמודה של 20% NH4או , 4 כרכים עמודה של 25% NH4הו ו לבסוף 4 כרכים עמודה של 28% NH4הו.
    5. לפקח על הטיהור באמצעות HPLC (ראה שלב 6).
    6. בריכה שברים המכיל את המתחם (NH4או 20-28%) ולהקפיא כפי שמתואר שלבים 4.3.8-4.3.9.
      הערה: העמודה יונים חוזר לאחר • תנאי עם מים יונים כדי ניטרול • תנאי מים (שנהנתם 50 מ"ל) ואחריו שפוץ מאת eluting עם 50 מ של 1 מ' של HCl.
  2. SPE
    1. Solubilize את מתחם הליחה שנהנתם 2 מ ל H-3פו-4-/water (20 µL/mL).
    2. המקום מצב מעורב קטיון SPE 6 מ"ל-מחסנית יריעה החילוץ מחוברת משאבה מים. מצב המחסנית על-ידי ציור דרך 4 מ"ל של מתנול תחת לחץ מופחת שמספק את יריעה. Equilibrate הדיו על ידי ציור דרך 4 מיליליטר H3פו4/water (20 µL/mL).
    3. לטעון את הדגימה אל מיכל הדיו באמצעות micropipette µL 1,000 בחלק העליון של השרף על הקירות של העמודה זכוכית, ולשטוף את המבחנה המכילה את המוצר שלוש פעמים עם 0.75 מ ל H3פו4/water (20 µL/mL) לכל לשטוף. לטעון את אמצעי האחסון שטיפה הנוצרת על גבי העמודה באותה דרך.
    4. לשטוף את המחסנית על-ידי eluting תחת לחץ מופחת, שמספק את סעפת, מ 4 ל 2% HCOOH במים, ואז עם 4 מ ל מים. Elute במילוי הדרגתי של NH4או במים (4 מ עבור כל • תנאי, החל מ- 4% NH4או: 10%, 15%, 15%, 20% ו- 28%).
    5. לפקח על הטיהור באמצעות HPLC על-ידי ניתוח כל שבר על פי התגובה ניטור פרוטוקול המתואר בשלב 6. לשמור כל השברים המכיל טהור הרצויים נגזרת לפי אולטרה סגול (UV) chromatogram והמשך לשלב 5.2.6.
    6. בריכת שברים המכיל את הרצוי מורכבים לתוך 100 מ ל סביב הבקבוק. התחתון, לשטוף את הצינורות המכילים השברים עם מים, ולהוסיף האחסון שטיפה 100 mL עגול בתחתית הבקבוק.
    7. הסר את הממס תחת לחץ מופחת באמצעות המאדה מאובזר עם קומקום אמבט מים תרמוסטט ב 40 מעלות צלזיוס ומחובר משאבת ואקום שוכן בגובה 10 mbar.
    8. Solubilize המוצק באמצעי אחסון מינימלי של מים ולהעביר את הפתרון לתוך 25 מ ל שנשקל עגול בתחתית הבקבוק. לשטוף את הבקבוק עם נפח מינימלי של מים, להוסיף אמצעי האחסון יש לשטוף הבקבוקון 25 מ ל, והמשך לשלב 5.2.9.
    9. שוקל את המוצר מטוהרים, לחשב את התשואה.
    10. להמיס את המוצר מטוהרים בהיקף מינימלי של 2 מ' של HCl עד חלקיקים מוצקים כבר אינם גלויים לעין-העירום ולהקפיא כפי שמתואר שלבים 4.3.8-4.3.9.
      הערה: כהלים אמינו הם תרכובות רגיש, נשמרים מלחי הידרוכלוריד שלהם.

6. תגובה ניטור וניתוח המוצר

  1. Derivatization של מצעים ומוצרי לפני ניתוח HPLC
    הערה: מצעים, מוצרי צריכה להיות derivatized כמו נגזרות ארומטי להגדיל detectivity כרומטוגרפי שלהם UV. השתמשנו 1-פטור-2, 4-dinitrobenzene (DNFB). כל מדגם היה מוזרק HPLC מיד לאחר derivatization.
    1. לקחת 10 µL של התגובה אנזימטיות, העברה 1.5 mL microtube. להוסיף 10 µL של 0.25 M של תמיסה מימית של3 NaHCO 100 µL של אתנול, 30 µL של 2.5 מ"ג/מ"ל של פתרון DNFB אתנול.
    2. לסגור את microtube ומנערים הפתרון שיתקבל עבור 1 h-65 ° C, ב- 1000 סל ד. כיבוי עם 10 µL 1 מ' של HCl.
    3. לסנן מעל 4 מ מ קוטר מסנן שאינו סטרילי מזרק עם מיקרומטר 0.22 נקבובית גודל polyvinylidene הידרופיליות פלואוריד (PVDF) קרום באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל.
  2. לבצע ניטור של התגובה dioxygenase באמצעות כל מערכת מסוגל להפריד derivatized חומצות אמינו. פרוטוקול זה כרוך UV זיהוי של חומצות אמינו derivatized על ידי קבוצה כרומופור27dinitrobenzene (DNB).
    1. מתאים את HPLC עם סי18 חיבור פוטוני endcapping שלב הפוכה עמודה (5 מיקרומטר, 3 x 150 מ מ).
    2. Equilibrate את העמודה סי18 עם eluent (30:70) B (MeCN + 0.1% TFA) כדי eluent A (H2O + 0.1% TFA) בספיקה של 1 mL/min ו- 35 º C למשך 15 דקות (תואם לאמצעי אחסון עמודה שנהנתם 20).
    3. מזריקים µL 10 של תערובת התגובה derivatized (ראה שלב 6.1) אל העמודה סי18 HPLC. משתמשים בתערובת של MeCN, 0.1% TFA/H2O ו- 0.1% TFA כמו eluent עם מעבר צבע ליניארי (יחס 30:70 כדי 70:30 ב 9 דקות, 35 ° C, טמפרטורה זרימה 1 mL/min).
    4. השתמש בזיהוי UV שוכן בגובה 400 nm לנתח את המוצרים eluted על העמודה כרומטוגרפי. DNB-ליזין elutes בדרך כלל בסביבות 6.5 דקות DNB hydroxylated-בסביבות 5.5 דקות ליזין, dihydroxylated DNB-ליזין בסביבות 4.2 min, DNB-aminodiol בסביבות 5.3 min.

7. NMR ניתוח של כהלים אמינו מטוהרים

  1. להמיס מטוהרים כהלים אמינו D2O (700 µL) ולהעביר את הפתרון ל צינור תהודה מגנטית גרעינית (NMR).
  2. רוכשים 1H ו- 13ספקטרום C NMR לפי המתאים NMR מתקן פרוטוקולים28.

תוצאות

בעבר דיווחנו הסינתזה של מונו - ו di-הידרוקסי-L-lysines על ידי hydroxylation אנזימטי diastereoselective על ידי dioxygenases של הברזל (II) / αKAO המשפחה (איור 1)16. כדי למטב את הפרוטוקול של המפלים כולו המובאים כאן, המשלבים צעדים hydroxylation אחד או שניים על ידי αKAO ואחריו צעד decarboxylation ?...

Discussion

כהלים אמינו כיראלי ונגזרות יש מגוון רחב של יישומים, כיראלי חיל עזר בצבא הרומי של סינתזה אורגנית לטיפול התרופות. סינתזה שקודמים לייצור אמינו על ידי סינתזה אורגנית קונבנציונליים רבים, אך שלא תמיד יהיה יעיל בשל הצעדים מייגע הגנה/deprotection יחד עם פקד רגיש של ה סטריאוכימיה16. בגישה bioca...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה ורוניק דה Berardinis לדיון פורה, פרט Alain, כריסטין Pellé, פגי Sirvain לקבלת תמיכה טכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESSigma AldrichH3375
L-lysine hydrochlorideSigma AldrichL5626
(5S)-hydroxy-L-lysineSigma AldrichGPS NONHOut sourcing
α-ketoglutaric acidSigma Aldrich75892
Sodium ascorbateSigma AldrichA7631
Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrateAcros201370250
Pyridoxal phosphate (PLP)Sigma Aldrich82870
3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)Sigma AldrichD0632
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)Sigma AldrichD1529
EthanolVWR20825.290
Sodium hydrogen carbonateSigma Aldrich71631
HCl 37%Sigma Aldrich435570
HCl 0.1MFluka35335
Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MSVWR83640.320
2,2,2-trifluoroacetic acidVWR153112E
Ammonia 28%VWR21182.294
Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MSVWR83638.32
Formic acidAcros270480010
Phosphoric acid 85%Acros201145000
Deuterium oxideAcros320,710,075
NaOHSigma AldrichS5881
C18 HPLC columnPhenomenex00F-4601-Y0
Accela UHPLC SystemThermoFisher Scientific
Accela PDA detectorThermoFisher Scientific
4mm syringe filters - 0,22µm - PVDFMerckSLGVR04NL
Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tipVWRHSWA5010.200V0
Cation exchange resin 100-200 meshSigma Aldrich217506
Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mLWaters186000776
Extraction manifoldWatersWAT200609
Rotary evaporatorBüchi531-0103
Lyophilizer alpha 1-2 LDplusChristL083302
Micropipette 20 µLEppendorf3121000031
Micropipette 100 µLEppendorf3121000074
Micropipette 500 µLEppendorf3121000112
Micropipette 1000 µLEppendorf3121000120
300 MHz spectrometerBruker
2 mL microtubeCLEARLineCL20.002.0500
50 mL conical-bottom centrifuge tubeFischer Scientific05-539-8
25 mL round-bottom flask 14/23Fischer Scientific10353331
100 mL round-bottom flask 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL round-bottom flask 29/32Fischer Scientific11786183
250 mL erlenmeyer flaskFischerbrand15496143

References

  1. Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
  2. Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  3. Turner, N. J., O'Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
  4. Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
  5. Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
  6. Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
  7. Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
  8. McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
  9. Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
  10. Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
  11. Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
  12. Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
  13. Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
  14. Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).
  15. Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
  16. Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
  17. Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. Ch. 4. Polyamines. 4, 47-59 (2015).
  18. Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
  19. Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
  20. Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
  21. Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
  22. Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
  23. Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
  24. Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
  25. Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
  26. Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
  27. Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
  28. . Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017)
  29. Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
  30. Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
  31. Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
  32. Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
  33. Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132dioxygenasesdecarboxylasesbiocatalysis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved