JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлены подробные протоколы для культивирования 32D/G-CSF-R клеточная линия murine миелоидного прекурсоров, вирусных инфекций и проведение анализов пролиферации и дифференцировки. Эта линия клетки подходит для изучения развития миелоидных клеток и роль генов интерес к росту миелоидных клеток и нейтрофильных дифференциации.

Аннотация

Понимание гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток биологии имеет важные последствия для регенеративной медицины и лечения гематологических патологий. Несмотря на наиболее актуальные данные, которые могут быть приобретены с использованием модели в естественных условиях или первичных культур низкая обилие гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток значительно ограничивает круг подходящих методов для их расследования. Таким образом использование клеточных линий позволяет достаточно производства биологического материала для выполнения показы или анализов, которые требуют числа крупных клеток. Здесь мы представляем, подробное описание, индикация и интерпретации пролиферации и дифференцировки анализов, которые используются для исследования процессов в myelopoiesis и нейтрофильных дифференциации. Эти эксперименты используют 32D G-CSF-реляционный cytokine зависимых murine миелоидного клеток линии, которая обладает способностью размножаться в присутствии Ил-3 и дифференцировать в G-CSF. Мы предлагаем оптимизированный протоколы для обработки клеток 32D/G-CSF-R и обсудить основные недостатки и недостатки, которые могли бы скомпрометировать описанных анализов и ожидаемые результаты. Кроме того эта статья содержит протоколы для производства лентивирусные и антиретровирусного лечения, титрование и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток. Мы демонстрируем, что генетические манипуляции этих клеток могут быть использованы для успешного выполнения функциональных и молекулярные исследования, которые могут дополнять результаты, полученные с основной гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток или модели в естественных условиях .

Введение

Гемопоэтических стволовых и прогениторных населения поставляет в организм с большим диапазоном зрелых клеток, включая клетки миелоидного lineage (нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и моноцитов). Процесс, который управляет производства миелоидных клеток от гемопоэтических стволовых клеток известен как myelopoiesis, и надлежащего производства зрелой миелоидных клеток в ответ на меняющиеся требования является необходимым условием для надлежащего решения проблем организма с стресса условия, такие как инфекции и потери крови. Недостаточное производство зрелых миелоидных клеток может привести к неспособности устранить патогенов, свертываемость крови, снижение и других угрожающих жизни условиях1,2. Кроме того изменения в развитии миелоидного линии также могут быть связаны с гемобластозами, например, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ)3. Изменения в myelopoiesis может произойти из-за различных причин, таких, как дефекты в ячейке поверхности рецепторы4изменены выражения факторов транскрипции5, нарушениями сигнальные пути6, мутации, что приводит к формированию / Активация онкогенов7или инактивации генов усмирителя тумора8.

Различные методы были разработаны для изучения миелоидного развития и оценить воздействие конкретных генетических изменений в этот процесс. Общие подходы, используемые для изучения myelopoiesis связаны главные ячейки и трансгенных мышей. Хотя эти модели позволяют приобретение биологически соответствующих данных, они имеют определенные ограничения. Использование начальной клеток встречает ограниченное количество клеток и ограниченного периода культуры, сужение возможностей для изменения экспрессии генов и последующие биологические или биохимический анализ. Трансгенных мышей являются дорогостоящими и требуют разумную степень биологического обоснования. Кроме того работа с моделями в vivo добавляет степень сложности в понимании роли ген интереса в данном процессе. Таким образом необходимы альтернативные подходы, чтобы обойти эти ограничения. Линии клетки имеют неоспоримые преимущества: (1) они обладают потенциалом неограниченное распространение, что позволяет генерировать достаточно материала для биохимических и биологических исследований, (2) они чувствительны к генетической манипуляции (нокдаун, нокаут, Гиперэкспрессия), (3) стоимость сравнительно низка, и (4) они позволяют степень биологического упрощение в некоторых экспериментальных подходов.

Родительский Ил-3 (интерлейкинов-3) зависимых 32D клеточная линия была учреждена в 1983 году Greenberger и его коллеги инфекции клеток костного мозга от мышей C3H/HeJ друг мышиных лейкемии Вирус9. Несколько 19 d клоны были описаны в литературе: cl-239, cl-310и11cl-10. 36 d cl-3 клетки были продемонстрированы размножаться в ил-3 и пройти нейтрофильных дифференциация по обращению с гранулоцитов колонии стимуляции фактор (Г-КСФ)10. Напротив 27 d cl-10 клеток, будучи зависимой Ил-3, первоначально не были дифференциации в ответ на лечение Г-КСФ. В 1995 году группа д-р Иво Touw retrovirally преобразованы 30 d cl-10 клеток с дикого типа и мутантов формы рецептора Г-КСФ (G-CSF-R), с тем чтобы определить функционально важных регионах этот рецептор11. Это исследование привело к генерации клеток 32D/G-CSF-R, которые аналогичным образом зависят Ил-3, но в пределах 6-10 дней после замены Ил-3 с G-CSF, клетки перестают размножаться и необратимо дифференцироваться в Зрелые нейтрофилы. Эти свойства делают 30 d cl-3 и упрощенные модели клетки 32D/G-CSF-R мышиных нейтрофильных дифференциации, которая может быть модулированные два четко определенных роста и дифференциации факторов - Ил-3 и G-CSF. В течение последних десятилетий несколько групп использовали 32D/G-CSF-R клетки для изучения роли конкретных генов в распространение и дифференцировку миелоидных клеток в культуре12,13,14,15 , 16и для изучения Г-КСФ, сигнализируя17,18. Важно отметить, что результаты, полученные с помощью этой линии клетки коррелирует с данных, полученных с первичные элементы и трансгенных мышей16,19,,2021. Следовательно мы считаем, что 32D/G-CSF-R клетки, будучи широко используется и устоявшиеся модели, представляют собой ценный системы для изучения миелоидного дифференциация, которая может использоваться параллельно с другими подходами, рассмотреть этот вопрос.

Здесь является представил подробные протоколы, описывающие обработку 32D/G-CSF-R клеточной линии, которой расширения покрытия, дифференциация и оценки распространения и дифференциации этих клеток. Подробная информация для генетической модификации 32D/G-CSF-R клеток, либо ретровирусных или лентивирусные трансдукции, а также протоколы для титрования вирус предоставляются. Кроме того предоставляются несколько представительных результаты, которые демонстрируют возможности применения клеток 32D/G-CSF-R.

протокол

Примечание: Шаги, описывающих расширения, дифференциации и трансдукция 32D/G-CSF-R клеток представлены ниже.

1. Подготовка

  1. Подготовка средств массовой информации
    1. Подготовка 250 мл питательной среды: среднего 1640 RPMI (Розвелл парк Мемориальный институт), дополнены 10% тепла инактивированная FBS (плода бычьим сывороточным) и мышиных Ил-3 (10 нг/мл).
      1. Кроме того используйте самодельные Ил-3. Для производства самодельных Ил-3, передают HEK293 клетки с Ил-3 выражая вектора и собирать Ил-3, содержащий супернатанта22.
        Примечание: Антибиотиков, как пенициллин G (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гентамицин (40 мкг/мл), может использоваться для ячеек культивирования на любом этапе протокола, если не указано иное.
    2. Подготовка 50 мл среды дифференциация: средний RPMI 1640 дополнена 10% FBS и человеческого Г-КСФ (100 нг/мл).
      Примечание: Не все сыворотки пакеты поддержки дифференцировки клеток 32D/G-CSF-R (важно). До начала эксперимента проверьте различные пакеты сыворотки. Рекомендуется протестировать по меньшей мере 4 различных партий и выбрать оптимальный основано на способности клеток 32D/G-CSF-R для различения. Смотреть протокол 32D/G-CSF-R дифференциация ниже.
    3. Подготовка 10 мл замораживания среды: средний RPMI 1640 дополнена 40% FBS и 10% ДМСО (диметилсульфоксид).
  2. Производство ретровируса
    1. Пластина одну ячейку суспензию клеток (6 × 106) Bosc23 в чашке Петри 16 см и культивировать в 18 мл DMEM (средний Дульбекко изменение орла), содержащие 10% FBS до confluency культуры достигает 80% (24 ч).
      Примечание: Клетки должны расти в монослоя и не образуют сгустки в культуре. Подсчет клеток может производиться с использованием различных методов (действителен для остальной части протоколов, представленные здесь). В случае низкой количество выборок ручной подсчет под микроскопом с помощью камеры Bürker рекомендуется. В этом случае используйте Трипановый синий для исключения мертвых клеток. Смешать клетки 1:1 с 0,4% Трипановый синий в PBS. Чтобы выполнить подсчет большое количество образцов, счетчик автоматический клеток могут быть использованы.
    2. Объединить 40 мкг ретровирусной конструкции (например, MSCV), 20 мкг pCL Эко (упаковка вектор)23, 80 мкл Пей (polyethylenimine) и 2 мл среды сокращение сыворотке среднего (например Opti-MEM) (без антибиотиков). Инкубируйте эту смесь в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).
    3. Тщательно заменить Bosc23 клетки средних 16 мл DMEM дополнена 2% FBS. Предварительно теплой средой до 37 ° C перед использованием.
      Примечание: Не использовать антибиотики в течение трансфекции, так как это может снизить эффективность трансфекции.
    4. Добавьте смесь в 1.2.2. прикапывают и тщательно Bosc23 культура и инкубировать в течение 4 ч при 37 ° C. Ограничить инкубации до менее чем 6 ч из-за токсичности PEI.
    5. После инкубации, изменить Bosc23 среднего до 18 мл предварительно разогретую DMEM, содержащие 10% FBS и культивировать клетки для 48 ч при 37 ° C. Место блюда в лаборатории 2-го уровня биобезопасности, держать здесь от этого шага на и стандарт безопасности процедур.
    6. Сбор Bosc23 среднего (содержащие ecotropic ретровирусные частицы) с помощью Пипетки серологические 25 мл в 50-мл Конические трубки и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Эффективность трансфекции (важно) следует достичь 90% производить высокий титр вируса.
    7. Добавить 18 мл предварительно разогретую DMEM 10% FBS для Bosc23 клеток и культивировать на 24 часа.
    8. Повторите шаг 1.2.6.
      Примечание: Антиретровирусные supernatants 1.2.6 и 1.2.8 можно объединить как только они достигают той же температуре (4 ° C) для сохранения целостности вирусный.
    9. Чтобы избежать загрязнения Bosc23 в Вирусный supernatants, спина собранных вирус в 1500 × g 10 мин при 4 ° C. Аликвота вирус, оснастки замораживания с помощью сухой лед или жидкий азот и хранить при температуре-80 ° C. Однако обратите внимание, что свежеприготовленные вирус более высокого качества с точки зрения эффективности инфекции, чем замороженные запасы.
      Примечание: (Важно) избегать повторного замораживания/оттаивания вирусов, так как это приводит к вирусной деградации.
  3. Производство Лентивирусы
    1. Пластина одну ячейку подвеска HEK293T (человеческих эмбриональных почки 293T) клеток (6 × 106) в чашку Петри 16-см и культивировать в 18 мл DMEM, содержащие 10% FBS до confluency культуры достигает 80% (24 ч).
      Примечание: Клетки должны расти в монослоя и не образуют сгустки в культуре.
    2. Объединить 15 мкг лентивирусные конструкции (например, pGhU6), упаковка плазмид pCMVdR8.74 (кодировка для кляп/ГСМ, 12 мкг) и pMD2.VSVG (кодировка для VSV-G, 1.4 мкг), пей 85.2 мкл и 2 мл среды сокращение сыворотке (без антибиотиков). Инкубировать эту смесь на 20 мин в рт.
    3. Тщательно заменить HEK293T среднего 16 мл DMEM дополнена 2% FBS. Предварительно теплой средой до 37 ° C перед использованием. Не использовать антибиотики в течение трансфекции, так как это может снизить эффективность трансфекции.
    4. Тщательно удалить смесь, подготовленный в 1.3.2 в культуре клеток HEK293T и проинкубируйте 4 ч при 37 ° C. Ограничить срок инкубации в течение 6 ч для предотвращения PEI токсичности.
    5. Изменение средних 18 мл предварительно разогретую DMEM 10% FBS и культивировать клетки для 48 ч при 37 ° C. Место блюда в лаборатории 2-го уровня биобезопасности, держать здесь от этого шага на и стандарт безопасности процедур.
    6. Сбор HEK293T среднего (содержащие amphotropic лентивирусные частицы) с помощью Пипетки серологические 25 мл в 50 мл Конические трубки и хранить при 4 ° C.
      Примечание: Эффективность трансфекции (важно) следует достичь 90% производить высокий титр вируса.
    7. Аккуратно добавить 18 мл подогретым DMEM 10% FBS в HEK293T клетки. Культивировать в течение 24 ч при 37 ° C.
    8. Повторите шаг 1.3.6.
      Примечание: Лентивирусные supernatants 1.3.6 и 1.3.8 можно объединить как только они достигают той же температуре (4 ° C) для сохранения целостности вирусной.
    9. Чтобы избежать заражения вирусной супернатант с HEK293T клетками, спина собранных вирус в 1500 × g 10 мин при 4 ° C. Аликвота вирус, оснастки замораживания с помощью сухой лед или жидкий азот и храните его при температуре-80 ° C. Однако обратите внимание, что более высокого качества с точки зрения эффективности инфекции, чем замороженные запасы это свежеприготовленные вирус.
      Примечание: (Важно) избегать повторного замораживания/оттаивания вирусов, так как это приводит к вирусной деградации.
  4. Титрование вирус, содержащий GFP репортер
    1. Семян 1 × 10 клеток NIH/3T35 в 300 мкл DMEM 10% FBS в колодец в 24-ну плиту. 7 скважин будет использоваться один титр вируса.
    2. Оттепель вирус при 37 ° C и добавить 1, 5, 10, 50, 100 и 500 мкл вирус NIH/3T3 культур. Хорошо не добавить любой вирус в отрицательный контроль. Культивировать клетки присутствии вируса за 48 ч при 37 ° C.
    3. Урожай NIH/3T3 клеток с использованием 30 мкл трипсина/ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,25% трипсина, 0,01% ЭДТА в PBS) и место клетки в 250 мкл PBS в СУИМ (сортировки клеток активированных флуоресцированием) трубки.
    4. Определите частоту GFP+ клеток подачей cytometry в каждом образце24. Исключает мертвые клетки путем добавления красителя жизнеспособности, таких как Hoechst 33258.
    5. Рассчитать общее количество клеток GFP+ (на основе числа покрытием клеток и процент клеток GFP+ ) и их заговор против тома для инфекции вируса.
      Примечание: Эффективность (важно) инфекции достигает плато при применении больших доз вирусный. Таким образом важно оценить титр, основанный на вирусный концентрации, при которой инфекции эффективность происходит диапазона линейной (пример приведен в таблице 1). Количество клеток GFP+ указывает количество функциональных вирусных частиц (ту - преобразование единиц) в объеме данного вируса. Пересчитать количество ту на мл.
  5. Титрование вирус, содержащий puromycin репортер
    1. Семена 5 × 104 NIH/3T3 клеток в 3 мл DMEM 10% FBS в колодец в пластине 6-хорошо; работают 6 скважин одной титр вируса. Культура на ночь при 37 ° C.
    2. На следующий день разбавляют вирус, как указано в таблице 2. Чтобы разбавить вирус, используйте подогретым DMEM 10% FBS. Сделать не вихря.
    3. Удалить питательной среды из клеток NIH/3T3 и добавить 1 мл разбавленной вируса.
    4. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Аккуратно замените вирус содержащих среднего 2 мл подогретым DMEM 10% FBS и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    6. Аккуратно замените NIH/3T3 среднего 2 мл подогретым DMEM 10% FBS содержащие puromycin (2 мкг/мл).
    7. Культура в 37 ° C и тщательно обновления среды с puromycin каждые 3 дня или когда средний желтеет.
    8. На 10-12 дней после инфицирования аспирационная среднего от каждой скважины и мыть нежно с PBS.
    9. Пятно с 1 мл раствора (0,5% Фиолетовый Кристалл в 20% этанола и dH2O), Фиолетовый Кристалл 2 мин на RT и тщательно вымыть с PBS дважды.
    10. Граф синий колоний в каждой скважины под микроскопом (увеличение X4). Нет колонии должна соблюдаться в отрицательный контроль хорошо.
    11. Рассчитайте общее количество ту/мл учитывая коэффициент разрежения.

2. расширение и обеспечение функционирования клеток 32D/G-CSF-R

  1. Если замороженные клетки 32D/G-CSF-R, возьмите Алиготе и разморозить клетки в ванну воды 37 ° C за 1 мин и залить клетки из флакона непосредственно в 10 мл подогретым RPMI 1640 среды с 10% FBS в 15 мл. Инвертировать трубки 3 раза и спина клетки вниз на 400 × g. удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в ил-3 содержащие питательной среды в концентрации 0,3 × 106 клеток/мл.
  2. Оптимальное ячейки роста концентрация составляет 0.25-0.5 × 106 клеток/мл. Разбиение ячеек каждые 2 дня, привлечения их к концентрации 0,1-0,2 × 106 клеток/мл.
    Примечание: Клетки 32D/G-CSF-R (важно) может частично теряют способность различать если выросли в концентрациях, превышающих 1 × 106 клеток/мл. Таким образом очень важно разбить ячейки 32D/G-CSF-R на время.
  3. При необходимости, замораживания и хранения клеток аликвоты для длительных периодов времени-80 ° c или в жидком азоте. Спин вниз 3 × 106 клеток, удалить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл замораживания среды. Место труб в контейнере замораживания при температуре-80 ° C. Для длительного хранения изменить клетки для жидкого азота.

3. трансдукции клеток 32D/G-CSF-R

  1. Пластина 32D/G-CSF-R клетки в 6-ну пластину в концентрации 0,3 × 106 клеток/мл.
  2. Добавьте соответствующее количество вируса, чтобы достичь MOI (кратность инфекции) между 10 и 40.
    Примечание: Выше MOI приведет к увеличение доли GFP+ клеток, а также более высокий уровень экспрессии гена интереса. Пример: Чтобы заразить 0,3 × 106 клеток с мои 10; 3 × 106 ту должны быть добавлены к клеткам 32D/G-CSF-R.
  3. Добавить Полибрен в конечной концентрации 8 мкг/мл и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° C. Кроме того, процедура спин прививка: центрифуги на g 1200 × 90 мин при 30 ° C в культивирования пластине с помощью ротора свинг ведро и Инкубируйте 3 ч при 37 ° C.
  4. Собирать клетки, передача 15 мл и спина на 450 g × 5 мин (4 ° C).
  5. Отбросить супернатанта, Ресуспензируйте гранулированных клетки в 6 мл питательной среды, место в колбу культуры клеток T25 и культуры при 37 ° C.
  6. 48 h позже, урожай клетки и спина их на 450 g × 5 мин (4 ° C). Выбросите супернатант.
  7. В случае GFP репортер: место клетки в 500 мкл PBS и сортировка клеток GFP+ , с помощью сортировщика цитометрии потока. В случае puromycin репортер, содержащий вектор: место клетки в культурной среде, содержащей 2 мкг/мл puromycin.
  8. Разверните клеток, необходимых для дальнейшего анализа и экспериментов.
    Примечание: (Необязательно) Transduced клетки могут быть заморожены в замораживания средств массовой информации в контейнере замораживания при температуре-80 ° C и далее храниться в жидком азоте.

4. 32D/G-CSF-R мобильных распространения пробирного

  1. Для оценки распространения ставка место 0,2 × 106 клеток в 1 мл питательной среды и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  2. На следующий день подсчитать количество ячеек и развести их обратно в концентрации 0,2 × 106 клеток/мл с помощью питательной среды. Инкубируйте на ночь на 37 ° C. Вести учет концентрации клеток и разбавления применен к ежедневной культуры, с помощью таблицы 3.
  3. Повторите шаг 4.2 для как много дней, как распространение необходимо оценивать.
    Примечание: Длина распространения анализов будет зависеть эффект гена интереса. В случае сильного фенотип 8-9 дней может быть достаточно, чтобы наблюдать значительный эффект (см. Рисунок 3А). Однако в случае мягкой фенотип, может потребоваться более длительные периоды времени.
  4. Оцените рост клеток, сделав распространения кривой, как указано в таблице 3.

5. 32D/G-CSF-R ячейки дифференциации пробирного

  1. Вымойте 0,2 × 106 клеток 32D/G-CSF-R дважды с среду RPMI без цитокинов.
    Примечание: Стиральная шаги до сложения Г-КСФ в культуру являются важными, поскольку присутствие остаточных Ил-3 может препятствовать дифференциации.
  2. Место клеток в 1 мл дифференциации среднего (содержащие 100 нг/мл Г-КСФ) в 24 хорошо/пластины, что приводит к концентрации клеток 0,2 × 106 клеток/мл (день 0). Культура на ночь при 37 ° C.
  3. Подсчитать количество клеток/мл как указано выше (шаг 1.2.1).
  4. Cytospin 2-5 × 104 клетки на слайде стекло (76 мм X 26 мм) с помощью центрифуги с необходимыми адаптерами на 20 × g.
  5. Обновите дифференциации среднего и плита клетки в концентрации 0,25 × 10 кл/мл на 24 хорошо/пластине (1 день). Отбросить старые плиты и перейти на следующий день с шагом 5.6 с новой пластиной.
  6. Дни 2-7 Повторите шаги 5.3-5.5. Оцените пролиферации клеток в присутствии Г-КСФ, как описано в шаге 4.
    Примечание: (Важно) во время дифференцировки, пролиферации клеток замедляется, поэтому после 3-4 дня в присутствии Г-КСФ надлежащей культуры клеток при более высоких концентрациях.
  7. Оценить состояние дифференциация 32D/G-CSF-R клетки основанный на словотолковании клеток.
    1. Исправьте клетки от шага 5.4 в метаноле на 5 мин на RT и оставить слайды для воздушно-сухой.
      Примечание: Слайды от 0 до 7 день можно хранить на RT и фиксированной одновременно. Аналогично они могут также храниться в РТ на более длительный срок после фиксации.
    2. Пятно клеток с использованием мая-Grünwald Гимзы, окрашивание следующие производителя протокол.
    3. Визуализируйте окрашенных клеток с помощью микроскопа и увеличение X40.
    4. Подсчитать количество взрывов, Промежуточно дифференцированных клеток и зрелые гранулоцитов, используя наглядные изображения на рисунке 1 и описание в таблице 4.

Результаты

Пролиферации и дифференцировки клеток 32D/G-CSF-R

Чтобы оценить пролиферацию клеток 32D/G-CSF-R условиях pro пролиферативных и про дифференциации, 32D/G-CSF-R клетки были культивировали в средствах массовой информации, содержащие Ил-3 и G-CSF, соответств?...

Обсуждение

Выбор экспериментальной модели является одним из основных вопросов в области научных исследований. Хотя считается, что основной клетки животных и человека производят наиболее биологически соответствующих данных, эти модели может включать этические проблемы и часто связаны с дорогим...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят профессор Рууд Delwel и профессор Иво Touw за предоставленную нам с линией клеток 32D/G-CSF-R и профессор Даниэль G. Tenen за предоставление нам с линией клеток Bosc23. Эта работа была поддержана грантов грант агентства Чешской Республики (GACR 15-03796S и GACR 17-02177S) для ма-J, поддержки от Института молекулярной генетики Чешской академии наук (РВО 68378050) ма-j, Стипендия Великобритании GA (проект № 341015) от Карлова университета в Праге МК, и Стипендия Великобритании GA (проект № 1278217) от Карлова университета в Праге, PD.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 powder mediumMerck, Kenilworth, NJ, USAT 121-10without NaHCO3, with L-glutamine
DMEMThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15028
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA31985-047L-Glutamine, Phenol Red
Fetal bovine serum (FBS)PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)MT35011CVFor differentiation of 32D/G-CSF-R cells
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10270Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells
PenicillinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)P3032
StreptomycinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)S9137Streptomycin sulfate salt powder
GentamicinSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)G1914
murine IL-3PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA213-13
human G-CSFPeproTech, Rocky Hill, NJ, USA300-23
PolyethyleniminePolyscience, Warrington, PA, USA23966Linear, MW 25,000 (PEI 25000)
PolybreneSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)H9268
TrypsinVWR Chemicals, Radnor, PA, USA0458
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)E5134
Crystal violetSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)C0775
Trypan blueSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)T6146
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)D2650
May-Grünwald GiemsaDiaPath, Martinengo, BG, Italy10802

Ссылки

  1. Bonilla, M. A., et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Engl J Med. 320 (24), 1574-1580 (1989).
  2. Bennett, C. L., Djulbegovic, B., Norris, L. B., Armitage, J. O. Colony-stimulating factors for febrile neutropenia during cancer therapy. N Engl J Med. 368 (12), 1131-1139 (2013).
  3. Lowenberg, B., Downing, J. R., Burnett, A. Acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 341 (14), 1051-1062 (1999).
  4. Dong, F., et al. Identification of a nonsense mutation in the granulocyte-colony-stimulating factor receptor in severe congenital neutropenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (10), 4480-4484 (1994).
  5. Rosenbauer, F., Tenen, D. G. Transcription factors in myeloid development: balancing differentiation with transformation. Nat Rev Immunol. 7 (2), 105-117 (2007).
  6. Kota, J., Caceres, N., Constantinescu, S. N. Aberrant signal transduction pathways in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 22 (10), 1828-1840 (2008).
  7. Kvinlaug, B. T., et al. Common and overlapping oncogenic pathways contribute to the evolution of acute myeloid leukemias. Cancer Res. 71 (12), 4117-4129 (2011).
  8. Krug, U., Ganser, A., Koeffler, H. P. Tumor suppressor genes in normal and malignant hematopoiesis. Oncogene. 21 (21), 3475-3495 (2002).
  9. Greenberger, J. S., Sakakeeny, M. A., Humphries, R. K., Eaves, C. J., Eckner, R. J. Demonstration of permanent factor-dependent multipotential (erythroid/neutrophil/basophil) hematopoietic progenitor cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (10), 2931-2935 (1983).
  10. Valtieri, M., et al. Cytokine-dependent granulocytic differentiation. Regulation of proliferative and differentiative responses in a murine progenitor cell line. J Immunol. 138 (11), 3829-3835 (1987).
  11. Dong, F., et al. Mutations in the gene for the granulocyte colony-stimulating-factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med. 333 (8), 487-493 (1995).
  12. Jorda, M. A., Lowenberg, B., Delwel, R. The peripheral cannabinoid receptor Cb2, a novel oncoprotein, induces a reversible block in neutrophilic differentiation. Blood. 101 (4), 1336-1343 (2003).
  13. Jorda, M. A., et al. Hematopoietic cells expressing the peripheral cannabinoid receptor migrate in response to the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol. Blood. 99 (8), 2786-2793 (2002).
  14. Abbas, S., et al. Integrated genome-wide genotyping and gene expression profiling reveals BCL11B as a putative oncogene in acute myeloid leukemia with 14q32 aberrations. Haematologica. 99 (5), 848-857 (2014).
  15. Zhuang, D., Qiu, Y., Kogan, S. C., Dong, F. Increased CCAAT enhancer-binding protein epsilon (C/EBPepsilon) expression and premature apoptosis in myeloid cells expressing Gfi-1 N382S mutant associated with severe congenital neutropenia. J Biol Chem. 281 (16), 10745-10751 (2006).
  16. Zjablovskaja, P., et al. EVI2B is a C/EBPalpha target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors. Cell Death Differ. 24 (4), 705-716 (2017).
  17. Santini, V., et al. The carboxy-terminal region of the granulocyte colony-stimulating factor receptor transduces a phagocytic signal. Blood. 101 (11), 4615-4622 (2003).
  18. Liu, H., Qiu, Y., Xiao, L., Dong, F. Involvement of protein kinase Cepsilon in the negative regulation of Akt activation stimulated by granulocyte colony-stimulating factor. J Immunol. 176 (4), 2407-2413 (2006).
  19. Kelly, L. M., et al. FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model. Blood. 99 (1), 310-318 (2002).
  20. Pikman, Y., et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 3 (7), e270 (2006).
  21. Schwaller, J., et al. Transformation of hematopoietic cell lines to growth-factor independence and induction of a fatal myelo- and lymphoproliferative disease in mice by retrovirally transduced TEL/JAK2 fusion genes. EMBO J. 17 (18), 5321-5333 (1998).
  22. Drobek, A., et al. PSTPIP2, a Protein Associated with Autoinflammatory Disease, Interacts with Inhibitory Enzymes SHIP1 and Csk. J Immunol. 195 (7), 3416-3426 (2015).
  23. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  24. Alberich-Jorda, M., et al. C/EBPgamma deregulation results in differentiation arrest in acute myeloid leukemia. J Clin Invest. 122 (12), 4490-4504 (2012).
  25. Calabretta, B., Perrotti, D. The biology of CML blast crisis. Blood. 103 (11), 4010-4022 (2004).
  26. Ren, R. Mechanisms of BCR-ABL in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia. Nat Rev Cancer. 5 (3), 172-183 (2005).
  27. Schuster, C., et al. The effects of Bcr-Abl on C/EBP transcription-factor regulation and neutrophilic differentiation are reversed by the Abl kinase inhibitor imatinib mesylate. Blood. 101 (2), 655-663 (2003).
  28. Chang, J. S., et al. High levels of the BCR/ABL oncoprotein are required for the MAPK-hnRNP-E2 dependent suppression of C/EBPalpha-driven myeloid differentiation. Blood. 110 (3), 994-1003 (2007).
  29. Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
  30. Jorda, M. A., Rayman, N., Valk, P., De Wee, E., Delwel, R. Identification, characterization, and function of a novel oncogene: the peripheral cannabinoid receptor Cb2. Ann N Y Acad Sci. 996, 10-16 (2003).
  31. Wurm, A. A., et al. Disruption of the C/EBPalpha-miR-182 balance impairs granulocytic differentiation. Nat Commun. 8 (1), 46 (2017).
  32. Agliano, A. M., et al. On chromosomal instability: what is the karyotype of your 32D CI3 cell line. Blood. 95 (11), 3636-3637 (2000).
  33. Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nat Methods. 3 (4), 287-293 (2006).
  34. Houston, I. B., Huang, K. J., Jennings, S. R., DeKoter, R. P. PU.1 immortalizes hematopoietic progenitors in a GM-CSF-dependent manner. Exp Hematol. 35 (3), 374-384 (2007).
  35. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M., Kamps, M. P. Hoxa9 immortalizes a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent promyelocyte capable of biphenotypic differentiation to neutrophils or macrophages, independent of enforced meis expression. Mol Cell Biol. 20 (9), 3274-3285 (2000).
  36. Calvo, K. R., Sykes, D. B., Pasillas, M. P., Kamps, M. P. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors, enforces expression of Hoxa9, Hoxa7 and Meis1, and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1. Oncogene. 21 (27), 4247-4256 (2002).
  37. Fossati-Jimack, L., et al. Phagocytosis is the main CR3-mediated function affected by the lupus-associated variant of CD11b in human myeloid cells. PLoS One. 8 (2), e57082 (2013).
  38. Schwable, J., et al. RGS2 is an important target gene of Flt3-ITD mutations in AML and functions in myeloid differentiation and leukemic transformation. Blood. 105 (5), 2107-2114 (2005).
  39. Worch, J., et al. The serine-threonine kinase MNK1 is post-translationally stabilized by PML-RARalpha and regulates differentiation of hematopoietic cells. Oncogene. 23 (57), 9162-9172 (2004).
  40. Rowley, J. D. Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 243 (5405), 290-293 (1973).
  41. Stam, K., et al. Evidence of a new chimeric bcr/c-abl mRNA in patients with chronic myelocytic leukemia and the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 313 (23), 1429-1433 (1985).
  42. Holly, S. P., Larson, M. K., Parise, L. V. The unique N-terminus of R-ras is required for Rac activation and precise regulation of cell migration. Mol Biol Cell. 16 (5), 2458-2469 (2005).
  43. Pierce, J. H., et al. Macrophage-colony-stimulating factor (CSF-1) induces proliferation, chemotaxis, and reversible monocytic differentiation in myeloid progenitor cells transfected with the human c-fms/CSF-1 receptor cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (15), 5613-5617 (1990).
  44. Pierce, J. H., et al. Signal transduction through the EGF receptor transfected in IL-3-dependent hematopoietic cells. Science. 239 (4840), 628-631 (1988).
  45. Oomen, S. P., et al. Somatostatin modulates G-CSF-induced but not interleukin-3-induced proliferative responses in myeloid 32D cells via activation of somatostatin receptor subtype 2. Hematol J. 2 (5), 322-329 (2001).
  46. Oomen, S. P., et al. Somatostatin is a selective chemoattractant for primitive (CD34(+)) hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol. 30 (2), 116-125 (2002).
  47. Nogami, A., et al. FLT3-ITD confers resistance to the PI3K/Akt pathway inhibitors by protecting the mTOR/4EBP1/Mcl-1 pathway through STAT5 activation in acute myeloid leukemia. Oncotarget. 6 (11), 9189-9205 (2015).
  48. Rodel, J. E., Link, D. C. Suppression of apoptosis during cytokine deprivation of 32D cells is not sufficient to induce complete granulocytic differentiation. Blood. 87 (3), 858-864 (1996).
  49. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific P210bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (23), 9312-9316 (1988).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

13232D G CSF RmurineIL 3G CSF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены