מיקרוסקופ קוהרנטיות אופטית בשדה מלא לניתוח דמוי היסטולוגיה של תכונות סטרומה בשתלי קרנית

Summary

אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופ קוהרנטיות אופטית בשדה מלא כשיטה להערכת איכות גבוהה של סטרומה של תורם הקרנית. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי תכונות המעידות על בריאות או מחלה, והוא נועד לשפר את ההקרנה והבחירה של רקמות התורם, ומכאן את התוצאות של keratoplasty.

Abstract

איכות סטרומה של הקרנית התורמת, המהווה כ-90% מעובי הקרנית הכולל, עשויה להיות אחד הגורמים העיקריים, אם לא העיקרי, המגבילים להצלחה של קרטופלסטיקה קדמית עמוקה וקראטופלסטיקה חודרת. מדובר בפרוצדורות כירורגיות הכרוכות בהחלפת חלק או כל שכבות הקרנית החולה, בהתאמה, ברקמה שנתרמה, השתל, שנלקחה מאדם שנפטר לאחרונה. עם זאת, האמצעים להערכת איכות סטרומה של שתלי קרנית בבנקי עיניים מוגבלים וחסרים את היכולת של הערכה כמותית ברזולוציה גבוהה של מדדי המחלה. מיקרוסקופ קוהרנטיות אופטית בשדה מלא (FF-OCM), המאפשר הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של דגימות רקמה ביולוגיות טריות או קבועות ex vivo , היא טכניקה לא פולשנית המתאימה היטב להערכת קרנית תורם. כאן אנו מתארים שיטה לניתוח איכותי וכמותי של סטרומה הקרנית באמצעות FF-OCM. הפרוטוקול יושם בהצלחה על קרניות תורמות תקינות ולחצני קרנית פתולוגיים, וניתן להשתמש בו כדי לזהות תכונות בריאות ופתולוגיות הן ברמה המקרוסקופית והן ברמה המיקרוסקופית, ובכך להקל על זיהוי הפרעות סטרומה שעלולות לסכן את התוצאה של קרטופלסטיקה. על ידי שיפור בקרת איכות השתל, לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לגרום לבחירה טובה יותר (ודחייה) של רקמות התורם ומכאן לירידה בכישלון השתל.

Introduction

מחלות קרנית הן בין הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם¹. מחלות מסוימות ניתנות לטיפול כירורגי בלבד, ולעתים קרובות כרוכות בהחלפת חלק (כלומר, קרטופלסטיקה למלרית) או את כל הקרנית החולה (כלומר, קרטופלסטיקה חודרת), על ידי רקמה שנתרמה, השתל, שנלקחה מאדם שנפטר לאחרונה. עבור מחלות קרנית שאינן משפיעות על האנדותל (למשל, קרטוקונוס, צלקות סטרומה לאחר קרטיטיס זיהומיות, טראומה וניוון סטרומה), קרטופלסטיקה למלרית קדמית עמוקה (DALK) נחשבת כיום כטכניקה הכירורגית המועדפת 2,3,4,5. טכניקה זו מאפשרת לשמר את אנדותל הקרנית של הנמען, על ידי החלפת אפיתל הקרנית המרכזי והסטרומה בלבד, דבר הקשור לשכיחות נמוכה יותר של דחיית שתל, היעדר דחיית אנדותל, אובדן תאי אנדותל נמוך יותר ויחס עלות-תועלת חיובי 6,7,8,9,10,11 . DALK גם מאפשר לקרניות עם איכות אנדותל פחות מאופטימלית לשמש כשתלים, מכיוון ששכבה פגומה זו לא תושתל¹². לעומת זאת, איכות הסטרומה של הקרנית התורמת עשויה להיות הגורם המגביל העיקרי להצלחת השתל ולהתאוששות הראייה מכיוון שהסטרומה היא שכבת הקרנית התורמת היחידה שנותרה, בעוד שהאפיתל התורם יוחלף באפיתל הנמען. למרבה הצער, האמצעים להערכת סטרומה של הקרנית התורמת בבנקי העיניים מוגבלים. הם כוללים בדרך כלל בדיקת מנורת חריץ של גלגל העין התורם כאשר שליפת הרקמה נעשית על ידי שאיבה ובדיקת מיקרוסקופ אור של התורם סטרומה¹³. כמה בנקי עיניים החלו להשלים הליכים סטנדרטיים כאלה באמצעות טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית של תחום פורייה (FD-OCT)¹⁴.

טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית אופתלמית (OCT), אנלוגיה אופטית להדמיית אולטרסאונד¹⁵, משתמשת בהפרעות של פס רחב או אור מתכוונן כדי ליצור מקטעים אופטיים של הרשתית¹⁶ והקטע הקדמי¹⁷. בתחום הזמן OCT, הבסיס למערכות קליניות מוקדמות, המיקום של מראת הייחוס משתנה, כך שדפוסי התאבכות מופיעים בכל פעם שקרן הייחוס עברה כמעט את אותו פרק זמן כמו הקרן המשתקפת בממשקי הרקמה השונים, כאשר סריקות A נוצרות כפונקציה של זמן. ב- FD-OCT (המכונה גם תחום ספקטרלי או תחום תדר OCT), הבסיס לרוב המערכות הקליניות המודרניות, מראת הייחוס קבועה במיקום אחד וסריקת A בודדת, עם כל דפוסי ההתאבכות מעורבבים יחד, נרכשת בכל פעם, ומנותחת בנפרד באמצעות ניתוח פורייה.

בעוד שמערכות OCT קליניות (זמן או תחום ספקטרלי) מאפשרות תצוגות חתך של הקרנית וזיהוי אטימות סטרומה ברזולוציה צירית גבוהה יותר מאשר ביומיקרוסקופיה של מנורת חריץ, הרזולוציה הצידית שלהן מוגבלת. מיקרוסקופ קונפוקלי¹⁸ מאפשר בדיקה של הקרנית ברזולוציה צידית המתקרבת לפרטים היסטולוגיים, אך מוגבל אקסיאלית.

מיקרוסקופ טומוגרפי קוהרנטיות אופטית בשדה מלא (FF-OCT או FF-OCM)^19,20 משלב אלמנטים הן של מיקרוסקופ קונפוקלי והן של OCT^, ומשיג רזולוציה רוחבית דומה לרזולוציה צירית של כ-1 מיקרומטר. באופן ספציפי יותר, FF-OCM משתמש במקורות אור בפס רחב לא ברורים (למשל, מנורת הלוגן) ובאופטיקה עם צמצם מספרי גבוה כדי לקבל תמונות טומוגרפיות דו-ממדיות ללא סריקה רוחבית. על ידי סריקה בכיוון העומק, FF-OCM מאפשר הדמיה תלת-ממדית לא פולשנית של דגימות רקמה ביולוגיות טריות או קבועות ex vivo. הוא שימש כדי לדמות את הקרנית^21,22,23. על ידי מתן תצוגות פנים וחתך ברזולוציה גבוהה, FF-OCM מספק מידע הן על המבנה ההיסטולוגי והן על הפרטים התאיים של הקרנית. למעשה, הוכח כי FF-OCM מספק מידע מבני עדיף על היסטולוגיה והיה מסוגל לזהות יותר אינדיקטורים למחלות כפי שהיה אפשרי עם שילוב של OCT תחום ספקטרלי ומיקרוסקופ קונפוקלי^24,25.

כאן אנו מתארים פרוטוקול להערכה איכותית וכמותית של סטרומה מתורם הקרנית באמצעות FF-OCM. השיטה מבוססת על ניתוח דמוי היסטולוגיה של תכונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות המעידות על מצב סטרומה, כולל שלושה פרמטרים כמותיים של סטרומה (כלומר, עובי שכבת באומן והשתנותה, והשתקפות סטרומה). לכן הפרוטוקול המתואר מוחל על רקמות קרנית נורמליות ולא תקינות ומאפשר הבחנה בין רקמות קרנית אנושיות רגילות לרקמות קרנית אנושיות רגילות.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן בוצעו על פי עיקרי הצהרת הלסינקי ועמדו בדרישות אתיות בינלאומיות לרקמות אנושיות. זה היה מחקר מקרה ביקורת תצפיתי פרוספקטיבי. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. לא נעשו שינויים בסטנדרטים הצרפתיים של טיפול או מעקב. אישור ועדת הביקורת המוסדית (IRB) התקבל מהוועדה להגנת החולה, איל-דה-פראנס V (14944).

1. בחירת רקמות והכנתן

1. בחר קרניות תורם.
   1. העבר קרניות תורם המאוחסנות במדיום תרבית איברים 26 למדיום תרבית איברים בתוספת דקסטרן למשך 3 ימים כדי לאפשר גירוי²⁷ לפני הדמיית FF-OCM²⁸ (ראה טבלת חומרים).
2. הכינו את הדגימות.
   1. מקמו את הקרנית, שקועה באמצעי אחסון, במחזיק הדגימה כשהאפיתל פונה כלפי מעלה.
   2. הניחו כיסוי סיליקה נקי (מסופק עם מחזיק הדגימה) על גבי הקרנית וסגרו את המחזיק על ידי סיבוב עדין של בסיסו עד שהדגימה משוטחת מעט ומשותקת מתחת למכסה ומספקת משטח הדמיה אחיד יחסית. נקוט אמצעי זהירות כדי למנוע בועות אוויר.
   3. יש למרוח שכבה עבה של ג'ל עיניים או אופטי על הכיסוי כמדיום טבילה.

2. אתחול, הגדרה ורכישת תמונות של FF-OCM

1. אתחל את ההתקן.
   1. הפעל את ההתקן על-ידי הפעלת מתג ההפעלה בגב המכשיר; תאורה של נורית LED ירוקה בחזית המכשיר מציינת שהחשמל דולק.
   2. הפעל את המחשב הייעודי ואת מקור אור ההלוגן על-ידי הפעלת מתג ההפעלה בחזית.
   3. הפעל את תוכנת הרכישה (ראה רשימת חומרים) על ידי לחיצה כפולה על קיצור הדרך לשולחן העבודה.
   4. ודא ששלב ההדמיה נקי למעט המגש הנייד. לאחר מכן לחץ על "אישור" כדי לאתחל את המנועים בפקודה.
   5. משוך את המגש והכנס את מחזיק הדגימה למיכל הייעודי, ולאחר מכן דחף בעדינות את המגש לאחור.
2. הגדר את ההתקן.
   1. הזן "מזהה מדגם" בשדה המיועד והחובה; לחלופין, הזן "תיאור לדוגמה" ו / או "תיאור המחקר".
   2. לחץ על "רכוש תמונת מאקרו" כאשר מוכן, כדי ליצור תמונה של הדגימה שניתן להשתמש בה למטרות מיקום וניווט לרוחב מאוחר יותר; לאחר שביעות רצון, לאמת את התמונה בבקשה על ידי לחיצה על "כן", ולאחר מכן המכשיר מזיז את מגש הדגימה מתחת למטרה ומבצע התאמה אוטומטית.
   3. ודא כי מטרת המיקרוסקופ שקועה היטב בג'ל האופטי לפני שתמשיך הלאה.
3. רכשו את הערימות.
   1. בחר בכרטיסייה "חקור" כדי להכין רכישה.
      1. לפני רכישת ערימת תמונות, נווט למרכז הקרנית, באמצעות תרגום של הג'ויסטיק או בחירה ידנית על המסך (כלומר, על ידי לחיצה וגרירה של הריבוע האדום על תמונת המאקרו שנרכשה למיקום הרצוי).
      2. שנה את עומק ההדמיה באמצעות סיבוב של הג'ויסטיק, התאמת המחוון או קלט מקלדת ידני בממשק המשתמש הגרפי (GUI), והתאם את הערך הממוצע (ממוצע של 40 מומלץ בדרך כלל להדמיית קרנית אופטימלית).
         הערה: זה נעשה כדי לקבוע את עובי דגימת הקרנית ואת הממוצע הדרוש כדי לצלם דרך כל עובי הקרנית תוך ציון מיקום התמונה הראשונה והאחרונה לעומק. המשטח התחתון של הכיסוי יוצר שולי הפרעה מקבילים הנראים בתמונה הטומוגרפית (בצד ימין של ממשק המשתמש הגרפי), המאפשרים איתור משטח הקרנית.
      3. הזן את ערך פני הקרנית או את מיקום התמונה הראשונה לעומק בשדה "עומק".
   2. בחר את "לרכוש הכרטיסייה", כדי לרכוש תמונות.
      1. בחר את "מרווח פרוסה" (הגדרת ברירת המחדל והמומלצת היא 1 מיקרומטר, התואמת את הרזולוציה הצירית של המכשיר) והזן את ערך עובי הקרנית בהתאם, תחת "מספר פרוסות".
      2. סקור פרמטרים וזמן רכישה, וכאשר מרוצה לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הרכישה.
      3. במהלך הרכישה, הימנע מכל מגע עם הטבלה שעליה ממוקם ה- FF-OCM.

3. ניהול תמונות שנרכשו

1. הצגה וייצוא של תמונות.
   1. הפעל את תוכנת הצפייה FF-OCM (ראה רשימת חומרים) על ידי לחיצה כפולה על קיצור הדרך לשולחן העבודה; תמונות שנרכשו (מזוהות על ידי מזהה המדגם) מופיעות ברשימה "מחקרים מקומיים".
   2. בחר את המחקר עם מזהה המדגם המתאים, המכיל הן את תמונת המאקרו והן את אוסף התמונות שנרכש, ו"ייצוא" את האחרון על ידי לחיצה ימנית על סדרת התמונות ובחירת פורמט "DICOM" כדי לשמור על נתוני הפיקסלים הגולמיים והמטא נתונים לניתוח נוסף.
   3. הצג את ערימות התמונות התלת-ממדיות בתצוגות פנים וחתך באמצעות מצב שחזור רב-מישורי (MPR), על-ידי לחיצה כפולה על סדרת התמונות; נווטו בין התמונות (לדוגמה, באמצעות גלילה בגלגל העכבר או התאמת מחוון) ובחרו תצוגות מייצגות של כל ערימה .
   4. ייצא את התצוגות שנבחרו על ידי לחיצה על הסמל בפינה השמאלית התחתונה של החלון, באמצעות פורמט "DICOM".
2. ייבוא תמונות.
   1. פתח את תוכנת עיבוד התמונה (ראה טבלת חומרים) על ידי לחיצה כפולה על קיצור הדרך לשולחן העבודה, ונווט אל "Bio-Formats" "יבואן" תחת "תוספים" כדי לייבא תמונות DICOM; ודא שהאפשרות "קבץ קבצים בעלי שמות דומים" נבחרה בחלון "אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות".

4. ניתוח תמונות: הערכה איכותית וכמותית של מורפולוגיה ותכונות סטרומה

1. להעריך את עובי השכבה של סטרומה ובאומן.
   1. מדדו מרחקים באופן ידני על חתכי הקרנית, למשל בחמש נקודות במרווחים שווים על פני חתך²⁵.
      1. ציירו קו בין שתי נקודות של מרחק ידוע (למשל, משמאל לימין של התמונה כולה, כלומר לפי שדה הראייה המוגדר כברירת מחדל, 1,024 פיקסלים או 780 מיקרומטר), עברו אל "נתחו" ובחרו "הגדר קנה מידה", והזינו את "מרחק ידוע" ו"יחידת אורך" בשדות המתאימים ולחצו על "אישור".
      2. צייר קו בין שתי נקודות של מרחק לא ידוע; קרא את האורך או המרחק שנמדדו ישירות משורת המצב.
   2. רשום את הממוצע והמקדם של השונות (COV). עובי השכבה של באומן פחות מ-6.5 מיקרומטר ו-COV גדול מ-18.6% נקשרו לסטרומה חריגה של הקרנית²⁵.
2. לקבוע את צפיפות קרטוציטים.
   1. בעקבות המוסכמה של מיקרוסקופיה קונפוקלית: סכום תמונות סטרומה en פנים בקבוצות של 7 כדי לייצר פרוסות בעובי דומה. לשם כך, עבור אל הכרטיסייה "תמונה" ובחר "פרוס Z" תחת "ערימות".
   2. קח בחשבון את צפיפות התאים השונה (יורדת) על התקדמות דרך סטרומה^24,25. לשם כך, ניתן להתייחס לסטרומה כמורכבת מ-4 אזורים לפי עומק: (1) הסטרומה הקדמית מאוד מתחת לשכבת באומן, כלומר 2% מעובי הסטרומה כולה; הסטרומה הנותרת (כלומר, 98% מעובי הסטרומה כולה), עם שלושה אזורים בעובי זהה: (2) סטרומה קדמית, (3) סטרומה אמצעית, ו-(4) סטרומה אחורית.
   3. לניתוח נוסף, כלול את כל פרוסות הפנים הזמינות עבור הסטרומה הקדמית מאוד, 15 תמונות עבור הסטרומה הקדמית, 5 תמונות עבור הסטרומה האמצעית, כמו גם 5 תמונות עבור הסטרומה האחורית (כאשר מספר התמונות לכל אזור הדרוש לספירה אמינה נקבע על ידי ניתוח מדורג²⁹).
   4. בכל תמונה צמודה , בחר אזור עניין בגודל 300 מיקרומטר x 300 מיקרומטר. כדי לשפר את התצוגה החזותית של הגרעין, הפוך את התמונה באמצעות "היפוך" תחת הכרטיסייה "ערוך", והתאם את הניגודיות והבהירות. עבור האחרון, עבור אל "תמונה" ונווט אל "בהירות / ניגודיות" תחת "נתח".
   5. ספירה ידנית של גרעיני תאים, תוך שימוש למשל בפונקציה "מונה תאים"²⁵. לשם כך, עבור אל "תוספים" ונווט אל "מונה תאים" תחת "נתח". לחץ על "initialize" ולאחר מכן בחר סוג מונה. לאחר מכן התחילו לספור את גרעיני התא על ידי לחיצה על מאפיינים אליפטיים כהים בתמונה ההפוכה, בהתחשב באלה שנוחתים על גבול תמונה רק עבור שניים מתוך ארבעת הצדדים של התמונה²⁵.
   6. רשום את צפיפות התאים במונחים של צפיפות שטח, כלומר בתאים/mm² (חלק את מספר התאים שנספרו ב-0.09, כדי להמיר מתאים / 90,000 מיקרומ² לתאים / mm²), בעקבות מוסכמה במיקרוסקופ קונפוקלי שבה צפיפות קרטוציטים הוכחה כנמוכה יותר בחולים (למשל, עם קרטוקונוס) מאשר בנבדקים בריאים ובקורלציה עם חומרת המחלה²⁵.
      הערה: מחקרים קליניים נוספים נחוצים כדי לקבוע אם נדרש סף מינימלי של צפיפות קרטוציטים כדי להשיג השתלת קרנית ברורה לחלוטין לאחר ההשתלה.
3. להעריך את השתקפות סטרומה.
   1. צור פרופילי עומק עוצמה ממוצעת של ערימות תמונות סטרומה, לדוגמה באמצעות הפונקציה "פרופיל ציר Z" ו/או תוכנה מותאמת אישית^25,30,31.
      הערה: אלה הם למעשה פרופילי עומק משרעת מכיוון ש- FF-OCM מודד את משרעת האור המפוזרת לאחור על ידי הדגימה ולא את עוצמתה.
      1. חשב את הרמה האפורה הממוצעת עבור כל ערימת פנים בינונית .
      2. החסר את הערך האפור המינימלי ונרמל בערך האפור המרבי.
      3. תצוגה בסקאלת יומן כפונקציה של עומק סטרומה (% מעובי הסטרומה).
      4. קירוב הפרופיל הלוגריתמי המתקבל על ידי קו רגרסיה ליניארי, הממזער את סכום השאריות בריבוע (התאמת הריבועים הפחותים).
      5. רשום את הערך הריבועי R (R²) כמדד לליניאריות. ערכים מתחת ל -0.94 יכולים להיות אינדיקציה לפתולוגיה של הקרנית²⁵.
         הערה: כדי להבדיל בין אי ההתאמה של מודל רגרסיה לוגריתמית ליניארית (או מודל דעיכה מונו-מעריכי) עקב נוכחות פתולוגיה מרעש מדידה גרידא, ניתן לבצע ניתוח אותות על ידי הסקה בייסיאנית³¹. כמו כן, בקרניות עם פרופילי עומק סטרומה לוגריתמיים ליניאריים (או מונו-מעריכיים) (למשל, מיוצגים על ידי ערכי ריבוע R³⁰ או יחסי בירגה 31 קרובים ל-1), חישוב הנתיב נטול הממוצע של הפוטון מקצב דעיכת האות עשוי לשמש לכימות נוסף של מידת השקיפות³¹.
4. להעריך את הנראות של תכונות סטרומה אחרות אינדיקטורים המחלה.
   1. בדוק נוכחות של צלקות, רקמות פיברוטיות, אגמים, או Vogt striae.
   2. להעריך את העובי הממוצע של העצבים בסטרומה, אם נראה מספיק למדידה²⁴.
      1. בחר תמונה אחת במקום שבו עצב הסטרומה גלוי ביותר (בדרך כלל באזור אמצע הסטרומה).
      2. למדוד את עובי העצב, למשל בחמש נקודות²⁴, ולאחר מכן לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן. עובי עצבים מעל 9 מיקרומטר עשוי להיות אינדיקטור נוסף לפתולוגיה, כגון קרטוקונוס²⁴.

תוצאות

התקן FF-OCM (ראה טבלת חומרים)²⁸ וההגדרה הכללית המשמשת בכתב יד זה מוצגים באיור 1. איור 2 מראה קרנית תורמת אנושית מנופחת לאחר אחסון בתווך תרבית איברים, מה שנותן מודל פתופיזיולוגי של קרנית בצקתית ומונע רכישת תמונת FF-OCM דרך כל עובי הקרנית עקב עומק חדירה מוגבל. העברה למדיום תרבית איברים עם תוספת דקסטרן גורמת לנפיחות וגורמת לקרניות התורמות בעובי תקין, כפי שמיוצג באיור 3. ניתן לזהות קרניות חולות על-ידי שינויים מורפולוגיים ותכונות סטרומה אופייניות, כולל עובי מופחת ומשתנה של הסטרומה (איור 4) ו/או של שכבת באומן (איור 5). הערכה של צפיפות קרטוציטים (איור 6) ושל רפלקטיביות סטרומה (איור 7) עשויה לסייע עוד יותר בניתוח דמוי היסטולוגיה ובהבחנה של נורמלי מרקמות קרנית פתולוגיות עם FF-OCM, מעבר ליכולות של מערכות OCT קליניות (איור 8).

איור 1: סכמות ותצלומים של ההגדרה הכללית והתקן FF-OCM ששימשו בעבודה זו. (A) תצלום של התקן FF-OCM (ראה טבלת חומרים)²⁸. (B) הגדרה סכמטית ואופטית של המכשיר. (ג) צילום קרנית של תורם אנושי במחזיק הדגימה. (D) התקרבו למטרת הטבילה ולמחזיק הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: קרנית אנושית נורמלית בתרבית איברים לפני הטרדה. מבט חתך (A) ומבט על הפנים (B, פרוס דרך הסטרומה) של קרנית נפוחה ("בצקתית") הנגרמת על ידי אחסון בתווך תרבית איברים, שם אגמים יכולים להיראות כאזורים כהים (כפי שמצוין על ידי חצים). עובי הקרנית הוכפל ליותר מ-1,100 מיקרומטר, מה שמונע רכישת תמונה לאורך כל העומק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: קרנית אנושית נורמלית בתרבית איברים לאחר הטרדה. מבט חתך דרך הקרנית כולה (A) ומבט סטרומה (B) של קרנית מנופחת שקועה בתווך בתוספת דקסטרן, מראה קרטוציטים היפר-רפלקטיביים (לבנים) המפוזרים באופן קבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הערכה כוללת של מורפולוגיה ותכונות סטרומה, כולל עובי סטרומה. בהשוואה לקרנית אנושית רגילה (A), קרניות עם קרטוקונוס (B) מתאפיינות בעובי סטרומה מופחת ומשתנה, יחד עם סטריות Vogt רבות ומקבילות שניתן להבחין בהן כפסים אנכיים כהים במבט חתך, ועצבי סטרומה עבים שניתן למצוא בפרוסות פנים באמצע סטרומה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הערכת עובי השכבה של באומן, אשר מסומן קדמית על-ידי קרום מרתף אפיתל היפר-רפלקטיבי ואחורית על-ידי קרטוציטים היפר-רפלקטיביים בסטרומה הקדמית מאוד. בהשוואה לקרנית אנושית רגילה (A), הקרנית הפתולוגית (למשל קרטוקונוס) (B) מתאפיינת בעובי שכבת באומן מופחת ומשתנה עקב הפרעה וצלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: הערכת צפיפות קרטוציטים. (A) גרעיני קרטוציטים נספרים ידנית על גבי תמונות פנים משופרות והפוכות לאחר בחירה של אזור מעניין בגודל 300 מיקרומטר x 300 מיקרומטר. (B) גרעינים שנספרו מסומנים בחצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: הערכה של רפלקטיביות סטרומה. כמות האור המפוזר לאחור פוחתת (באופן אקספוננציאלי) עם עומק הסטרומה של קרניות תורמות נורמליות (ראו איור 3 ואיור 4A), וכתוצאה מכך נוצרים פרופילי עומק לוגריתמיים ליניאריים, המיוצגים על-ידי ערכי ריבוע R הקרובים ל-1 (עקבה ירוקה). ייתכן שזה לא נכון עבור קרניות פתולוגיות הכוללות אזורי סטרומה בעלי פיזור אחורי מוגבר של האור (ראו איור 4B). נוכחותם של מאפיינים מקרוסקופיים כאלה, כמו בדוגמה של קרנית עם צלקת סטרומה לאחר קרטיטיס זיהומית (המתוארת בכניסה), תיצור אפוא פרופילי עומק בעוצמה לוגריתמית לא ליניארית, המיוצגים על ידי ערך ריבועי R מתחת לסף מסוים (למשל, נמוך מ- 0.94²⁵; עקבות אדומות). שימו לב שפרופילי עומק משרעת לוגריתמית מוצגים למעשה כאשר FF-OCM מודד את משרעת האור המפוזרת לאחור על ידי הדגימה ולא את עוצמתה.  אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הדגמת היתרונות של FF-OCM על פני היסטולוגיה ותחום ספקטרלי OCT. (A) היסטולוגיה ו-(B) תמונה ספקטרלית-תחום-OCT תואמת שנרכשה על אותה קרנית in vivo לפני קרטופלסטיקה. (C) חתך FF-OCM תואם של כפתור הקרנית ex vivo לאחר ניתוח קרטופלסטיקה, הממחיש רזולוציה מעולה בהשוואה לתמונות OCT בתחום הספקטרלי הקליני. הפיברוזיס גם נראה בבירור רב יותר בתמונות FF-OCM מאשר בהיסטולוגיה. ניתן לראות בבירור את הצפיפות הגבוהה של קרטוציטים בסטרומה העליונה הן בחתך (C) והן במבט (D) על הפנים . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן להערכה איכותית וכמותית של סטרומה מתורם הקרנית באמצעות FF-OCM מבוסס על ניתוח דמוי היסטולוגיה של תכונות מקרוסקופיות ומיקרוסקופיות המעידות על מצב סטרומה, מעבר ליכולות OCT בתחום הספקטרלי ומיקרוסקופ קונפוקלי^21,24,25, ומאפשר הבחנה בין חולים לרקמות אנושיות נורמליות.

מלבד הערכת איכות אנדותל מצוינת של קרניות תורם אנושי באמצעות מיקרוסקופ ספקולארי, הערכת איכות סטרומה מאתגרת בבנקי עיניים, ובדרך כלל מוגבלת לתצפית גסה עם ביומיקרוסקופיה של מנורות סדק ו / או מיקרוסקופ אור בפרוטוקולים הנוכחיים. חוסר רזולוציה עדינה בשיטות הקיימות פירושו לא רק שקרניות עם מחלת סטרומה כלשהי עשויות להיבחר הפוגעות בתוצאה של קרטופלסטיקה, אלא גם שקרניות עשויות להידחות בגלל אטימות סטרומה שהן למעשה אילוץ לסטרומה קדמית או אזורי אפיתל ועדיין יכולות לשמש להליכי קרטופלסטיקה אנדותל¹⁴.

את פרוטוקול בנק העיניים הנוכחי ניתן להשלים על ידי תוספת של FF-OCM, אשר בשל הרזולוציה המעולה שלו, מהווה כלי רב עוצמה ולא פולשני להשלמת הערכת האיכות של הקרנית, במיוחד הסטרומה (כולל שכבת באומן). שלא כמו במהלך בדיקת מנורת החריץ, השתל נשאר שקוע בתא סגור מלא באמצעי אחסון לאורך כל רכישת התמונה FF-OCM, מה שמקטין כל סיכון פוטנציאלי לזיהום.

לרכישת תמונה מוצלחת עם FF-OCM (ראה טבלת חומרים), חשוב שמטרת המיקרוסקופ תהיה שקועה היטב בג'ל האופטי שמורחים על גבי הכיסוי של מחזיק הדגימה (שלב 2.2.3). כמו כן, מומלץ לבדוק באופן קבוע את כיול המכשיר, הליך שיש לבצע גם לאחר התאמה אוטומטית לא מוצלחת (שלב 2.2.2) והגישה אליו מתבצעת באמצעות "כלים ואפשרויות" בתוכנת הרכישה (ראה טבלת חומרים). ההליך, הכולל שימוש במראה כיול במחזיק הדגימה, זהה להכנת הדגימה הרגילה (ראה שלב 1.2) אלא שיש למרוח את הג'ל האופטי על המראה לפני מיקום הכיסוי.

סדרה של השתלות קרנית מתורם, הנחשבות לבעלות סטרומה תקינה על פי נהלי בנק העיניים הקיימים, שימשו לתיאור הפרוטוקול בכתב יד זה ולהדגמת התאמתו של FF-OCM להערכה מדויקת ואמינה של איכות הסטרומה של התורם. קרניות תורמות נורמליות אלה הושוו לקרניות פתולוגיות השקועות באמצעי אחסון, והראו כי הניתוח דמוי ההיסטולוגיה שהתאפשר עם FF-OCM של מספר תכונות סטרומה (מודגמות באיור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7 ואיור 8) בשתלי קרנית מאפשר להבחין בין רקמות קרנית אנושיות חולות לרקמות קרנית אנושיות רגילות.

מלבד שינויים מורפולוגיים, כגון נוכחות של צלקות (איור 5 ואיור 7), רקמה פיברוטית (איור 8), אגמים (איור 2), Vogt striae (איור 4), או קוטר עצב סטרומה מוגבר (איור 4), תכונות סטרומה טיפוסיות קיימות בקרניות חולות. נראה כי פרמטרים סטרומליים רלוונטיים במיוחד בהערכת איכות הסטרומה הם עובי השכבה של באומן והשתנותו, והשתקפות סטרומה. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם אפוא שלבים 4.1 ו-4.3.

בעוד שהיא מופרשת במהלך התפתחות הקרנית האנושית, השכבה של באומן, במיוחד, הופכת מובחנת על ידי 19 שבועות של הריון ולעולם לא מתקנת לאחר הלידה³². נזק לשכבת באומן הוא אפוא בלתי הפיך ומשמש אינדיקטור אידיאלי לנזקי סטרומה קודמים ברקמת הקרנית התורמת, כולל נזק שנגרם כתוצאה מניתוח שבירה, קרטיטיס זיהומיות, קרטוקונוס. מחלות קרנית כאלה, המהוות התוויות נגד לשימוש בקרנית התורם, קשורות לירידה ומשתנה בעובי שכבת באומן עקב הפרעה וצלקות (איור 5), והן עלולות להחמיץ בפרוטוקולים הנוכחיים של בנק העיניים כאשר ההיסטוריה של התורם אינה ידועה במדויק.

אף על פי ששקיפות הקרנית נפגעת לאחר מות התורם עקב בצקת קרנית לאחר המוות , כמות האור המפוזר לאחור, או החזר הסטרומה צפויה לרדת באופן אקספוננציאלי עם עומק הסטרומה (ראו איור 3 ואיור 4A); כתוצאה מכך, הלוגריתם של החזרת סטרומה מנורמלת יהיה פונקציה ליניארית של עומק סטרומה בקרניות תורמות נורמליות, המיוצגת על ידי ערכי ריבוע R קרובים ל-1. לעומת זאת, נוכחות של מאפיינים מקרוסקופיים קשורה לפרופילי עומק לוגריתמיים לא ליניאריים ומעידה על מחלת סטרומה (איור 4B ואיור 7)²⁵.

מכיוון שצפיפות קרטוציטים אחראית לסינתזה והתחדשות של סיבי קולגן סטרומה ומטריצות חוץ-תאיות, סביר להניח שצפיפות קרטוציטים היא פרמטר רלוונטי נוסף להערכת איכות הסטרומה של התורם, וכי אין להשתיל רקמות המציגות ספירת קרטוציטים נמוכה מאוד. לפיכך, הפרוטוקול כולל שיטה מדויקת ואמינה למדידת צפיפות קרטוציטים מתמונות FF-OCM שניתן להשתמש בהן בקלות בבנקי עיניים²⁵ ועוקב אחר המוסכמה של מיקרוסקופ קונפוקלי. שימו לב שעם FF-OCM, צפיפות קרטוציטים עשויה להיקבע גם על ידי ספירת קרטוציטים ישירות במבט חתך³³, יתרון פוטנציאלי על פני מיקרוסקופ קונפוקלי, הדורש ספירת קרטוציטים על פרוסות מרובות בפנים. עם זאת, שלא כמו בחולים חיים, שם צפיפות קרטוציטים הוכחה כנמוכה יותר בחולים במחלה מאשר בקבוצת ביקורת רגילה 34,35,36,37 ובקורלציה עם חומרת המחלה ^34,38, זה לא היה המקרה בדגימות רקמת ex vivo אנושיות²⁵ ומחקרים נוספים נחוצים כדי לקבוע אם נדרש מספר מינימלי של קרטוציטים בקרניות התורם כדי לגרום להתאוששות חזותית טובה לאחר ההשתלה., צפיפות קרטוציטים נמוכה ברקמת התורם כמו ברקמה פתולוגית יכולה להיות מוסברת על ידי הזדקנות, אובדן לאחר המוות של תאים המושרה על ידי איסכמיה, ו / או אחסון של רקמת תורם 27,39,40,41. כמו כן יש לציין כי קרניות התורם הרגילות שהתקבלו וצולמו בפרוטוקול זה היו מאוחסנות ובצקתיות או מתנפחות, או הושלכו על ידי בנק העיניים לפני ההשתלה בגלל איכות אנדותל ירודה על פי הסטנדרטים של איגוד בנק העיניים של האיחוד האירופי. אם הדמיית FF-OCM יחד עם הפרוטוקול המתואר היו נכללים בהגדרת בנק העיניים, הקרניות היו בדרך כלל מוערכות במצב רענן יותר ממה שהיה אפשרי כאן, מה שעשוי להשפיע על צפיפות הקרטוציטים.

הפרוטוקול המתואר כאן לניתוח איכות סטרומה יכול להיות מורחב להערכת הממברנה של Descemet, אשר ניתן לפתור גם עם FF-OCM במונחים של עובי ומבנה^21,24. זה עשוי להיות שימושי עבור בחירת רקמות עבור קרטופלסטיקה אנדותל הממברנה של Descemet, שבו קרומים דקים של Descemet עשוי להיות קשה יותר להפריד מן stroma.

לסיכום, FF-OCM מאפשר הערכה מדויקת ואמינה של סטרומה של הקרנית מתורם אנושי במהלך האחסון. על ידי שיפור איכות השתל, להוספת פרוטוקול זה להליכי בנק העיניים הנוכחיים יש פוטנציאל לשפר את הסינון והבחירה של רקמות התורם, ומכאן את התוצאות של קרטופלסטיקה. שילוב בחיים האמיתיים של מכשיר FF-OCM בשגרת בנק העיניים צריך להיות קל יותר על ידי עדכונים טכנולוגיים אחרונים, כולל רכישת תמונה מהירה יותר ושדה ראייה גדול יותר הודות לפיתוח מצלמת CMOS מותאמת אישית, ועיצוב קלטות חד פעמיות סטריליות בהתאמה אישית לאחסון וטיפול בקרנית במהלך ההדמיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Light-CT Scanner	LLTech, France	http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/	FF-OCM device used in this manuscript for imaging
CorneaJet	EuroBio, France	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html	Organ culture medium in which donor corneas are stored
CorneaMax	EuroBio, France	http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html	Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence
Fiji (ImageJ)	National Institute of Health, Bethesda, MD, USA	https://fiji.sc/	Open source image processing software
Matlab	Mathworks, Inc., Natick, MA, USA	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Mathematical computing software