הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

Summary

מחקר זה מציג שיטה עבור ההקלטה סימולטני של שדה מקומי פוטנציאל המוח, electrocardiograms, electromyograms, ונשימה אותות של חולדה נעה בחופשיות. טכניקה זו, אשר מפחית את עלויות ניסיוני ומפשטת את ניתוח הנתונים, יתרום להבנה של אינטראקציות בין המוח לבין איברים היקפיים בגוף.

Abstract

פיקוח על הדינמיקות פיזיולוגיים של המוח ושל רקמות היקפיים הוא הכרחי עבור כתובות מספר שאלות לגבי איך הפקדים המוח הגוף פונקציות ומקצבים ואיברים פנימיים כאשר חיות נחשפים אתגרים רגשיים ושינויים שלהם סביבות חיים. באופן כללי הניסויים, אותות של איברים שונים, כגון המוח והלב, נרשמים על ידי מערכות הקלטה עצמאיות הדורשים מספר התקני הקלטה והליכים שונים לעיבוד קבצי הנתונים. מחקר זה מתאר שיטה חדשה בו זמנית יכול לפקח biosignals חשמל, כולל עשרות שדה מקומי פוטנציאל מרובות אזורים במוח, electrocardiograms המייצגים את קצב הלב, electromyograms המייצגים ערים / בשינה, להתכווצות שריר הנשימה אותות, בעכברוש נעה בחופשיות. תצורת הקלטה של שיטה זו מבוססת על מערך מיקרו-כונן קונבנציונליים עבור שדה מקומי קורטיקלית פוטנציאליים הקלטות בו עשרות אלקטרודות המשתכנים, וכל האותות המתקבלים האלקטרודות משולבים יחיד לוח חשמל רכוב על ראשה. . הנה, מערכת הקלטה זו שופרו כך אותות האיברים היקפיים מועברים גם לוח חשמל ממשק. בניתוח יחיד, אלקטרודות קודם בנפרד מושתלים לתוך חלקי גוף המתאים ואת אזורי המוח היעד. הקצוות הפתוחים של כל האלקטרודות ואז הולחמו על ערוצים בודדים של הלוח חשמל מעל ראשה כך כל האותות ניתן לשלב את לוח חשמלי יחיד. חיבור לוח זה מכשיר הקלטה מאפשר עבור האוסף של כל האותות במכשיר אחד, אשר מפחית את עלויות ניסיוני ומפשטת עיבוד נתונים, כי כל הנתונים יכולות להיות מטופלות באותו קובץ נתונים. טכניקה זו יסייע להבנת ה"מפה neurophysiological של השיוכים בין מרכזי והיקפי איברים.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית שולט הברית הגוף בתגובה לשינויים סביבתיים שונים, שליטה זו מיוצגת בדרך כלל שינויי קצב הלב, קצב נשימה, התכווצויות שרירים. עם זאת, מחקרים מעטים בחנו איך גורמים פיזיולוגיים היקפיים כגון משויכים פעילות קורטיקלית. כדי לטפל בבעיה זו, שיטת ההקלטה בקנה מידה גדול עבור ניטור biosignals חשמל רקמות מרכזי והיקפי הכרחי. בקליפת, שדה מקומי פוטנציאליים (LFP) אותות נרשמים extracellularly על ידי אלקטרודות אשר מוכנסים לתוך רקמות קורטיקלית^1,2,3. במקביל להקליט אותות מרובים LFP מהאזורים קורטיקלית של יונקים קטנים, כגון חולדות ועכברים, מספר מחקרים פיתחו סוגים שונים של ההרכבות אלקטרודה מחוייט מכונים מיקרו-כוננים. מיקרו-כונן רגיל מורכב ברגי מתכת המחוברים החלקים האמצעי של האלקטרודות (שהם בדרך כלל tetrodes), גוף הליבה התואם את הברגים ואלקטרודות וקרש הממשק החשמלי (EIB) התואם חורים מתכת כדי לחבר את הקצוות הפתוחים של האלקטרודות (איור 1 2 איור, איור 3). הרכבה אלקטרודה זו מאפשרת למפעיל לשלוט העומק של אלקטרודות רבים מוכנס לתוך המוח במשך ימים עד שבועות, ומאפשר ביצוע הקלטות כרונית לטווח ארוך של פעילות. עצבית כמו החיה היא אתגר שונות פעילויות התנהגותיות. באיברים ההיקפיים, פעימות הלב אותות נרשמים כמו electrocardiograms (ECGs) על-ידי זוג אלקטרודות אשר מושתלים בערך ב-^5,64,אזור הלב, שרירי השלד אותות נרשמים כמו electromyograms (EMGs) עם אלקטרודות אשר מוכנסים^8,97,רקמת שריר. היחס בין אותות חשמליים של הנורה הריח, קצב הנשימה (BR) נחקרה עם יחידה אחת הקלטות^10,11. במערכות הקלטה קונבנציונאלי, אלה אותות ברקמות שונות שנלכדו באמצעות התקני הקלטה עצמאית, מה שאומר כי מערכת ניסויית נוסף נדרש בדיוק לסנכרן את המכשירים הללו מרובים עבור בו זמנית הקלטות של אותות המוח-הגוף. מערכת זו פותחה כדי להתגבר על בעיה זו. בשיטה זו כל אותות חשמליים הקליט האיברים היקפיים, כולל ECGs, EMGs אותות חשמליים מן הנורה הריח המשקפים את קצב הנשימה, משולבים לתוך מערך מיקרו-כונן יחיד^{1,2 ,3}, כאן כינה מערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית. מערכת זו דורשת מכשיר הקלטה רב-ערוצית אחד בלבד, החלים על כל מערך מיקרו-כונן קונבנציונלי. היתרונות של שיטה זו הם כי הוא אינו דורש במכשירים מיוחדים או אותות על ההדק כדי להתאים את זמן ההקלטה של התקנים מרובים, זה מאפשר עיבוד נתונים נוחה יותר, מאז כל האותות נרשמים כסוגי נתונים דומים. טכניקה זו יסייע להבנת ה"מפה neurophysiological של השיוכים בין מרכזי והיקפי איברים. מאמר זה מתאר את ההליכים הקשורים עם הטכניקה ומציגה datasets נציג המתקבל חולדה.

Protocol

כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים בוצעו על פי הנחיות NIH על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים.

1. הכנה של המערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית

1. ליצור מערך מיקרו-כונן להקלטות LFP בקליפת המוח כפי שתואר במקומות אחרים^1,2,3. להשאיר לפחות 6 חורים מתכת פתח על לוח ממשק אלקטרודה (EIB) לשימוש כערוצי אק ג/EMG/BR המחוברים bioflex חוטים כמתואר ב- 1.2.
2. תחתוך את החוט bioflex 6 חלקים באורכים של 5.0 ס"מ. לקלף את טפלון (PTFE) ציפוי שני הקצוות של כל החלקים תיל באורכים של ~5.0 מ"מ. חבר קצה אחד של כל אחד מהחלקים תיל באחד החורים מתכתי פתוח (א/EMG/BR ערוצים) EIB עם סיכת זהב.
3. חותכים כבל אמייל לתוך שתי חתיכות 5.0-ס"מ. הלחמה בקצה אחד של כל אחד החוטים האלה לערוצים הקרקע/הפניה (g/r) על EIB (איור 3, ראה גם הקודם ניירות^12,13).
4. עבור הכנת אלקטרודות אק ג, תחתוך את החוט bioflex לתוך שתי חתיכות 16 ס מ. לקלף את ציפוי PTFE קצוות אלה חתיכות חוט אורך ~5.0 מ מ בקצה אחד (סיום קצר) ו ~ 15 מ"מ בצד השני (סיום ארוך).
5. יוצרים טבעת חוט בקוטר של 2.0 מ מ על ידי כיפוף סוף החוט ארוך, ולתקן את הצורה של הטבעת על ידי הלחמה.
6. עבור הכנת EMG אלקטרודות, תחתוך את החוט bioflex 2 חלקים באורכים של 8 ס מ. לקלף את הציפוי PTFE משני קצוות אלה חתיכות חוט באורכים של ~5.0 מ מ.
7. עבור הכנת BR אלקטרודות, תחתוך את החוט bioflex 2 חלקים באורכים של 6.0 ס מ. לקלף את ציפוי אמייל שני הקצוות של יצירות אלו תיל באורכים של ~5.0 מ"מ. הלחמה בקצה אחד של כל היצירות תיל לראש של בורג פלדה אל חלד (גזע למישור הארץ מהמים מד: 1.0 נובעות מ מ, אורך: 4.0 מ"מ).
8. עבור הכנת אלקטרודות קרקע/הפניה (גר), חיתוך כבל אמייל 2 חלקים באורכים של 6.0 ס מ. לקלף את ציפוי אמייל שני הקצוות של יצירות אלו תיל באורכים של ~5.0 מ"מ. הלחמה בקצה אחד של כל היצירות תיל לראש של נירוסטה-סנט צלופח בורג (גזע בקוטר: 1.4 נובעות מ מ, אורך: 3.0 מ מ).
9. גז לעקר כל אלקטרודות וברגים נירוסטה ולשמור אותם ברווח נקי.

2. השרשת האלקטרודות אק ג/EMG

הערה: בצע את כל השלבים כירורגית עם הטכניקה aseptic באמצעות כפפות סטיריליים ומכשירים בלוק. עבור כל השלבים הכרוכים היצירה של חתך, לחטא את העור עם 70% אתנול לפני ולכסות את החתך עם וילונות כירורגי.

1. לתקן את anesthetized של עכברוש (1.0 – 3.0% איזופלוריין גז) על גבו על משטח שטוח חום. לתת הבופרנורפין בתור מקבל. במקום וטרינרי משחה על העיניים של החולדה למניעת יובש. השתמש betadine כדי לנקות את פני השטח של העור.
2. לעשות חתך של ~2.0 ס מ באזור החזה המדיאלי. לחשוף את השרירים הבין-צלעי על-ידי הפרדת שרירי החזה. תפר את הטבעות של האלקטרודות אק ג השרירים הבין-צלעי.
3. לתקן את הבטן של החיה על משטח חום. לעשות חתך של ~1.0 ס מ באזור הצוואר הגבי.
4. הכנס האלקטרודות אק ג subcutaneously דרך החתך החזה. להחליק את הקצוות אל אזור הצוואר הגבי, להוציא אותם מן החתך הצוואר. תפר החתך החזה.
5. הכנס בקצה אחד של כל אחד החקירה EMG subcutaneously באורך של ~2.0 ס מ, דרך החתך הצוואר. לתקן את האלקטרודות EMG ל שריר הצוואר על ידי תפירה.

3. ההשתלה של המערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית ואלקטרודות BR

1. לתקן את החולדה במכשיר stereotaxic. לעשות חתך של ~3.0 ס מ על הראש לאורך הקו האמצעי נקודה בין העיניים אל אזור הצוואר. לחשוף את הגולגולת.
2. לבצע שני מעגלי גולגולת עם קטרים של 0.7-1.0 מ מ מעל הנורה הריח 11.0 מ מ קדמי ו- 1 מ מ דו צדדיים bregma עם מקדח במהירות גבוהה. שתל שתי אלקטרודות BR בתוך הגולגולת עד קצות הגבעולים הברגים מחוברים אל פני השטח את המוח.
3. לבצע שני מעגלי גולגולת עם קטרים של 0.7-1.0 מ מ מעל בצמוד הקדמי 2.7 מ"מ ו 2.7 מ"מ דו צדדיים bregma. שתל שתי אלקטרודות g/r בגולגולת עד קצה הגבעול בורג מצורפת אל פני השטח את המוח.
4. לעשות חורים שישה עד שמונה עם קטרים של 1.0 מ מ באזור הסובב את גולגולת גדולה. שתל בורגי עיגון (גזע בקוטר: 1.4 נובעות מ מ, אורך: 3.0 מ מ) בתוך הגולגולת.
5. לבצע גולגולת עגול גדול בקוטר של ~2.0 מ מ מעל ההיפוקמפוס האחורי 3.8 מ"מ ו 2.5 מ מ דו צדדיים bregma. למקם את המערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית כך קצה הצינורית המערך נסיעה ממוקם מעל גולגולת גדולה
6. למלא את החלל הפער בין קצה הצינורית על פני המוח ~ 100 µL של שני פתרונות, כלומר., 0.5% (על-ידי המסה) alginate נתרן וכלוריד הסידן 10% (על-ידי המסה).
   הערה: תהליך זה יוצר ג'ל שקוף ~ 5 דקות, לאחר שני פתרונות מעורבבים על הגולגולת.
7. מכסה את הצינורית, BR אלקטרודות, אלקטרודות g/r, ברגי עיגון עם מלט שיניים עם עובי של 0.5 ס מ. להיות זהירים לא לכסות את הקצוות הפתוחים של אלקטרודות BR ו- g/r עם הבטון בשלב זה.
8. הלחמה את הקצוות פתוחים של החקירה קצות חוט בודדים בעבר היו מחוברים לרשת EIB אק ג, EMG, BR ו- g/r (ראה את השלבים 1.2, 1.3).
9. לכסות את החלק התחתון של המערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית, ואת כל החוטים אלקטרודה, עם שיניים מלט. להבטיח כי כל החוטים אלקטרודה מכוסה כולו כך החולדה לא יכולה לגרד אותם לאחר ההשתלה.
10. לאחר הכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות שבה, לחזור החיה חטיבתי הביתה פרספקס שקוף שלה, ולשמור אותו בכוחות עצמו עם גישה חופשית לחיבור מים ומזון. לאחר הניתוח, פנקו את החיה עם אנטיביוטיקה (גנטמיצין).
11. לאחר הניתוח, לפקח על החיות עם תצפית מדי יום. בדוק כי הליכה כראוי, כי לא מצפצפים כאשר הנסיין נוגע המערך מיקרו-כונן.

4. in Vivo הקלטות

הערה: כל הסימנים הם מוגבר, לטעום-2 kHz, ומעביר הלהקה-מסוננים (0.1 - 500 הרץ) למעט פעילות יחידה (לטעום-30 קילו-הרץ ו הלהקה לעבור מסוננים (500-6 kHz)).

1. לחבר את EIB של המערך מיקרו-כונן אינטגרטיבית headstage של מכשיר הקלטה.
2. לקדם את tetrodes על-ידי הפעלת את הברגים של כמה שבועות לאחר הניתוח. לאחר tetrodes סמוכים לאזורי המוח היעד, ליישב את tetrodes לתוך האזורים על פני תקופה של מספר ימים להקלטות יציב.
3. נטר את האותות החשמליים בזמן החיה נע בחופשיות בחדר ההקלטה.

תוצאות

בשיטה זו ניתן ללכוד בו זמנית הביו-חשמליות אותות באיברים רבים המייצגים את הפעילות העצבית במוח, קצב הלב, קצב נשימה, התכווצויות שרירי השלד (איור 1). איור 4 מספק נציג את ההקלטה של עכברוש נעה בחופשיות זה היה שיחור מזון בחופשיות בתוך קופס?...

Discussion

בשביל להבין איך המוח ממיקרו רמות פעילות היקפיים, סגן נחוצים ולהפך, בקנה מידה גדול הקלטה שיטות ללכוד biosignals חשמל מאזורי גוף מרובים בו-זמנית. מחקר זה תיאר הליך כירורגי, ומערכת הקלטה עבור ניטור מוחי שדה מקומי פוטנציאל, הלב, את סדר הגודל של בניית השרירים והדופק, אשר שופרו על מערכת הקלטה המשמש עבו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FEP Hookup Wire Stranded Stainless Steel	Cooner Wire Company, Chatsworth, CA	AS 633	Bioflex wire
EIB-36-PTB	Neuralynx, Inc., Bozeman, MT	EIB-36-PTB	EIB
Cereplex  M	Blackrock  Microsystems, Salt Lake City, UT		Digital headstage
Cereplex Direct	Blackrock  Microsystems, Salt Lake City, UT		Data acquisition system
UEW polyurethane magnet wire	Oyaide.com, Tokyo, Japan	UEW 0.14mm 20m	Enamel wire
SD-102	Narishige, Tokyo, Japan	SD-102	High-speed drill
Minimo ONE SERIES ver.2	Minitor Co.,Ltd, Tokyo, Japan	C2012	High-peed drill Power Supply
Provinice 250 mL	Shofu Inc., Kyoto, Japan	213620136	Dental cement
Small Animal Anesthetizer	Biomachinery, Chiba, Japan	TK-7	Anesthetizer
Buprenorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B7536-1ML	Analgesic
Isoflurane	DS Pharma Animal Health, Osaka, Japan	Isoflu 250mL
Vaseline, White	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	224-00165	Vet ointment
Sodium alginate	Nacalai tesque, Kyoto, Japan	31131-85
Calcium Chloride Dihydrate	Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan	031-00435
Stainless steel screw M1.0×4.0	MonotaRO, Hyogo, Japan	42617504	Stainless steel screw for BR electrodes
Stainless steel screw M1.4×3.0	MonotaRO, Hyogo, Japan	42617687	Stainless steel screw for g/r electrodes and anchors