JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן מוצגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים culturing הקו תא 32D/G-CSF-R מאתר קודמן מיאלואידית, ביצוע זיהומים נגיפיים של ביצוע מבחני התפשטות ובידול. הקו תא מתאים ללמוד פיתוח התאים מיאלואידית, ואת התפקיד של גנים של עניין גדילת התאים מיאלואידית ובידול neutrophilic.

Abstract

ההבנה של הביולוגיה תא גזע, קדמון hematopoietic יש השלכות חשובות על רפואה רגנרטיבית והטיפול של פתולוגיות hematological. למרות הנתונים הרלוונטיים ביותר שניתן לרכשה באמצעות מודלים ויוו או תרבויות העיקרי, שפע נמוכה של תאי גזע וקדמון hematopoietic מגבילה במידה ניכרת את הבריכה של טכניקות מתאימים עבור החקירה שלהם. לכן, השימוש של שורות תאים מאפשרת ייצור מספיק של חומר ביולוגי עבור הביצועים של הקרנות או מבחני הדורשות תאים גדולים מספרים. כאן אנו מציגים תיאור מפורט, בדיקה, פרשנות של מבחני התפשטות ובידול אשר משמשים לחקירה של תהליכים מעורבים myelopoiesis ובידול neutrophilic. ניסויים אלה מעסיקים הקו מהתא מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R ציטוקינים, אשר ברשותה את היכולת להתרבות בנוכחות IL-3, להבדיל ב- G-CSF. אנו מספקים מותאם פרוטוקולים לטיפול 32D/G-CSF-R תאים, לדבר על החסרונות העיקריים והחסרונות שיכול לסכן את מבחני שתואר ואת התוצאות הצפויות. בנוסף, מאמר זה מכיל פרוטוקולים עבור ייצור lentiviral, retroviral טיטור, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R. נדגים כי מניפולציה גנטית של תאים אלה יכול להיות מועסק כדי לבצע בהצלחה לימודי פונקציונלי ומולקולרית, אשר יוכלו להשלים את התוצאות המתקבלות עם ראשי hematopoietic תאי גזע וקדמון או מודלים ויוו .

Introduction

האוכלוסייה גזע ו קדמון hematopoietic מספקת האורגניזם עם מגוון גדול של תאים בוגרים, כולל תאים מן השושלת מיאלואידית (נויטרופילים, אאוזינופילים, בזופילים, ו ומונוציטים). תהליך שמניע את הייצור של התאים מיאלואידית מתאי גזע hematopoietic ידוע בשם myelopoiesis, ייצור מספיק של התאים מיאלואידית בוגרים בתגובה לדרישות השוק המשתנות הוא תנאי הכרחי להתמודדות נכונה של האורגניזם עם הלחץ תנאים, כגון זיהומים ואובדן דם. ההפקה מספקת של התאים מיאלואידית בוגרים עלול להוביל לחוסר יכולת לחסל פתוגנים, קרישת דם מופחתת, ו אחרים סכנת חיים בתנאים1,2. בנוסף, שינויים בהתפתחות השושלת מיאלואידית עשוי גם להיות מזוהה עם hematological ממאירות, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)3. שינויים myelopoiesis עלולה להתרחש מסיבות שונות, כגון פגמים משטח קולטני התא4, ביטויים מסולף של גורמי שעתוק5, ליקויי איתות המסלולים6, מוטציות וכתוצאה מכך היווצרות / הפעלה של oncogenes7או איון של הגידול משתיק קול גנים8.

פותחו שיטות שונות ללמוד פיתוח מיאלואידית, ואף להעריך את ההשפעה של שינויים גנטיים מסוימים בתהליך זה. גישות נפוצות המשמשות ללימוד myelopoiesis לערב ראשי התאים ואת העכברים הטרנסגניים. על פי מודלים אלה לאפשר רכישת נתונים רלוונטיים מבחינה ביולוגית, יש להם מגבלות מסוימות. השימוש העיקרי תאים מפגשים מספר מצומצם של תאים, תקופה מוגבלת של תרבות, צמצום האפשרויות לשינוי גנים וניתוח ביולוגי או ביוכימי עוקבות. העכברים הטרנסגניים יקרות ודורשים מידה סבירה של הצדקה ביולוגית. בנוסף, עבודה עם מודלים ויוו מוסיף דרגת המורכבות לתוך להבין את התפקיד של הגן עניין בתהליך נתונה. לכן, גישות אלטרנטיביות כדי לעקוף את מגבלות אלה נדרשים. שורות תאים יש יתרונות עוררין: (1) שהם בעלי יכולת התפשטות ללא הגבלה המאפשרת יצירת מספיק חומר עבור מחקרים ביוכימיים וביולוגיים, (2) הם רגישים מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט, ביטוי), (3) העלות היא נמוכה יחסית, (4) הם לאפשר מידה מסוימת של הפשטה ביולוגי הנדרשים גישות ניסיוניות מסוימים.

הורים IL-3 (אינטרלוקין-3) 32D תלויה שורת התאים הוקמה בשנת 1983 על ידי Greenberger ועמיתיו על-ידי זיהום של תאים במח העצם של עכברים C3H/HeJ עם החבר לוקמיה מאתר וירוס9. מספר שיבוטים 32D תוארו בספרות: cl-239, cl-310ו- cl-1011. התאים cl-3 32D הוצגו כדי להתרבות IL-3 עוברים התמיינות neutrophilic על טיפול עם מושבת גרנולוציט גירוי פקטור (G-CSF)10. להיפך, 32D cl-10 תאים, תוך כדי להיות איל-3 תלוי במקור היו לא המבדילים בתגובה לטיפול G-CSF. בשנת 1995 הקבוצה של ד ר איבו Touw transduced retrovirally 32D cl-10 תאים עם פראי סוג וצורות מוטציה של קולטן G-CSF (G-CSF-R), על מנת לזהות אזורים חשיבות תפקודית של קולטן זה11. מחקר זה הניב בדור של התאים 32D/G-CSF-R, אשר תלויות באופן דומה ב- IL-3, אבל בתוך 6 עד 10 ימים לאחר החלפה של IL-3 עם G-CSF, תאים להפסיק להתרבות, בלתי הפיך להתמיין נויטרופילים בוגרת. מאפיינים אלה להפוך 32D cl-3 תאים 32D/G-CSF-R מודלים מפושטת של התמיינות neutrophilic מאתר זה יכול להיות מווסת על ידי שני גורמים בידול - IL-3 ו- G-CSF וצמיחה מוגדרים היטב. בעשורים האחרונים קבוצות מרובות השתמשו 32D/G-CSF-R תאים ללמוד את התפקיד של גנים מסוימים התפשטות ו התמיינות של התאים מיאלואידית תרבות12,13,14,15 , 16, ללמוד G-CSF איתות17,18. חשוב לציין, התוצאות המתקבלות באמצעות הקו תא בקורלציה עם נתונים שהושגו עם ראשי תאים, העכברים הטרנסגניים16,19,20,21. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי תאים 32D/G-CSF-R, להיות דוגמנית בשימוש נרחב ומבוסס היטב, מייצגים מערכת יקר ללמוד התמיינות תאים מיאלואידים אשר יכול לשמש במקביל עם גישות אחרות מיעון השאלה הזאת.

. הנה, פרוטוקולים מפורט המתאר טיפול של הקו תא 32D/G-CSF-R, איזה כיסוי הרחבה בידול, הערכה של התפשטות, התמיינות של תאים אלה מוצג. מידע מפורט על ההנדסה הגנטית של תאים 32D/G-CSF-R, או על ידי התמרה חושית retroviral או lentiviral, וכן פרוטוקולים עבור טיטור וירוס הינם מסופקים. בנוסף, ניתנים מספר תוצאות נציג המדגימים יישומים אפשריים של תאים 32D/G-CSF-R.

Protocol

הערה: השלבים המתאר התרחבות, בידול, התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R מוצגים להלן.

1. הכנה

  1. הכנה מדיה
    1. להכין 250 מ של תרבות בינוני: בינוני 1640 RPMI (רוזוול, מכון ממוריאל פארק) בתוספת 10% חום להשבית FBS (סרום שור עוברית) ואיל מאתר-3 (10 ng/mL).
      1. לחלופין, השתמש IL-3 מתוצרת בית. כדי לייצר תוצרת בית איל-3, מגלי HEK293 תאים עם וקטור לביטוי IL-3 ולאסוף את IL-3 המכיל supernatant22.
        הערה: אנטיביוטיקה, כגון פניצילין G (100 IU/mL), סטרפטומיצין (100 µg/mL) ו גנטמיצין (40 µg/mL), יכול לשמש עבור תא culturing בשלב כלשהו של הפרוטוקול אלא אם צויין אחרת.
    2. הכנת 50 מ של בידול בינוני: בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ולאחר האנושי G-CSF (100 ng/mL).
      הערה: (חשוב) לא כל סרום אצוות תומך התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R. לפני תחילת הניסוי מבחן קבוצות שונות של סרום. מומלץ לבדוק לפחות 4 קבוצות שונות, בחר של האופטימלית בהתבסס על היכולת של תאי 32D/G-CSF-R להבחין. ראה להלן פרוטוקול בידול 32D/G-CSF-R.
    3. הכינו 10 מ"ל של מדיום ההקפאה: בינוני RPMI 1640 בתוספת 40% FBS ולאחר 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).
  2. הייצור של רטרווירוס
    1. צלחת השעיה תא בודד של תאים Bosc23 (6 × 106) בצלוחית 16 ס"מ, מטפחים את 18 מ ל DMEM (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco) המכיל 10% FBS עד confluency של התרבות מגיע ל- 80% (24 שעות).
      הערה: תאים תגדל במקבצים טפט וטופס לא בתרבות. ספירת תאים יכול להתבצע באמצעות שיטות שונות (תקף למשך כל הפרוטוקולים המובאת כאן). במקרה של מספר נמוך של דגימות, ספירה ידנית תחת המיקרוסקופ באמצעות לשכת Bürker מומלץ. במקרה זה, השתמש Trypan blue עבור אי-הכללה של תאים מתים. מערבבים תאים 1:1 עם 0.4% Trypan Blue ב- PBS. כדי לבצע ספירה של מספר רב של דוגמאות, מונה הניתן תא אוטומטי יכול להיות מועסק.
    2. לשלב 40 µg של retroviral לבנות (כגון MSCV), µg 20 של pCL-Eco (אריזה וקטורית)23, µl 80 של פיי (polyethylenimine), ו 2 מיליליטר מופחתת-סרום בינונית (למשל Opti-מ) בינונית (ללא אנטיביוטיקה). דגירה תערובת זו עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. בזהירות להחליף Bosc23 תאים בינוני 16 מ"ל DMEM בתוספת 2% FBS. לחמם את המדיום עד 37 ° C לפני השימוש.
      הערה: אין להשתמש אנטיביוטיקה במהלך תרביות תאים, מאז זה עשוי להפחית את יעילות תרביות תאים.
    4. להוסיף את התערובת המבושלות 1.2.2. dropwise ובזהירות כדי Bosc23 את תרבות ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. להגביל דגירה עד פחות מ 6-אייץ ' בשל רעילות פיי.
    5. לאחר דגירה, שנה את בינוני Bosc23 מ"ל 18 מראש חימם DMEM המכיל 10% FBS, ולטפח תאים עבור h 48-37 מעלות צלזיוס. במקום מנות במעבדה רמה 2 אבטחה, למנוע כאן צעד זה על ופעל נהלי הבטיחות הסטנדרטי.
    6. לאסוף Bosc23 בינוני (המכיל חלקיקי retroviral ecotropic) באמצעות פיפטה סרולוגית 25-mL לתוך צינור חרוטי 50-mL, ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: יעילות תרביות תאים (חשוב) אמורים להגיע 90% כדי לייצר וירוס כייל נוגדנים גבוה.
    7. להוסיף 18 mL מראש חימם DMEM 10% FBS כדי Bosc23 תאים, מטפחים במשך 24 שעות ביממה.
    8. חזור על שלב 1.2.6.
      הערה: supernatants Retroviral 1.2.6 ו 1.2.8 יכול להיות איחדו ברגע שיגיעו הטמפרטורה זהה (4 ° C) כדי לשמר את שלמות ויראלי.
    9. כדי למנוע זיהום Bosc23 ב supernatants ויראלי, ספין וירוס שנאספו ב g 1500 × 10 דקות ב 4 º C. וירוס aliquot, הצמד ההקפאה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש, ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. עם זאת, שימו לב את הוירוס הטרי של איכות גבוהה מבחינת זיהום יעילות יותר מניות קפוא.
      הערה: הימנע (חשוב) חוזרות הקפאה \ הפשרה של וירוס, שכן זה מוביל השפלה ויראלי.
  3. הפקה של lentivirus
    1. צלחת השעיה תא בודד של תאים (כליה עובריים אנושיים 293T) HEK293T (6 × 106) בצלוחית 16 ס מ, מטפחים את 18 מ של DMEM המכיל 10% FBS עד confluency של התרבות מגיע ל- 80% (24 שעות).
      הערה: תאים תגדל במקבצים טפט וטופס לא בתרבות.
    2. לשלב 15 µg של המבנה lentiviral (כגון pGhU6), אריזה pCMVdR8.74 פלסמידים (קידוד עבור החלטורה/pol, 12 µg) ו pMD2.VSVG (קידוד עבור VSV-G, 1.4 µg), פיי 85.2 µL ולאחר 2 מ"ל של מדיום מופחת-סרום (ללא אנטיביוטיקה). דגירה תערובת זו עבור 20 דקות ב- RT.
    3. בזהירות להחליף בינוני HEK293T מ"ל 16 של DMEM בתוספת 2% FBS. לחמם את המדיום עד 37 ° C לפני השימוש. אל תשתמש אנטיביוטיקה במהלך תרביות תאים, מאז זה עשוי להפחית את יעילות תרביות תאים.
    4. . זרוק את התערובת המבושלות 1.3.2 לתרבות תא HEK293T ובזהירות דגירה במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. להגביל את משך הדגירה כדי בתוך 6 שעות כדי למנוע רעילות פיי.
    5. שינוי בינוני 18 מ ל מראש חימם DMEM 10% FBS ולטפח תאים עבור h 48-37 מעלות צלזיוס. במקום מנות במעבדה רמה 2 אבטחה, למנוע כאן צעד זה על ופעל נהלי הבטיחות הסטנדרטי.
    6. לאסוף HEK293T בינוני (המכיל חלקיקי lentiviral amphotropic) באמצעות פיפטה סרולוגית 25-mL לתוך צינור חרוטי 50 מ ל ואחסונו ב 4 º C.
      הערה: יעילות תרביות תאים (חשוב) אמורים להגיע 90% כדי לייצר וירוס כייל נוגדנים גבוה.
    7. מוסיפים בזהירות 18 מ של DMEM מראש ומחוממת 10% FBS לתאים HEK293T. מטפחים במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
    8. חזור על שלב 1.3.6.
      הערה: supernatants Lentiviral מן 1.3.6 1.3.8 יכול להיות איחדו ברגע שיגיעו הטמפרטורה זהה (4 ° C) כדי לשמר את שלמות ויראלי.
    9. כדי למנוע זיהום ויראלי תגובת שיקוע עם תאים HEK293T, ספין וירוס שנאספו ב g 1500 × 10 דקות ב 4 º C. וירוס aliquot, הצמד ההקפאה באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש, ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס. עם זאת, שים לב להתמחויות וירוס זה של איכות גבוהה מבחינת זיהום יעילות יותר מניות קפוא.
      הערה: הימנע (חשוב) חוזרות הקפאה \ הפשרה של וירוס, שכן זה מוביל השפלה ויראלי.
  4. טיטור של וירוס המכיל כתב GFP
    1. זרע 1 × 105 תאים NIH/3T3 300 µL של DMEM 10% FBS לכל טוב לתוך צלחת 24-. טוב. 7 בארות המעולים וירוס אחד כייל נוגדנים.
    2. הפשרת וירוס ב 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף 1, 5, 10, 50, 100 ו- 500 µL וירוס NIH/3T3 תרבויות. אל תוסיף כל וירוס לתוך הפקד שלילי. טוב. לטפח תאים בנוכחות הווירוס h 48-37 מעלות צלזיוס.
    3. הקציר NIH/3T3 תאים באמצעות 30 µL של טריפסין/EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic) (0.25% טריפסין, EDTA 0.01% ב- PBS) והמקום התאים ב- PBS 250 µL בשפופרת FACS (מיון תא פלורסצנטיות מופעל).
    4. לקבוע את התדירות של תאים GFP+ על ידי cytometry זרימה כל מדגם24. הכללת תאים מתים על ידי תוספת של צבע הכדאיות, כגון Hoechst 33258.
    5. לחשב מספרים הכוללת את תאי ה-GFP+ (מבוסס על מספר התאים מצופה ואחוז תאי GFP+ ), מניחים אותם כנגד הנפח של וירוס זיהום.
      הערה: (חשוב) יעילות של זיהום מגיע מישור כאשר מינונים גבוהים ויראלי מוחלים. לכן, חשוב להעריך את כייל נוגדנים בהתבסס על ריכוזי ויראלי-איזה זיהום יעילות מתרחשת בטווח ליניארי (למשל שמוצג בטבלה 1). מספר התאים GFP+ מציין את מספר חלקיקים נגיפיים פונקציונלי (TU - הפיכת יחידות) באמצעי אחסון וירוס נתון. חשב מחדש את המספר של TU לכל mL.
  5. טיטור של וירוס המכיל כתב puromycin
    1. זרע 5 × 104 תאים NIH/3T3 3 מ"ל של DMEM 10% FBS לכל טוב בצלחת 6-טוב; מעסיקים 6 בארות כדי וירוס אחד כייל נוגדנים. תרבות בין לילה ב 37 º C.
    2. למחרת לדלל וירוס כמצוין בטבלה מס ' 2. כדי לדלל וירוס, להשתמש DMEM מראש ומחוממת 10% FBS. לא מערבולת.
    3. הסר בינוני תרבות מתאי NIH/3T3 ולהוסיף 1 מ"ל של וירוס מדולל.
    4. דגירה בין לילה ב 37 º C.
    5. בעדינות להחליף המדיום המכיל וירוס 2 מ של DMEM מראש ומחוממת 10% FBS, דגירה בין לילה ב 37 º C.
    6. בעדינות להחליף NIH/3T3 בינוני 2 מיליליטר ומחוממת מראש DMEM 10% FBS המכילים puromycin (2 µg/mL).
    7. תרבות-37 ° C ו בקפידה רענון בינוני עם puromycin כל 3 ימים או מתי בינוני לצהוב.
    8. ב 10-12 ימים לאחר ההדבקה, תשאף בינוני מכל קידוח, לשטוף בעדינות עם PBS.
    9. כתם עם 1 מ"ל של פתרון קריסטל ויולט (0.5% קריסטל ויולט ב 20% אתנול וביו -dH2O), 2 דקות ב RT, לשטוף היטב עם PBS פעמיים.
    10. ספירת כחול מושבות מציגים מכל קידוח תחת מיקרוסקופ (הגדלה X4). אין מושבות להתייחס בפקד שלילי. טוב.
    11. לחשב את מספרי הכולל של TU/mL שוקל את הפקטור דילול.

2. הרחבה ותחזוקה של תאים 32D/G-CSF-R

  1. אם תאים 32D/G-CSF-R מוקפאים, לקחת aliquot ואת להפשיר תאים בתוך אמבט מים 37 ° C עבור 1 דקות ויוצקים תאים המבחנה ישירות לתוך 10 מ"ל של מדיום RPMI 1640 ומחוממת מראש בתוספת 10% FBS בשפופרת 15-mL. ' היפוך ' ברכבת התחתית 3 פעמים, לסובב את התאים למטה-400 ג' × להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בתאים המכילים IL-3 בינוני תרבות-ריכוז של 0.3 × 106 תאים למ"ל.
  2. ריכוז גדילה אופטימלית בתא הוא 0.25-0.5 × 106 תאים למ"ל. לפצל תאים כל יומיים והביאה אותם בריכוז 0.1-0.2 × 106 תאים למ"ל.
    הערה: תאים 32D/G-CSF-R (חשוב) חלקית עלולים לאבד את היכולת שלהם להבחין בין אם גדל ריכוז גבוה יותר מאשר 1 × 106 תאים למ"ל. לכן, חשוב מאוד לפצל תאים 32D/G-CSF-R בזמן.
  3. לפי הצורך, להקפיא ולאחסן תא aliquots במשך פרקי זמן ארוכים ב- 80 ° C או בחנקן נוזלי. ספין למטה 3 × 106 תאים, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל של מדיום מקפיא. צינור המקום במיכל ההקפאה ב-80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך, מיקום מחדש של תאים חנקן נוזלי.

3. התמרה חושית של תאים 32D/G-CSF-R

  1. צלחת 32D/G-CSF-R תאים לתוך צלחת 6-ובכן-ריכוז של 0.3 × 106 תאים למ"ל.
  2. להוסיף את הכמות המתאימה של וירוס להגיע MOI (ריבוי של זיהום) בין 10 ל- 40.
    הערה: MOI גבוהה יותר תגרום אחוז מוגברת של תאים GFP+ , כמו גם רמות גבוהות יותר של ביטוי של הגן עניין. דוגמה: להדביק × 10 0.36 תאים עם MOI של 10; 3 × 106 TU יהיה צורך להוסיף את התאים 32D/G-CSF-R.
  3. להוסיף polybrene הריכוז הסופי 8 µg/mL, תקופת דגירה של 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, לבצע הליך ספין-חיסון: צנטריפוגה ב 1200 × g למשך 90 דקות ב 30 מעלות צלזיוס בצלחת culturing באמצעות רוטור סווינג-דלי ולאחר תקופת דגירה של h 3-37 מעלות צלזיוס.
  4. איסוף תאים, להעביר צינור 15-mL ויסתובב ב g × 450 במשך 5 דקות (4 ° C).
  5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend מגורען תאים 6 מ של תרבות בינוני, למקם את T25 תא תרבות הבקבוק תרבות ב 37 º C.
  6. 48 שעות לאחר מכן, לקצור תאי ולסובב אותם ב g × 450 במשך 5 דקות (4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.
  7. במקרה של עיתונאי GFP: למקם את התאים µL 500 תאים GFP+ PBS ומיון באמצעות של סדרן cytometry זרימה. במקרה של כתב puromycin וקטורית: המקום התאים במדיום תרבות המכיל 2 µg/mL של puromycin.
  8. הרחב את התאים לפי הצורך עבור ניתוח נוסף וניסויים.
    הערה: תאים Transduced (אופציונלי) יכול להיות קפואים קפואים מדיה במיכל ההקפאה ב-80 מעלות צלזיוס, ומאוחסנים נוסף חנקן נוזלי.

4. 32D/G-CSF-R תא assay התפשטות

  1. כדי להעריך את התפשטות שיעור מקום 0.2 × 106 תאים ב- 1 מ"ל של תרבות בינוני, דגירה בין לילה ב 37 º C.
  2. למחרת לספור את מספר התאים, לדלל אותם בחזרה אל ריכוז של 0.2 × 106 תאים למ"ל באמצעות תרבות בינוני. דגירה בין לילה ב 37 º C. לשמור תיעוד של תא ריכוזים של דילולים חלה על התרבויות יומי באמצעות טבלה 3.
  3. חזור על שלב 4.2 במשך ימים רבים כמו התפשטות צריך להיות מוערך.
    הערה: האורך של מבחני התפשטות תלויות השפעת הגן עניין. במקרה של הפנוטיפ חזקה, 8-9 ימים עשויה להספיק לבחון השפעה משמעותית (ראה איור 3 א). עם זאת, במקרה של הפנוטיפ מתון, תקופות זמן ארוכות יותר ייתכן שיהיה צורך.
  4. להעריך גדילת התאים על ידי ביצוע עיקול התפשטות כמצוין בטבלה3.

5. 32D/G-CSF-R תא assay בידול

  1. רחץ תאים 32D/G-CSF-R6 × 10 0.2 פעמיים עם RPMI הבינונית ללא ציטוקינים.
    הערה: השלבים כביסה לפני חיבור של G-CSF אל התרבות חשובים, מאז נוכחות של איל שיורית-3 עלול לעכב בידול.
  2. מקום תאים 1 מ"ל בידול בינוני (מכיל 100 ננוגרם למ"ל G-CSF) ב 24 באר/צלחת, וכתוצאה מכך ריכוז תא של 0.2 × 106 תאים למ"ל (יום 0). תרבות בין לילה ב 37 º C.
  3. לספור את מספר תאים למ"ל כמצוין לעיל (שלב 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 תאים על משטח זכוכית (76 מ"מ X 26 מ"מ) באמצעות צנטריפוגה עם מתאמים הכרחי ב 20 × g.
  5. רענן התמיינות תאים בינונית, צלחת על ריכוז של 0.2 × 105 תאים למ"ל על 24 באר/צלחת (יום 1). למחוק את הלוח הישנה, והמשך יום למחרת עם צעד 5.6 עם הלוח החדש.
  6. בימים 2-7, חזור על שלבים 5.3 עד 5.5. להעריך את התפשטות תאים בנוכחות G-CSF כפי שמתואר בשלב 4.
    הערה: (חשוב) במהלך התמיינות, התפשטות תאים מאט, ולכן לאחר 3-4 ימים בנוכחות G-CSF היא מספקת את התרבות התאים בריכוזים גבוהים.
  7. להעריך את המדינה התמיינות של תאים 32D/G-CSF-R בהתבסס על מורפולוגיה תאים.
    1. לתקן תאים צעד 5.4 מתנול עבור 5 דקות ב RT ולהשאיר את השקופיות מילה נהדרת...
      הערה: שקופיות מיום 0 עד 7 יכול להיות מאוחסן ב- RT, קבוע בו זמנית. באופן דומה, הם יכולים גם להיות כל הזמן ב- RT לתקופות ארוכות לאחר קיבוע.
    2. כתם תאים באמצעות Giemsa מאי-גרונוולד מכתים הפרוטוקול של היצרן הבא.
    3. דמיינו תאים מוכתם באמצעות מיקרוסקופ הגדלה X40.
    4. לכמת את המספר של תקיעות, intermediately תאים בוגרים גרנולוציטים באמצעות תמונות המחשה על איור 1 , תיאור בטבלה4.

תוצאות

התפשטות ובידול של תאים 32D/G-CSF-R

כדי להעריך את התפשטות של תאים 32D/G-CSF-R בתנאים pro-proliferative ובידול פרו, תאים 32D/G-CSF-R היו תרבותי בתקשורת המכיל IL-3 ו- G-CSF, בהתאמה. זה היה ציין כי חלוקת התאים תרבותי IL-3 המכיל בינוני (10 ng/mL) כ כל 24 שעות (איור 2 א)...

Discussion

הבחירה של מדגם ניסיוני הוא אחד הנושאים המרכזיים במחקר. למרות ראשי תאים בעלי חיים ועל האדם הם האמינו כדי לייצר את הנתונים הרלוונטיים ביותר מבחינה ביולוגית, מודלים אלה עשויה להיות כרוכה חששות אתיים, הקשורים לעתים קרובות עם יקרים ו/או מתוחכם בידוד/culturing הליכים. ראשי תאים מוגבלים במספרים, קשה ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה פרופסור ruud ב Delwel פרופסור איבו Touw שסיפקו שורת התאים 32D/G-CSF-R, ואת פרופסור דניאל ג Tenen סיפק לנו שורת התאים Bosc23. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ'כית (GACR 15-03796S ו- GACR 17-02177S) כדי MA-J, תמיכה מן המכון לגנטיקה מולקולרית האקדמיה למדעים של הצ'כית (RVO 68378050) MA-J, מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 341015) מ אוניברסיטת קארל בפראג ח"כ ולאחר מלגת GA בבריטניה (פרוייקט מס 1278217) מ אוניברסיטת קארל בפראג לתחנת משטרה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 powder mediumMerck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10without NaHCO3, with L-glutamine
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS)PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)MT35011CVFor differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
PenicillinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
StreptomycinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Streptomycin sulfate salt powder
GentamicinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
murine IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
human G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
PolyethyleniminePolyscience, Warrington, PA, USA23966Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
TrypsinVWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
Crystal violetSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
Trypan blueSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)D2650
May-Grünwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Italy10802

References

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

13232D G CSF RIL 3G CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved