JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Высокая пропускная способность небольшой тормозящий РНК скрининга является важным средством, которое могло бы способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. Здесь мы представляем, разработки и проверки воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности скрининга индуцированной фтористого водорода и хлорпикрина эпителиальных травмы роговицы.

Аннотация

Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. Лечение для токсикант индуцированной повреждение роговицы в целом поддерживают как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. В усилиях по разработке методов лечения и терапии для ухода за воздействия он может быть важно понимать молекулярных и клеточных механизмов этих травм. Мы предлагаем, что использование высокой пропускной способности небольшой тормозящий РНК (siRNA) скрининга может быть важным инструментом, который может способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. siRNA, двойной мель молекулы РНК которые длиной 19-25 нуклеотидов и использовать post-transcriptional экспрессию путь к деградации мРНК гена имеющие гомологичностью к siRNA. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. В этой статье представлены разработки и проверки в vitro воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности, скрининг (HTS)-фтористый водород (HF) и хлорпикрина (CP) индуцированной глазные травмы. Хотя мы выбрали этих двух токсикантов, наши методы применимы к изучению других ядовитых веществ с незначительными изменениями в протоколе токсиканта экспозиции. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и производства ИЛ-8 были выбраны в качестве конечных точек в протоколе проверки. Представлены методы культуры клетки, подходящие для HTS исследования и несколько проблем, связанных с развитием токсиканта воздействия. Создание моделей HTS для этих ядовитых веществ позволяет дальнейшие исследования, чтобы лучше понять механизм травмы и экран для потенциальных терапии для химических глазные травмы.

Введение

Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. К сожалению лечение токсикант индуцированной повреждение роговицы только в целом поддерживают, как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. Текущая стратегия лечения неспецифических и главным образом включает в себя актуальные терапевтических процедур, таких как смазки, антибиотики, и cycloplegics следуют противовоспалительные средства (например, стероиды) когда роговица заново грануломах1 ,2. Несмотря на лучших текущие терапевтического лечения вариантов Долгосрочный прогноз обычно плохо из-за прогрессивного помутнение роговицы и неоваскуляризации2,3.

Животные модели традиционно использовались для изучения токсичности химических и понять механизмы повреждения. Однако исследования на животных, трудоемким и дорогим. Есть также усилия по сокращению животных испытаний. Например законодательство REACH (ЕС 1907/2006) в Европейском союзе имеет положения, призванные уменьшить животных испытаний. Положения включают требование компании обмениваться данными с целью избежать животных тестирования и получения одобрения от Европейского Химического Агентства до выполнения предложенных испытаний на животных. Согласно положениям ДОСЯГАЕМОСТИ испытания на животных должно быть последним средством. Существует также Европейский Косметика Регламент (EC 1223/2009), поэтапное тестирование косметики в животных. Когда проводятся исследования на животных, они руководствуются принципами 3Rs (уточнение, сокращение и замены), которые обеспечивают основу для выполнения более гуманных исследований на животных, уменьшая количество животных, используемых и использования альтернатив без использования животных там, где это возможно. По этим причинам поле токсикологии стремилась принять в vitro анализов, которые может обеспечить понимание молекулярных механизмов токсичности и может быть сделано в более высокой пропускной способностью4. Это подход, функциональные токсикологии, где токсикантов определены их функции, а не только их химии. Шаг дальше, функциональные токсикогеномике стремятся понять роль(и), что конкретные гены играют в воздействии ядовитых веществ5. С применением технологии siRNA экраны расследовать ген функции в молекулярных и клеточных ответов токсикантов может быть сделано с высокой пропускной способностью. двойной мель молекулы РНК, которые 19-25 нуклеотидов, длинные, что воспользоваться пост транскрипционный анализ гена глушителей пути в всех mammalian клеток6siRNA. Эти синтетически сделал и направленная на конкретный ген. Когда введена в ячейку, обрабатывается siRNA и одной нити, нити руководства, загружается в РНК-комплекс (RISC). SiRNA направляет RISC на взаимодополняющих региона в молекуле мРНК, и RISC снижается мРНК. Это приводит к снижению экспрессии определенных генов. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. Такой подход был использован для более глубокого понимания механизмов рицин восприимчивость и индукции AHR-зависимые CYP1A17,8.

Оценки риска химического терроризма (CTRA) список и токсических промышленных химикатов (TIC) списки расписаны выберите химических веществ на основе их токсичность и потенциал, чтобы быть выпущен во время террористической, войны или промышленной аварии событий9. Мы применяем siRNA высокой пропускной способности, скрининг (HTS) toxicogenomic подход к изучению CTRA список ядовитых веществ, которые были определены на высокий риск использования в террористических целях. Традиционные токсикологии стремится понять неблагоприятные воздействия химических веществ на живых организмов; Однако, у нас есть еще желание понять механизмы повреждения с целью информирования развитие терапии и терапевтических подходов и, возможно, обнаружить молекул, которые могут быть направлены терапевтических развития. Эти усилия в некоторых отношениях можно считать аналогично использованию высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга и ячейки на основе анализов в процесс обнаружения наркотиков10. Основное отличие бы что что лекарств обычно стремится особой мишенью для терапевтических обнаружения, в то время как в наш подход несколько маловероятно, что будет сингулярных цели с высокую терапевтическую ценность для лечения токсиканта воздействия. Мы ожидаем, что любой парадигмы эффективного лечения для экспозиции токсиканта потребует многогранного подхода к достижению высокую терапевтическую ценность, и toxicogenomic данных жизненно могут сообщить парадигмы эффективного лечения.

Benchtop автоматизации приносит высокую пропускную способность методологии в лабораториях за пределами фармацевтической и биотехнологической промышленности. В vitro исследования в нашем институте исторически традиционной анализов, которые имеют низкую пропускную способность11,12,13. В последние несколько лет наша лаборатория перешел к использованию benchtop робототехники для выполнения высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Здесь мы представляем уточнение модели глазной клеток и развитие в vitro методы воздействия фтористого водорода (HF) и хлорпикрина (CP) подходит для высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Наша цель – определить молекулы, которые регулируют клеточных повреждений в ответ на эти токсикантов. Целей siRNA библиотеки, которую мы выбрали включают G белка-рецепторы, протеинкиназы, протеаз, фосфатаз, ионных каналов и других потенциально druggable целей. ВЧ и CP были отобраны для исследования перекрестных CTRA список агентов с ToxNet доклады промышленных аварий найти тех, которые представляют наибольшую опасность глазных травм через пара воздействия9,14. CP (химическая формула Cl3CNO2, номер КАС 76-06-2) первоначально использовался как слезоточивый газ в первой мировой войне15. В настоящее время он используется в качестве сельскохозяйственного фумигант и функции как нематоцидной, фунгицидов и инсектицидов16. Фтористый водород (HF) используется в процессах, включая алкилирования нефтеперерабатывающих и электрохимическое фторирование органических соединений17. ВЧ (химическая формула HF, номер КАС 62778-11-4) газ, но в виде водного раствора кислоты фтористоводородной раствор (ЗДВ, CAS номер 7664-39-3). Таким образом, мы избрали использование ЗДВ в нашей в ячейки модели воздействия. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и воспалительных маркер ИЛ-8 были отобраны как конечные точки, потому что цели, которые участвуют в клеточном травмы должны быть отражены в смерти клетки и воспалительной реакции. В частности если целевой играть защитную роль в экспозиции токсиканта, гибель клеток и/или воспалительных цитокинов производства следует увеличить когда целевое выражение тормозится siRNA. Обратное было бы верно для целей, которые играют негативную роль. Кроме того хроническое воспаление, как представляется, играть определенную роль в патологии роговицы после облучения и вмешательство в pathways смерти клетки может улучшить клинические исходы2,18.

протокол

1. клетки культуры обслуживания

  1. Расти клеток линии SV40-НСЕС при 37 ° C, 5% CO2и 90% влажности в среде DMEM F-12 с 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% L-глютамином, 10 мкг/Л эпидермального фактора роста (EGF) и 5 мг/Л инсулина.
  2. Проход линия клетки каждые 3 до 4 дней (в зависимости от густоты посева) для обеспечения, что confluency никогда не превышает 80% во время культуры обслуживания.
  3. Отсоедините клетки из колбы с помощью отряда (14 мл раствор для каждый флакон2 150 см) и инкубации при 37 ° C не более 8 мин.
  4. Нейтрализовать отряд решение с равным объемом клеток питательной среды и Пелле клетки в 50 мл конические трубы центрифугированием за 7 минут при 160 x g.
  5. Вновь приостановите Пелле клеток в средних (20 мл на каждый флакон2 150 см).
  6. Подсчет количества ячеек с счетчик автоматизированной ручной клеток и семян в новые колбы в плотности, что позволит им расти 3 до 4 дней не превышает 80% confluency.

2. плита клетки для экспериментов

  1. Проверьте, фляги SV40-HCECs, свет фазово-контрастной микроскопии для обеспечения что confluency меньше чем 80% и оценить общую камеру здоровья.
  2. Отсоединить, пеллет, Ресуспензируйте и рассчитывать SV40-HCECs из колбы, как описано в шагах 1.3-1.6 клетки культуры обслуживания. Используйте SV40-НСЕС носитель, содержащий гидрокортизона 0,5 мкг/мл (средний HCORT) для Ресуспензируйте клетки.
  3. В одноразовые средних бутылку Подготовьте подвеска SV40-HCECs на 17,857 клеток/мл в подогретым HCORT среде.
    1. Подготовьте достаточное количество суспензию клеток количество пластин для заполнения.
    2. Семя минимум 14 x 96-луночных плит с ячейками для каждый siRNA библиотека пластины необходимо изучить.
  4. Вихрем бутылку, чтобы равномерно приостановить клетки, налить достаточного объема суспензию клеток в водохранилище на орбитальный шейкер гнездо обработчика автоматизированной жидких и хранить флакон, содержащий суспензию клеток на 37 ° C потепления тарелку в ячейки покрытия процесс.
  5. Используйте автоматизированных жидких обработчик для добавления ячеек в 70 мкл среднего за хорошо 96-луночных плиты пластины на плотности 1000 ячеек на колодец (5000 клеток/см2). Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Постоянно во время процесса инициализации запустите орбитальный шейкер при 100 об/мин.
    2. Перемешать суспензию клеток, три раза (140 мкл микс тома) с помощью автоматического жидкого обработчика.
    3. Аспирационная 140 мкл суспензии клеток и отказаться от 70 мкл в каждой скважине двух плит культуры клеток.
    4. Повторите шаги 2.5.3 и 2.5.4, до тех пор, пока все пластины были посеяны с ячейками.
    5. Пополните водохранилище подвеска клеток, при необходимости во время процесса инициализации.
  6. После того, как пластины были посеяны, удалите их из обработчика автоматизированных жидких и инкубировать их на 30 минут при комнатной температуре до их перевода в инкубатор культуры клеток.
  7. Оцените плотность ячеек каждый хорошо для каждой пластины следующее утро с использованием автоматизированной системы обработки изображений, которая размещается в инкубатор культуры клеток и исключить любые пластины из исследования, которые имеют интерьер скважин, которые не находятся между 15% и 22% притока.

3. transfect клетки с малых интерферирующих РНК

  1. Приобрести siRNA библиотека пластины от поставщика, предварительно настроен для содержат 80 siRNA целей каждой пластины (см. Рисунок 4), с колоннами 1 и 12 оставлено пустым.
  2. Воссоздать пластину библиотека siRNA с siRNA буфера до конечной концентрации 2 пмоль/мкл для каждой скважины siRNA согласно инструкции производителя19.
  3. Transfect клетки 24 ч после посева с 4 пмоль/хорошо интерферирующей РНК и 0,3 мкл/хорошо трансфекции реагента. Выполните все шаги согласно протокол transfection реагент производителя (см. Рисунок 4 пластины макета)20.
    1. Выполнять все transfections, с помощью обработчика автоматизированной жидкость и использовать 25 мкл/с скорость дозирования для всех шагов. Использование предварительно настроенных кончик коробки для решения только скважин, которые будут transfected.
    2. Используйте топ, половина из библиотеки пластины для transfect набор из шести реплицировать пластин называют «Верхней пластины набор» (шесть реплицирует в siRNA, n = 6).
    3. Использование нижней половины библиотека плиты к transfect другой набор из шести реплицировать пластин называют «Нижняя плита набор» (шесть реплицирует в siRNA, n = 6).
    4. Используйте термин «Полный набор плита» для описания 12 клеток пластины, которые были transfected с библиотек siRNA.
    5. Transfect скважин B2-B6 всех плит в полный набор плита с отрицательным бассейн siRNA, после того, как все наборы верхней и нижней плиты были transfected с библиотек siRNA.
    6. Также transfect скважин B2-B6 еще две пластины, которые не получают библиотек siRNA и будет служить в качестве неэкспонированные управления (один для набора плиту) и один для нижней плиты набора, с отрицательным бассейн siRNA.
  4. Инкубируйте все ячейки пластины в инкубатор культуры клеток 4 часа после того, как были добавлены все трансфекции смеси и перемешать, нежный, выстукивать каждый час.
  5. Используйте обработчик автоматизированных жидких мыть все скважины пластин дважды с подогретым среднего HCORT развести 1:5 в PBS. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
    2. Добавить в каждый хорошо 100 мкл/также подогретым среднего HCORT разводят в PBS 1:5, которая содержится в различных водохранилище на достаточный объем для количество пластин.
    3. Повторите шаги 3.5.1 и 3.5.2 для каждой пластины.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
      2. Пополнения резервуара с HCORT среднего разводят 1:5 в PBS при необходимости.
    4. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
  6. Refeed все скважины пластин с 100 мкл/также подогретым HCORT среда, которая содержится в различных водохранилище на достаточный объем средств количество пластин.
    1. Наполните резервуар с среднего при необходимости.
  7. Использование скважин С2-С6 всех плит как не transfected элементы управления.
  8. Держите скважин B7-B11 и C7-C11 всех плит transfected использоваться как элементы управления наркотиков и транспортных средств для экспозиции токсиканта.

4. refeed клетки следующий день

  1. Используйте обработчик автоматизированной жидкость для refeed все скважины плит. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл от каждой скважины и отбросить что в резервуар для отходов.
    2. Каждый refeed, хорошо с 100 мкл/также подогретым HCORT среда, которая содержится в различных водохранилище и имеет достаточный объем среднего числа пластины, чтобы быть refed.
    3. Повторите шаги 4.1.1 и 4.1.2 для refeed всех клеток пластины.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
      2. Наполните резервуар с среднего при необходимости.

5. позитивные управления сложения

  1. Два дня после transfection и два часа до облучения, подготовить 62,5 мкм решение позитивного управления cardamonin в среде HCORT использоваться для HFA воздействия и добавить строку B 8-рядных разрежения водохранилища.
    1. Для экспозиции CP готовить и использовать раствор 25 мкм SKF 86002.
    2. Подготовка тома позитивного управления достаточное количество пластин для проверки.
  2. Приготовляют раствор 0.625% ДМСО в HCORT среде (управления транспортного средства) и добавить строку C же водохранилище.
    1. Для экспозиции CP готовить и использовать 0,5% раствор в ДМСО.
    2. Подготовка тома достаточное количество пластин испытываемого транспортного средства управления.
  3. Используйте обработчик автоматизированных жидкость добавить положительный и транспортное средство контроля скважин B7-B11 и C7-C11 каждой ячейки пластины и использовать 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов. Предварительно настроенные подсказка поля используйте для решения только скважин, которые будут получать положительные и транспортного средства контроля.
    1. Удаление 10 мкл среднего из скважин B7-B11 и C7-C11 каждой ячейки пластины и отбросить его в ряды G и H 8-рядных разрежения водохранилища.
    2. Передача 10 мкл положительные и транспортное средство контроля для этих скважин и смешайте 3 раза.
  4. Возвращение этих клеток плит в инкубатор.
  5. Повторите шаги 5.3 до 5,4 до тех пор, пока все ячейки пластины получили позитивные и управления транспортного средства.

6. ВЧ экспозиция культивируемых клеток

Предупреждение: ЗДВ коррозионные и острой токсичностью.

  1. Выполните все операции воздействия химических веществ в химической Зонта, нося двойной нитриловые перчатки, лабораторный халат, одноразовые полиэтиленовые рукава пленки и защитные очки.
    1. Приобрести ЗДВ как 48% раствор.
    2. Разбавляют HFA до 1% сверхчистого водой и хранить в 5 мл аликвоты в 10 мл толстостенные Полиэтиленовые флаконы для повышения безопасности.
    3. Обеззараживанию наконечники и водохранилищ, которые вступили в контакт с ЗДВ и любые остатки жидкости HFA с 2,5% кальция глюконата до удаления в потоке отходов.
  2. Для каждой пластины библиотек siRNA под следствием, подготовить решение средних ЗДВ 0,0036%, добавив 288 мкл 1% ЗДВ по 80 мл подогретым HCORT среды в 150 мл.
    1. Вихрем бутылку и инкубировать и разбавленных ЗДВ в инкубатор 37 ° C в Химический вытяжной шкаф на 10 мин.
  3. Mix решение средних ЗДВ снова закрученного бутылки и добавьте решение средних ЗДВ реагент водохранилища на плиты теплее.
  4. Выполните экспозиции с двух техников, работающих в тандеме.
    1. Техник на правой аспирата 100 мкл каждого из внутренних скважин ячейки пластину, используя канал 12 дозаторов и затем передать пластину техник на левой стороне.
    2. У специалиста на левой стороне 100 мкл на хорошо решение средних ЗДВ.
    3. Повторите шаги 6.4.1 и 6.4.2 для всех клеток пластин, которые должны подвергаться токсикант.
    4. Также повторите шаги 6.4.1 и 6.4.2 экспонированию пластин, используя свежие среднего HCORT вместо решение средних ЗДВ.
  5. Поместите пластины в инкубаторе химического дыма капот для 20 мин и затем вернуть их в инкубатор культуры клеток.
  6. Повторите шаг дополнение положительный контроль (шаги 5.1 до 5,5), как ранее показано раз все пластины были подвержены и вернулся в инкубатор культуры клеток.

7. CP экспозиция культивируемых клеток

Предупреждение: CP является остро токсичные и раздражение.

  1. Выполните все операции воздействия химических веществ в химической Зонта, нося двойной нитриловые перчатки, лабораторный халат, одноразовые полиэтиленовые рукава пленки и защитные очки.
    1. Приобрести CP.
    2. Разбавляют CP до 5% в ДМСО и хранить в 10 мл аликвоты в 10 мл сцинтилляционные флаконы для повышения безопасности.
    3. Обеззараживанию наконечники и водохранилищ, которые вступили в контакт с CP и любые остатки жидкости CP с бисульфит натрия 2,5% до удаления в потоке отходов.
  2. Готовить достаточное количество подогретым HCORT среде, содержащей 1 х перо/воспаление и подогретым PBS для количество пластин подвергаются.
  3. Для каждого набора Топ плита набор или днище, мкл 8,04% 5 CP в ДМСО в 50 мл Алиготе подогретым HCORT среднего и перемешать хорошо для окончательного CP 0,0008% концентрации. Крышка трубки плотно и инкубировать решение в 37 ° C инкубатора в Химический вытяжной шкаф за 1 час.
    1. Время Добавление CP 50 мл аликвоты средних, так что каждый подвергается Топ плита набор и Нижняя плита набор получает токсикант точно 1 час после CP был добавлен в 50 мл Алиготе среды.
  4. Удалить набор верхней пластины и 1 экспонированию пластина из инкубатора культуры клеток и поместите их в химической зонта в конце инкубационного периода.
  5. Mix решение CP, инвертирование трубки и затем декантируют его реагент водохранилище в конце периода инкубации 1 h.
  6. Выполните экспозиции с двух техников, работающих в тандеме.
    1. Техник на правой аспирата 100 мкл каждого из внутренних скважин ячейки пластину, используя канал 12 дозаторов и затем передать пластину техник на левой стороне.
    2. У специалиста на левой стороне 100 мкл на хорошо решение средних CP.
    3. Повторите шаги 7.6.1 и 7.6.2 для всех клеток пластины Top плита набор подвергаться воздействию токсикант.
    4. Также повторите шаги 7.6.1 и 7.6.2 экспонированию пластин, используя свежие среднего HCORT вместо решение средних CP.
  7. Поместите пластины в инкубатор 37 ° C в Химический вытяжной шкаф на 10 мин.
  8. Добавить достаточный объем PBS и HCORT среды, содержащие 1 х перо/Strep реагент резервуаров в конце инкубационного периода 10 мин.
  9. Удаление решения CP из пластин ячейки с помощью дозаторов 12 канал и заменить его 100 мкл на хорошо PBS в конце инкубационного периода 10 мин.
  10. Немедленно удалить PBS из клеток плит и заменить его с 100 мкл на хорошо HCORT среды, содержащие 1 х перо/воспаление.
  11. Также повторите шаги 7.9 и 7.10 для пластин экспонированию.
  12. Возвращение пластин ячейки в инкубатор культуры стандартной ячейки.
  13. Повторите шаги с 7,3 до 7.12 для нижней плиты установить.
  14. Повторите шаг добавление положительный контроль (шаги 5.1 до 5,5), как описано, как только все пластины были подвержены и вернулся в инкубатор культуры клеток.

8. образец коллекции и жизнеспособности Assay клетки

  1. Двадцать четыре часа после облучения, приготовляют раствор 0.5 мг/мл МТТ субстрата в PBS, содержащие 10 г/Л глюкозы и нагреть до 37 ° C21. Подготовка субстрата для каждой пластины быть assayed 10 мл.
  2. Количество пластин для быть assayed добавьте достаточного объема раствора субстрата МТТ водохранилища на обработчик автоматизированной жидкость.
  3. Использование автоматизированных жидких обработчик для сбора образцов и добавления МТТ субстрат с использованием 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов. Предварительная настройка кончик коробки, чтобы решить только те скважин, чтобы быть assayed.
    1. Аспирационная 95 µL из среднего от внутренний 60 скважин клетки пластины, и депозит 42,5 мкл в каждый из двух пластин, 384-ну хранения.
    2. Сразу же 100 мкл за хорошо раствора субстрата MTT на клетки тарелки и инкубировать их при 37 ° C в инкубатор культуры клеток для 1,5 ч.
    3. Наполните резервуар с МТТ раствора субстрата при необходимости.
  4. Инкубируйте сотовый плит при 37 ° C в инкубатор культуры клеток за 1 ч.
  5. Уплотнение 384-ну хранения плит и хранить их в-80 ° C для последующего анализа.
  6. Повторите шаги с 8,3 до 8,5 для всех наборов верхней и нижней плиты и неэкспонированные связанные элементы управления.
    1. Повторное использование советы между реплицирует, если желаемого, но мыть их при добавлении раствора субстрата МТТ и когда переключение между пластиной устанавливает.
  7. После инкубации 1 h добавьте достаточного объема ДМСО в водохранилище на обработчик автоматизированной жидкость.
  8. Использование автоматизированных жидких обработчик для добавления ДМСО и использовать 50 мкл/s закупорить скорость для всех шагов.
    1. Аспирационная 100 мкл каждого из внутренних скважин сотовый плит и отбросить МТТ раствора субстрата в резервуар для отходов.
      1. Пустой резервуар отходов при необходимости.
    2. Наложение каждой скважины с 100 мкл ДМСО.
      1. При необходимости пополните ДМСО водохранилище.
  9. Встряхните пластины на пластины шейкер 3 мин.
  10. Измерьте absorbance на 570 и 690 нм, используя спектрофотометр пластины.
  11. Вычитание фона и рассчитать % жизнеспособность клеток путем деления значения подвергаются поглощения неэкспонированные элементов управления. Используйте элемент siRNA средняя неэкспонированные негативные бассейн для вычисления % жизнеспособность клеток для всех целей.

9. мера ИЛ-8 концентрация в Supernatants культуры клеток

  1. Измерение концентрации ИЛ-8 в supernatants культуры клеток с помощью no мыть на основе бисера пробирного согласно инструкции производителя22. Создание макета пробирного пластины для размещения образцов и калибровочной кривой.
  2. Снимите крышки 384-ну хранения от-80 ° C морозильник, разморозить при комнатной температуре и кратко центрифуга пластины для сбора образцов в нижней части скважины.
  3. Для количество пробирного пластин для запуска сделайте достаточный объем акцептора анти ИЛ-8 шариков и биотинилированным антитела анти ИЛ-8 в assay buffer входит в комплект. Используйте отношение 50 мкл бусины акцептора анти-ИЛ 8 и 50 мкл антител анти-ИЛ 8 биотинилированным 9.9 мл аналитического буфера.
    1. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте смесь из бисера/антитела к пластине черный 384-ну хранения.
      1. Добавьте акцептора шарик/антитела для скважин, предназначенных для использования образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
      2. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
  4. Воссоздания ИЛ-8 стандарт до 1000 пг/мл с использованием клеток питательной среды, содержащие 354 мкм NaCl. Сделайте достаточный объем для количество пробирного пластин для запуска.
  5. Сделайте восемь двойной серийных разведений стандартной кривой.
  6. Добавьте калибровочной кривой в трех экземплярах соответствующие лунки черный 384-ну хранения плиты по данным Пробирной пластины макет. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
    1. Аналогично, добавьте носитель культуры клеток, содержащий 354 мкм NaCl, не ИЛ-8 для измерения фон.
  7. Используйте обработчик автоматизированной жидкость для выполнения assay. Предварительно настроенные подсказка поля используйте для решения только колодцев, макет пластины пробирного назначенных. Используйте 50 мкл/s скорость дозирования для всех шагов.
    1. Передача 8 мкл смеси шарик антитела акцептора лунки белый мелкий 384-Ну хорошо пробирного плит.
      1. Добавьте только для скважин, предназначенных для образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
    2. Передать соответствующие лунки мелкой хорошо пробирного плит согласно пробирного пластины макет 2 мкл калибровочной кривой.
    3. Приготовляют раствор NaCl 3.54 M и добавить достаточный объем для количество пластин к assayed мелкой водохранилище на обработчик автоматизированных жидкость.
    4. Отрегулируйте соль концентрация образцов, чтобы соответствовать стандартной кривой путем передачи 4.5 мкл раствора NaCl образцы в черный 384-ну хранения плит.
    5. Смешайте образцов, три раза с помощью смешивания объем 30 мкл, и передачи 2 мкл образцов в мелкий белый хорошо пробирного пластины по данным Пробирной пластины макет.
      1. Изменить советы между образца пластины.
    6. Инкубируйте 1 час в темноте при комнатной температуре.
    7. Для количество пробирного пластин для запуска сделайте достаточного объема акцептора бусины в assay buffer. Используйте отношение 200 мкл вторичных акцептора бисера 12.3 мл аналитического буфера.
    8. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте средних бусин черный 384-ну хранения пластины.
      1. Добавление вторичного бусины скважин, предназначенных для использования образцов и калибровочной кривой по данным Пробирной пластины макет.
      2. Добавьте достаточный объем за хорошо для количество пробирного пластин для запуска.
    9. Используя обработчик автоматизированных жидкость, передачи 10 мкл вторичного бусы из лунки белый мелкий 384-Ну хорошо пробирного плит.
      1. Добавить только для скважин, которые получены образцы и стандартные кривой по данным Пробирной пластины макет и вымыть советы между каждой плиты.
    10. Инкубируйте еще час в темноте при комнатной температуре.
  8. Уплотнение assay пластины с очистить пластины печатей и сканирование с помощью пластины читатель совместим с assay. Используйте 0,2 мм расстояние между пластиной и детектор, время возбуждения 180 МС и МС 550 измерения времени для сканирования.
  9. Импорт необработанных данных из анализов ИЛ-8 в электронную таблицу.
  10. Использование автоматизированных кривой для стандартной кривой анализов ИЛ-8 и затем преобразовать необработанные данные в ПГ/мл для каждого образца.

Результаты

Разработка метода воздействия

Мы изысканный и оценку пригодности человека роговицы эпителиальных клеток линии SV40 НСЕС для использования в исследованиях HTS. SV40 НСЕС были увековечены с помощью большой T антигена SV-40 и были в под...

Обсуждение

Здесь мы описываем наши методы и результаты на развитие высокой пропускной способности роговицы эпителиальных клеток, скрининг модель для изучения ВЧ и CP травм. Мы также представляем результаты от первичного siRNA экрана для ВЧ травмы. Там было много проблем для разработки моделей HTS для ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Оговорка: мнения, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не отражают официальную политику Департамента армии, министерства обороны или правительства США. Это исследование было поддержано межведомственного соглашения между NIH/NIAID и USAMRICD и частично путем назначения к программе последипломного исследований участия в армии медицинский исследовательский институт химической обороны США в ведении дуб Хребет институт науки и образования посредством межведомственного соглашения между министерством энергетики США и USAMRMC.

Благодарности

Это исследование было поддержано, национальных институтов из здравоохранения противодействовать программа межведомственного соглашения # AOD13015-001. Мы хотели бы поблагодарить Стефани Froberg и Питер Херст за их усилия и опыт на видео-продукции.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bravo liquid handing platformAgilent or equivalentG5409A
Bravo plate shakerAgilent or equivalentOption 159
Bravo 96LT disposable tip headAgilent or equivalentOption 17896-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 17796-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip headAgilent or equivalentOption 179384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tipsAgilent or equivalent19133-212
EnSpire multimode plate readerPerkin Elmer or equivalent2300-0000AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit Perkin Elmer or equivalentAL224Fno-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplatesPerkin Elmer or equivalent6008359
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen or equivalent13778500Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum MediumInvitrogen or equivalent31985070
TrypLE ExpressGibco or equivalent12605010Cell detachment solution
IncuCyte ZoomEssen Instruments or equivalentESSEN BIOSCI 4473Incubator-housed automated microscope
ChloropicrinTrinity Manufacturing or equivalentN/AAcute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture mediumInvitrogen or equivalent11330-057Contains HEPES
Fetal bovine serumInvitrogen or equivalent1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)Invitrogen or equivalentE9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)Invitrogen or equivalent12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)Invitrogen or equivalent15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)Sigma or equivalentH0888-10G
Glucose  (cell culture grade)Sigma or equivalentG7021
PBS  (cell culture grade)Sigma or equivalentP5493
siRNADharmacon or equivalentvarious
Thiazolyl blue tetrazolium bromideSigma or equivalentM5655MTT assay substrate
siRNA bufferThermo or equivalentB002000
96-well cell culture platesCorning or equivalentCLS3595
T150 cell culture flasksCorning or equivalentCLS430825
BSL-2 cell culture hoodNuaire or equivalentNU-540
300 mL robotic reservoirsThermo or equivalent12-565-572 
96 baffled automation reservoirsThermo or equivalent1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottlesCorning or equivalentCLS430282
Microplate heat sealerThermo or equivalentAB-1443A
Microplate heat sealing foilThermo or equivalentAB-0475
CardamoninTocris or equivalent2509Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002 Tocris or equivalent2008Anti-inflammatory, used as positive control
DMSOSigma or equivalentD8418
48% hydrofluoric acidSigma or equivalent339261Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014382
200 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014391
20 μL Single channel pipettorsRainin or equivalent17014392
1000 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17014497
200 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013810
20 μL 12-channel pipettorsRainin or equivalent17013808
Pipettor tips 1000 μLRainin or equivalent17002920
Pipettor tips 200 μLRainin or equivalent17014294
Pipettor tips 20 μLRainin or equivalent17002928
Chemical fume hoodJamestown Metal ProductsMHCO_229
384-well sample storage platesThermo or equivalent262261
Sodium chlorideSigma or equivalentS6191
50 mL conical tubesThermo or equivalent14-959-49A
Serological pipettes 50 mLCorning or equivalent07-200-576
Serological pipettes 25 mLCorning or equivalent07-200-575
Serological pipettes 10 mLCorning or equivalent07-200-574
Serological pipettes 5 mLCorning or equivalent07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cellsN/AN/AThese cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell CounterMillipore or equivalentPHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) InstrumentAffymetrix or equivalent00-0372
Affymetrix 24- and 96-array platesAffymetrix or equivalent901257; 901434
Draegger tube HFDraeger or equivalent8103251
Draegger tube CPDraeger or equivalent8103421
Draegger pumpDraeger or equivalent6400000
Clear Plate sealsResesarch Products International or Equivalent202502
Reagent reservoirsVistaLab Technologies or equivalent3054-1000
XlfitIDBS or equivalentN/AExcel add-in used for automated curve fitting

Ссылки

  1. Randleman, B., Hampton, R. . Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. . Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. . . Toxnet. , (2016).
  15. Bancroft, W. D. . The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).
  16. . . Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. . Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. . . Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).
  20. . . Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. . . IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. . . GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. . Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
  41. . . ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136siRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены