תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

John G. Lehman; Robert D. Causey; Cristina V. LaGrasta; Albert L. Ruff

doi:10.3791/57372

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

Abstract

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. טיפולים toxicant-induced פציעה קרניות הן בדרך כלל תומכת הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. ב המאמצים לפתח טיפולים ותרופות לטיפול בחשיפה, זה יכול להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים הסלולר המולקולריים של הפציעות. אנו מציעים כי ניצול תפוקה גבוהה קטן מעכבות ההקרנה RNA (siRNA) יכול להיות כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. siRNA הם כפול נטושים מולקולות RNA 19-25 נוקלאוטידים ארוך, לנצל את הגן post-transcriptional להשתיק מסלול ארוך mRNA אשר יש הומולוגיה ל siRNA. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. פיתוח, אימות של במבחנה חשיפה מודלים ושיטות תפוקה גבוהה הקרנת (HTS) של מימן פלואוריד-(HF) ו- chloropicrin-(CP) המושרה חבלה עינית מוצגים במאמר זה. למרות בחרנו אלה שני חשיפה לרעלים, השיטות שלנו חלים במחקר של חשיפה לרעלים אחרים עם שינויים מזעריים פרוטוקול החשיפה toxicant. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות וייצור IL-8 נבחרו נקודות קצה בפרוטוקול ההקרנה. מספר אתגרים הקשורים עם הפיתוח של חשיפה toxicant, שיטות התרבות תאים מתאימים ללימודי HTS מוצגים. הקמת HTS מודלים עבור חשיפה לרעלים אלו מאפשר מחקרים נוספים להבין טוב יותר את מנגנון הפגיעה, למסך הרפוי פוטנציאל כימי חבלה עינית.

Introduction

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. למרבה הצער, טיפולים toxicant-induced פציעה הקרנית רק תומכות באופן כללי כפי הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. אסטרטגיית הטיפול הנוכחי הוא לא ספציפית וכולל בעיקר אקטואלי טיפולים רפואיים כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, ואחריו cycloplegics דלקתיות (למשל, סטרואידים) פעם הקרנית יש מחדש epithelialized¹ ^,². למרות האפשרויות הטובות ביותר הנוכחי טיפולית זמינה, הפרוגנוזה לטווח ארוך היא ירודה עקב ערפול הקרנית מתקדמת ו-²^,כורוידאלית³.

מודלים בעלי חיים באופן מסורתי שימש לחקור רעילה ולהבין מנגנונים של פציעה. עם זאת, מחקרים שנעשו בבעלי חיים הם זמן רב ויקר. ישנם גם המאמצים לצמצום הניסויים בחיות. לדוגמה, להגיע חקיקה (EC 1907/2006) באיחוד האירופי כולל מגוון הוראות שנועדו להפחית את הניסויים בחיות. התנאים כוללים דרישה לחברות לשתף את הנתונים כדי למנוע חיות בדיקות וקבלת אישור מהסוכנות הכימיקלים האירופי לפני ביצוע בדיקות המוצע על בעלי חיים. לפי קביעותיה של יד, ניסויים בבעלי חיים צריך להיות המוצא האחרון. יש גם אירופה קוסמטיקה תקנה (EC 1223/2009) בהדרגה בדיקה של קוסמטיקה בבעלי חיים. כאשר נערכים מחקרים שנעשו בבעלי חיים, הם מונחים על ידי העקרונות של 3Rs (עידון, צמצום, והחלפת), המספקות מסגרת עבור ביצוע מחקר בבעלי חיים אנושית יותר, להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים ושימוש חלופות לניסויים בבעלי חיים במידת האפשר. מסיבות אלו, בתחום של הרעלים יש ביקשו לאמץ מבחני במבחנה יכולה לספק תובנות המנגנונים המולקולריים של רעילות, יכולה להיעשות תפוקה גבוהה⁴. זה גישה פונקציונלית הרעלים שבו חשיפה לרעלים מוגדרים על-ידי הפונקציה שלהם במקום אך ורק הכימיה שלהם. לקחו צעד נוסף, פונקציונלי toxicogenomics מבקשים להבין את תפקידים גנים ספציפיים לשחק את ההשפעות של חשיפה לרעלים⁵. עם היישום של טכנולוגיה siRNA, מסכי לחקור את פונקציית ג'ין מולקולרית, תאית התגובות חשיפה לרעלים יכול להיעשות על תפוקה גבוהה. siRNA הם כפול מולקולות RNA נטושים המהווים 19-25 נוקלאוטידים ארוך זה את היתרון של ג'ין תעתיק פוסט נוכח תאים בתרבית של כל⁶שתיקה מסלול. אלה הם לאכסון גרם, שנועדו למטרה גנים ספציפיים. כאשר הציג לתוך תא, siRNA מעובד, גדיל אחד, סטרנד מדריך, הוא נטען לתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC). SiRNA מנחה את RISC לאזור משלימים ב מולקולת mRNA, RISC מבזה את ה-mRNA. התוצאה היא הפחתת ביטוי גנים ספציפיים. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. גישה כזו שימש להבין עוד יותר את המנגנונים של רגישות ריצין ומעגל תלויי-אמפר לשעה של⁷^,CYP1A1⁸.

הרשימה הערכת הסיכון טרור כימי (CTRA), את הרישומים כימיקלים תעשייתיים רעילים (טיק) יש מפורטות כימיקלים בחירה המבוססת על שלהם רעילות ופוטנציאל להשתחרר במהלך טרור, לוחמה או אירוע תאונה תעשייתית⁹. אנחנו הם מיישמים תפוקה גבוהה של siRNA ההקרנה (HTS) toxicogenomic גישת המחקר של CTRA רשימה חשיפה לרעלים, אשר זוהו להיות בסיכון גבוה של שימוש באירוע טרור. טוקסיקולוגיה מסורתי החותר להבין את ההשפעות השליליות שיש כימיקלים על היצורים החיים; עם זאת, יש לנו שאיפה נוספת להבין את המנגנונים של פגיעה לצורך הסברה הפיתוח של הרפוי, גישות טיפוליות, וייתכן, כדי לגלות את מולקולות אשר ניתן לפלח לפיתוח טיפולית. את המאמץ הזה במובנים מסוימים עשויים להיחשב מקביל לשימוש של ההקרנה siRNA תפוקה גבוהה והתא המבוסס על מבחני תהליך הגילוי סמים¹⁰. ההבדל גדול יהיה שגילוי סמים בדרך כלל מחפש מטרה יחידה טיפולית גילוי ואילו בגישה שלנו זה במידת מה לא סביר שיהיה שם יעד יחיד עם ערך טיפולי רב לטיפול של חשיפה toxicant. אנו צופים כי כל פרדיגמה טיפול יעיל לחשיפה toxicant ידרוש גישה רב-תחומית כדי להשיג ערך טיפולי רב, toxicogenomic נתונים חיוני יכול לעדכן את הפרדיגמה של טיפול יעיל.

Benchtop אוטומציה מביא תפוקה גבוהה מתודולוגיה מעבדות בחוץ תעשיות פרמצבטיות או ביוטכנולוגיה. מחקרים במבחנה במכון שלנו היו מבחני מסורתי אשר תפוקה נמוכה¹¹^,¹²^,¹³. בשנים האחרונות, המעבדה שלנו עברה לקביעת השימוש benchtop רובוטיקה לבצע סינון siRNA תפוקה גבוהה. במסמך זה, אנו מציגים את העידון של התא עינית מודלים ופיתוח של במבחנה שיטות חשיפה מימן פלואוריד (HF) ו chloropicrin (CP) מתאימה להקרנה siRNA תפוקה גבוהה. המטרה שלנו היא לזהות מולקולות המסדירים הסלולר פגיעה בתגובה חשיפה לרעלים אלו. המטרות של הספרייה siRNA בחרנו כוללים G-חלבון בשילוב קולטנים חלבונים kinases, פרוטאזות, phosphatases, תעלות יונים, מטרות נוספות שעשויות להיות druggable. HF ו- CP נבחרו למחקר נצליב CTRA רשימת סוכנים עם הדיווחים ToxNet של תאונות תעשייתיות כדי למצוא את אלה שמציגים הסיכון הגדול ביותר לפגיעה עינית באמצעות אדים חשיפה⁹^,¹⁴. CP (כתיב כימי Cl₃מפקדת₂, מספר CAS 76-06-2) שימש במקור גז מדמיע ב מלחמת העולם הראשונה¹⁵. הוא משמש כיום וגם fumigant החקלאי של פונקציות כמו nematicide ', ' פטריות, חרקים¹⁶. מימן פלואוריד (HF) משמש בתהליכי כולל אלקילציה בתי זיקוק לנפט, fluorination אלקטרוכימי של תרכובות אורגניות¹⁷. HF (נוסחת הכימי HF, מספר CAS 62778-11-4) הוא גז אבל בצורתו מימית הוא חומצה הידרופלואורית (HFA, CAS מספר 7664-39-3). לכן, אנחנו נבחר להשתמש HFA בתא שלנו בתוך מודלים חשיפה. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות ו- the marker דלקתיות IL-8 נבחרו כמו נקודות הקצה כי מטרות המעורבים פציעה הסלולר אמורה להשתקף בשעת המוות התא ואת התגובה דלקתיות. באופן ספציפי, אם המטרה לשחק תפקיד מגן חשיפה toxicant, מוות של תאים ו/או ייצור ציטוקינים דלקתיים צריך להגדיל כאשר הביטוי היעד מעוכבת על ידי siRNA. ההפך יהיה נכון לגבי מטרות כי תפקיד שלילי. בנוסף, דלקת כרונית מופיע לשחק תפקיד בפתולוגיה הקרנית לאחר חשיפה, התערבות במשעולים מוות התא עשוי לשפר את התוצאה הקלינית²^,¹⁸.

Protocol

1. תא תרבות תחזוקה

לגדל את שורת התאים SV40-HCEC-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו- 90% לחות DMEM F-12 עם 15% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, 10 µg/L גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו- 5 מ"ג/ליטר אינסולין.
מעבר לקו תא כל 3-4 ימים (תלוי צפיפות זריעה) כדי להבטיח כי confluency אף פעם לא עולה 80% בזמן תחזוקה תרבות.
ניתוק תאים מן המבחנות באמצעות ניתוק פתרון (14 מ ל פתרון עבור כל הבקבוק² ס מ 150) הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ- 8 דקות.
לנטרל את הפתרון ניתוק עם אמצעי אחסון שווה תא תרבות בינוני, גלולה התאים 50 מ ל צינורות חרוט על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 160 x g.
מחדש להשעות בגדר תא בינוני (20 מ"ל עבור כל הבקבוק² 150 ס"מ).
לספור את התאים עם מונה אוטומטי תא כף-יד, זרע במבחנות חדשות-צפיפות שיאפשר להם לגדול במשך 3 עד 4 ימים מבלי לחרוג confluency 80%.

2. צלחת תאים לניסויים

בדוק צלוחיות של SV40-HCECs על ידי מיקרוסקופ אור ניגודיות שלב על מנת להבטיח את confluency נמצא במרחק של פחות מ- 80%, ולהעריך בריאות כללי.
ניתוק, גלולה, resuspend, נחשב SV40-HCECs מן המבחנות כמתואר בצעדים 1.3 ל 1.6 של תחזוקה התרבות התא. השתמש בינוני SV40-HCEC המכילות הידרוקורטיזון 0.5 µg/mL (HCORT בינוני) כדי resuspend תאים.
בבקבוק בינונית חד פעמית, להכין השעיה של SV40-HCECs-תאים למ"ל 17,857 בינוני HCORT מראש ומחוממת.
1. להכין נפח מספיק של התא הבולם מספר הצלחות כדי להיות נזרע.
2. זרע מינימום של 14 x 96-ובכן צלחות עם תאים עבור כל צלחת ספריית siRNA שילמדו.
מערבולת מהבקבוק באופן שווה להשעות את התאים, שופכים את נפח מספיק של התליה תא לתוך מאגר על הקן תפקודי לב / נשימה של מטפל נוזלי אוטומטיות, ולאחסן את הבקבוק המכיל התליה תא על 37 ° C ההתחממות צלחת במהלך ציפוי תא תהליך.
השתמש המטפל נוזלי אוטומטית כדי להוסיף תאים צלחות על צפיפות של תאים 1000 לכל טוב (5000 תאים/cm²) ב- µL 70 בינוני לכל טוב של צלחת 96-ובכן. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
1. הפעל את תפקודי לב / נשימה-100 סל"ד ללא הרף במהלך תהליך זריעה.
2. לערבב התליה תא שלוש פעמים (140 µL מיקס נפח) בעזרת המטפל נוזלי אוטומטית.
3. האחות µL 140 של התליה תא, לוותר על 70 µL לתוך כל טוב של שתי צלחות התרבות תאים.
4. חזור על שלבים הנגן 2.5.3 ו 2.5.4 עד כל הצלחות יש כבר נזרע עם תאים.
5. מילוי מחדש המאגר התליה תא לפי הצורך במהלך תהליך זריעה.
אחרי יש כבר נזרע את הצלחות, להסיר אותם מן המטפל נוזלי אוטומטיות, דגירה אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני העברת אותם במדגרה תרבות התא.
הערכת הצפיפות התא של כל טוב על כל צלחת למחרת באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית אשר ממוקם בבניין של חממה תרבות תא ולהשמיט לצלחות מן המחקר אשר להם בארות פנים שאינם בין 15% ל- 22% confluent.

3. transfect את התאים עם siRNA

לרכוש siRNA צלחות ספריית מהספק מוגדרת מראש להכיל מטרות siRNA 80 לכל צלחת (ראה איור 4), עם עמודות 1 ו-12 נשאר ריק.
לשקם siRNA ספריית לצלחת עם מאגר siRNA כדי ריכוז סופי של pmol/µL 2 עבור כל טוב של siRNA לפי הוראות היצרן¹⁹.
Transfect התאים 24 שעות לאחר זריעה ועם 4 pmol/טוב של siRNA µL 0.3/טוב של ריאגנט תרביות תאים. לבצע את כל השלבים לפי הפרוטוקול של היצרן ריאגנט תרביות תאים (ראה איור 4 לפריסה צלחת)²⁰.
1. לבצע את כל transfections באמצעות מטפל נוזלי אוטומטיות ולאחר שימוש של 25 µL/s מהירות pipetting עבור כל השלבים. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות להיות transfected.
2. השתמש העליון חצי צלחת הספריה כדי transfect סט של שש צלחות שכפל המכונה "טופ צלחת ערכת" (שש משכפל לכל siRNA, n = 6).
3. להשתמש בתחתית חצי צלחת הספריה כדי transfect קבוצה שונה של שש צלחות שכפל המכונה "בתחתית צלחת ערכת" (שש משכפל לכל siRNA, n = 6).
4. משתמשים במונח "צלחת מלאה קבע" כדי לתאר את הצלחות תא 12 זה יש כבר transfected עם ספריית siRNA.
5. Transfect וולס B2-B6 של כל לוחות קבע צלחת מלאה עם בריכה שלילי siRNA לאחר כל הערכות צלחת העליון והתחתון יש כבר transfected עם ספריית siRNA.
6. גם transfect בארות B2-B6 של עוד שתי צלחות, אינם מקבלים siRNA ספריה, ישמש הפקדים סמויה (אחד עבור ערכת הפלטה) ואחד עבור ערכת צלחת התחתון, עם בריכה שלילי siRNA.
תקופת דגירה כל תא הצלחות בחממה התרבות תאים של 4 שעות לאחר כל תרביות תאים mixes נוספו ושילוב מאת עדין הקשה בכל שעה.
שימוש מטפל נוזלי אוטומטית כדי לשטוף את כל בארות של צלחות פעמיים עם מדיום HCORT מראש ומחוממת מדולל 1:5 ב- PBS. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
1. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך מאגר פסולת.
2. להוסיף מכל טוב 100 µL/קידוח בינוני HCORT מראש ומחוממת מדולל PBS ב 1:5 אשר מכילה מאגר שונים-נפח מספיק של מספר הצלחות.
3. חזור על הצעדים 3.5.1 ו 3.5.2 כל צלחת.
  1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
  2. מילוי המאגר HCORT בינונית מדולל 1:5 ב- PBS כנדרש.
4. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך המאגר פסולת.
Refeed כל בארות של הצלחות עם 100 µL/טוב מראש ומחוממת HCORT בינוני, אשר מכילה מאגר שונים בווליום די בינוני למשך מספר הצלחות.
1. מילוי מחדש המאגר בינונית כנדרש.
השתמש בארות C2 C6 של כל לוחות כפקדי שאינם transfected.
לשמור בארות B7-B11 C7-C11 של כל לוחות שאינם transfected כדי לשמש כפקדי הרכב והסמים לחשיפה toxicant.

4. refeed התאים הבאות יום

השתמש מטפל נוזלי אוטומטית כדי refeed כל בארות של הלוחות. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
1. האחות µL 100 מכל קידוח ולמחוק את זה לתוך מאגר פסולת.
2. Refeed כל טוב עם 100 µL/טוב מראש ומחוממת HCORT בינונית מכילה מאגר שונים והוא בעל נפח מספיק של בינוני למשך מספר הצלחות כדי להיות refed.
3. חזור על שלבים 4.1.1 ו 4.1.2 כנדרש, כדי refeed כל תא הצלחות.
  1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
  2. מילוי מחדש המאגר בינונית כנדרש.

5. לשלוט תוספת

יומיים לאחר תרביות תאים, שעתיים לפני החשיפה, להכין פתרון מיקרומטר 62.5 של cardamonin לשלוט במדיום HCORT כדי לשמש עבור חשיפות HFA ולהוסיף שורה B של מאגר דילול 8-שורה.
1. חשיפה CP, להכין ולהשתמש פתרון מיקרומטר 25 של SKF 86002.
2. להכין אמצעי שליטה חיובית מספיק עבור מספר צלחות להיבדק.
להכין פתרון 0.625% של דימתיל סולפוקסיד במדיום HCORT (בקרת הרכב) ולהוסיף השורה C של המאגר אותו.
1. חשיפה CP, להכין ולהשתמש פתרון 0.5% של דימתיל סולפוקסיד.
2. להכין אמצעי השליטה הרכב מספיק עבור מספר צלחות להיבדק.
השתמש המטפל נוזלי אוטומטי כדי להוסיף פקדים חיובי והרכב בארות B7-B11 ו C7-C11 של כל צלחת תא ולהשתמש pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות אשר יקבל את הפקדים חיובי והרכב.
1. להסיר µL 10 בינוני מבארות B7-B11 ו C7-C11 של כל צלחת תא וזורקים אותו לשורות G ו- H של המאגר 8-שורה דילול.
2. להעביר 10 µL של הפקדים חיובי והרכב מאותן בארות ומערבבים 3 פעמים.
לחזור הלוחיות תא החממה.
חזור על השלבים 5.3 ל 5.4 עד כל הצלחות תא קיבלו חיובי ופקדים הרכב.

6. HF חשיפה של תאים בתרבית

התראה: HFA הוא מאכל רעילים בחריפות.

לבצע את כל הפעולות לכימיקלים בשכונה fume כימי לובש זוגי nitrile כפפות, מעיל מעבדה, מגיני שרוול פוליאתילן חד פעמיות, בטיחות משקפיים.
1. רוכשים HFA כפתרון 48%.
2. לדלל HFA 1% במים הנדסה גנטית ולאחסן ב 5 מ ל aliquots ב- 10 מ"ל הקיר עבה פוליאתילן בקבוקונים לשיפור הבטיחות.
3. Decontaminate פיפטה טיפים ומקווי יש במגע HFA, כל שאריות HFA נוזלי עם אדל 2.5% לפני סילוק בזרם פסולת מסוכנת.
על כל צלחת ספריית siRNA תחת חקירה, להכין פתרון בינוני HFA 0.0036% על-ידי הוספת 288 µL של 1% HFA 80 מ של מדיום HCORT מראש ומחוממת בבקבוק 150 מ.
1. מערבולת מהבקבוק, דגירה HFA שתדללו ב חממה 37 ° C בשכונה fume כימי 10 דקות.
לערבב את הפתרון בינוני HFA שוב על ידי מתערבל הבקבוק ולהוסיף הפתרון בינוני HFA מאגר מגיב על צלחת חמה.
לבצע את החשיפה עם שני טכנאים עבודה משותפת.
1. יש את הטכנאי µL נכון לשאוב 100 מכל הבארות פנים של צלחת התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולאחר מכן להעביר את הצלחת לטכנאי בצד השמאל.
2. יש את הטכנאי בצד השמאל להוסיף µL 100 לכל טוב של הפתרון HFA בינוני.
3. חזור על שלבים 6.4.1 ו 6.4.2 עבור כל לוחות תא כי הם להיחשף toxicant.
4. גם חזור על שלבים 6.4.1 ו 6.4.2 עבור לוחות הבקרה שלא נחשפו, ניצול בינוני HCORT טריים במקום הפתרון HFA בינוני.
למקם את הצלחות בחממה הוד fume כימיים עבור 20 דקות, ואז לחזור עליהם בחממה התרבות תאים.
חזור על השלב תוספת בקרה חיובית (שלבים 5.1 5.5) כאמור המוצגות לאחר כל הצלחות חשוף, חזר החממה התרבות תאים.

7. CP חשיפה של תאים בתרבית

התראה: CP הוא בחריפות רעילים, מכשלה.

לבצע את כל הפעולות לכימיקלים בשכונה fume כימי לובש זוגי nitrile כפפות, מעיל מעבדה, מגיני שרוול פוליאתילן חד פעמיות, בטיחות משקפיים.
1. רוכשים CP.
2. לדלל CP 5% ב דימתיל סולפוקסיד ולאחסן ב 10 מ ל aliquots ב- 10 מ"ל בקבוקונים נצנוץ לשיפור הבטיחות.
3. Decontaminate פיפטה טיפים ומקווי יש במגע עם CP ו- CP נוזלי שאריות של כל עם 2.5% ביסולפיט לפני סילוק בזרם פסולת מסוכנת.
להכין את נפח מספיק של טרום ומחוממת בינוני HCORT המכיל 1 x עט/סטרפ, PBS ומחוממת מראש עבור מספר צלחות חשוף.
עבור כל ערכה העליון הצלחת להגדיר או צלחת התחתון, להוסיף µL 8.04 של 5% CP in דימתיל סולפוקסיד aliquot 50 מ של טרום ומחוממת HCORT בינונית, מערבבים היטב עבור ריכוז CP הסופי של 0.0008%. קאפ הצינור בחוזקה, דגירה הפתרון 37 ° C חממה בשכונה fume כימיים עבור 1 h.
1. זמן התוספת של CP aliquots 50 מ של מדיום כך כל חשופות העליון הצלחת להגדיר להגדיר צלחת התחתון מקבל toxicant בדיוק 1 h לאחר CP נוספה את aliquot 50 מ של מדיום.
הסרת העליון הצלחת להגדיר ואת הבקרה שלא נחשפו 1 צלחת החממה תרבות תא ולמקם אותם בשכונה fume כימי סמוך לסוף תקופת הדגירה.
לערבב את הפתרון CP על-ידי היפוך הצינור, ואז decant אותו אל מאגר ריאגנט בסוף תקופת הדגירה 1 h.
לבצע את החשיפה עם שני טכנאים עבודה משותפת.
1. יש את הטכנאי µL נכון לשאוב 100 מכל הבארות פנים של צלחת התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולאחר מכן להעביר את הצלחת לטכנאי בצד השמאל.
2. יש את הטכנאי בצד השמאל להוסיף µL 100 לכל טוב של הפתרון בינוני CP.
3. חזור על הצעדים 7.6.1 ו 7.6.2 כל לוחות התא העליון צלחת ערכת להיחשף toxicant.
4. גם חזור על הצעדים 7.6.1 ו 7.6.2 לוחות הבקרה שלא נחשפו, ניצול בינוני HCORT טריים במקום הפתרון בינוני CP.
מקם את הצלחות 37 ° C חממה בשכונה fume כימית למשך 10 דקות.
להוסיף נפח מספיק של PBS ו HCORT בינוני המכיל 1 x אפשרות למצוא עט כדי ריאגנט מאגרים סמוך לסוף תקופת הדגירה 10 דקות.
להסיר את הפתרון CP צלחות התא באמצעות pipettor ערוץ 12 ולהחליף אותו עם µL 100 לכל טוב של PBS בסוף תקופת הדגירה 10 דקות.
מיד להסיר את PBS תא צלחות ולהחליף אותו עם µL 100 לכל טוב של HCORT בינוני המכיל 1 x עט/סטרפ.
גם חזור על שלבים 7.9 ו 7.10 עבור לוחות הבקרה שלא נחשפו.
להחזיר את הצלחות תא חממה התרבות תאים סטנדרטית.
חזור על הצעדים 7.3 כדי 7.12 ערכת צלחת התחתון.
חזור על השלב תוספת בקרה חיובית (שלבים 5.1 5.5) כאמור תיאר לאחר כל הצלחות חשוף, חזר החממה התרבות תאים.

8. לטעום אוסף ואת וזמינותו הכדאיות תא

עשרים וארבע שעות לאחר החשיפה, להכין פתרון של המצע MTT 0.5 מ"ג/מ"ל ב- PBS המכיל 10 גרם/ליטר גלוקוז וחם עד 37 ° C²¹. הכינו 10 מ"ל של מצע על כל צלחת להיות לבדיקה.
עבור מספר צלחות ניתן לבדיקה, להוסיף נפח מספיק של פתרון המצע MTT מאגר על מטפל נוזלי אוטומטית.
השתמש המטפל נוזלי אוטומטית כדי לאסוף דגימת ולהוסיף MTT המצע באמצעות pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים. להגדיר מראש עצה התיבות כדי לטפל רק מאותן בארות כדי להיות לבדיקה.
1. וביופסיה 95 µL של המדיום מן הבארות 60 הפנימי של התא לצלחת, וכן פיקדון 42.5 µL לתוך כל אחד שתי צלחות אחסון 384-. טוב.
2. מיד להוסיף הצלחות תא µL 100 לכל טוב של הפתרון המצע MTT, דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס חממה התרבות התא עבור 1.5 h.
3. מילוי מחדש המאגר עם פתרון המצע MTT כנדרש.
דגירה הלוחות תא ב- 37 מעלות צלזיוס חממה התרבות התא מאובטח.
לאטום את הצלחות 384-ובכן אחסון ואחסן אותם ב- 80 ° C לצורך ניתוח מאוחר יותר.
חזור על הצעדים 8.3 ל 8.5 כל הערכות צלחת העליון והתחתון ושל הפקדים סמויה המשויך.
1. שימוש חוזר טיפים בין משכפל אם רצוי, אבל לשטוף אותם בעת הוספת MTT המצע פתרון ומגדיר בעת מעבר בין צלחת.
לאחר הדגירה 1 h, להוסיף נפח מספיק של דימתיל סולפוקסיד מאגר על מטפל נוזלי אוטומטית.
השתמש המטפל נוזלי אוטומטי כדי להוסיף דימתיל סולפוקסיד ולהשתמש pipetting µL/s 50 מהירות עבור כל השלבים.
1. האחות µL 100 מכל הבארות הפנימי של הלוחות תא ולמחוק את הפתרון המצע MTT לשמורה פסולת.
  1. רוקן המאגר פסולת כנדרש.
2. כיסוי כל טוב עם 100 דימתיל סולפוקסיד µL.
  1. מילוי מחדש המאגר דימתיל סולפוקסיד כנדרש.
לנער את הצלחות על צלחת מטרף למשך 3 דקות.
למדוד ספיגת ב nm 570, 690 באמצעות ספקטרופוטומטרים על צלחת.
להחסיר את הרקע ולחשב את הכדאיות תא % על-ידי חלוקת הערכים ספיגת חשוף באמצעות הפקדים סמויה. להשתמש בפקד siRNA הממוצע בריכה שלילית סמויה לחישוב הכדאיות תא % עבור כל המטרות.

9. מדד IL-8 ריכוז תא תרבות Supernatants

למדוד הריכוז של IL-8 ב supernatants תרבות התא באמצעות לא רחץ מבוסס-חרוז assay לפי הוראות היצרן²². ליצור פריסה של צלחת assay כדי להתאים עקומה סטנדרטי ודוגמאות.
להסיר את הלוחות 384-ובכן אחסון מהמקפיא-80 ° C, להפשיר בטמפרטורת החדר, בקצרה centrifuge הלוחות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הבארות.
עבור מספר צלחות assay לפעול, לעשות נפח מספיק של אנטי-IL-8 מקבל ושרשרות נוגדן anti-IL-8 biotinylated במאגר assay כלול בערכה. להשתמש על היחס של 50 µL של חרוזים מקבל anti-IL8 ו- µL 50 של נוגדן anti-IL8 biotinylated 9.9 מ ל assay מאגר.
1. שימוש של pipettor רב-ערוצי, להוסיף תערובת חרוז/נוגדן צלחת שחור האחסון 384-. טוב.
  1. להוסיף מקבל חרוז/נוגדן הבארות המיועד לשימוש עבור עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
  2. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
לשקם IL-8 סטנדרטי כדי 1000 pg/mL באמצעות בינוני התרבות התא המכיל מיקרומטר 354 NaCl. ליצור אמצעי אחסון מספיק עבור מספר צלחות assay להתנהל.
להפוך שמונה דילולים טורי כפולה של העקומה סטנדרטי.
להוסיף את עקומת סטנדרטי שהפקידים הבארות המתאים של צלחת שחור האחסון 384-ובכן לפי התוכנית צלחת וזמינותו. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
1. באופן דומה, להוסיף בינוני התרבות התא המכיל מיקרומטר 354 NaCl עם אין IL-8 על רקע מדידה.
להשתמש מטפל נוזלי אוטומטית כדי לבצע את הבדיקה. השתמש בתיבות קצה מוגדרות מראש כדי לטפל רק הבארות שקבעו את הפריסה צלחת וזמינותו. השתמש µL 50/s מהירות pipetting עבור כל השלבים.
1. העברת µL 8 של תערובת חרוז-נוגדן מקבל הבארות של הלוחות רדוד 384-ובכן assay טוב לבן.
  1. להוסיף רק הבארות המיועדים עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
2. העברת µL 2 של העקומה סטנדרטי הבארות המתאים של הלוחות רדוד assay טוב לפי התוכנית צלחת וזמינותו.
3. להכין פתרון NaCl 3.54 מ' ולהוסיף אמצעי אחסון מספיק עבור מספר צלחות ניתן לבדיקה כדי מאגר רדוד על המטפל נוזלי אוטומטית.
4. התאם את ריכוז המלח הדגימות כדי להתאים של העקומה סטנדרטי על ידי העברת 4.5 µL של הפתרון NaCl הדגימות לוחית שחור האחסון 384-. טוב.
5. לערבב את הדגימות שלוש פעמים באמצעות אמצעי אחסון ערבוב של 30 µL, העברת 2 µL של הדגימות ללבן רדוד טוב assay צלחות לפי התוכנית צלחת וזמינותו.
  1. לשנות טיפים בין לוחות דגימה.
6. תקופת דגירה של h 1 בחושך בטמפרטורת החדר.
7. עבור מספר צלחות assay לפעול, לעשות נפח מספיק של חרוזים מקבל במאגר וזמינותו. השתמש את היחס שבין 200 µL של מקבל משני חרוזים 12.3 מ ל assay המאגר.
8. שימוש של pipettor רב-ערוצי, להוסיף חרוזים משני צלחת שחור האחסון 384-. טוב.
  1. להוסיף חרוזים משני הבארות המיועד לשימוש עבור עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות.
  2. להוסיף נפח מספיק לכל טוב עבור מספר צלחות assay להתנהל.
9. משתמש המטפל נוזלי אוטומטי, העברה 10 µL של חרוזים משני הבארות של הלוחות לבן assay טוב רדוד 384-. טוב.
  1. רק להוסיף הבארות שקיבלו עיקול רגיל לפי התוכנית צלחת assay ודוגמאות ולשטוף את הטיפים בין כל צלחת.
10. תקופת דגירה של עוד שעה בחושך בטמפרטורת החדר.
חותם וזמינותו צלחות עם לנקות צלחת חותמות וסרוק באמצעות קורא צלחת תואמת וזמינותו. השתמש 0.2 mm המרחק בין צלחת, גלאי, 180 ms עירור, וזמן 550 ms מדידה עבור הסריקה.
לייבא את הנתונים הגולמיים מבחני IL-8 לתוך גיליון אלקטרוני.
השתמש אוטומטית עקומה פולינומיאלית על העקומה סטנדרטי של מבחני IL-8 ולאחר מכן להמיר את הנתונים הגולמיים pg/mL עבור כל דגימה.

תוצאות

פיתוח שיטות חשיפה

אנו מעודן, הערכת ההתאמה של הקו תאי אפיתל הקרנית אדם SV40-HCEC לשימוש במחקרים השודדים. SV40-HCEC היו מונצחים באמצעות SV-40 גדול T אנטיגן, היו מתנה חבר Dhanajay²³. היו יותר מדי משתנים בציורו חשיפה פיתוח מתודולוגיה להצ...

Discussion

במסמך זה אנו מתארים תוצאות ושיטות שלנו על הפיתוח של תפוקה גבוהה קרנית תא אפיתל הקרנת מודל המחקר של פציעות HF ו- CP. אנו מציגים גם את התוצאות מהמסך הראשי siRNA HF להיפצע. היו אתגרים רבים לפיתוח מודלים HTS לצורך המחקר של פציעות טיק. שיטות שיכולנו למצוא בספרות הקשורים בחקר HF, HFA או CP במודלים התרבות התא ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

כתב ויתור: הדיעות במאמר זה הם אלה של והמלצה ולא לשקף את המדיניות הרשמית של המחלקה של הצבא, ההגנה או ממשלת ארה ב. מחקר זה נתמך על ידי הסכם הסוכנויות בין NIH/NIAID את USAMRICD, באופן חלקי על ידי פעילות התוכנית השתתפות מחקר לתארים מתקדמים-ארה ב צבא רפואי מחקר מכון כימי ההגנה מנוהל על ידי האלון רכס מכון המדע והחינוך באמצעות הסכם הסוכנויות בין משרד האנרגיה האמריקני USAMRMC.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מוסדות של בריאות לנטרל תוכנית הסוכנויות הסכם # AOD13015-001. ברצוננו להודות סטפני פרוברג והרסט פיטר על המאמצים שלהם והמומחיות הפקות וידאו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting

References

Randleman, B., Hampton, R. . Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).
Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. . Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).
Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
Ruff, A. L., Dillman, J. F. Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
. . Toxnet. , (2016).
Bancroft, W. D. . The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).
. . Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).
Aigueperse, J., et al. . Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
. . Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).
. . Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).
Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
. . IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).
Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
. . GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).
Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. . Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).
Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
. . ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).
Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136 Chloropicrin siRNA

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: