Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

Summary

Organotypic תלת מימדי התרבויות של מאתר utricle, שבלול ב שטיחות נקה קולגן אני ג ' לים שימור רקמות מולדת מורפולוגיה לאפשר גירוי מכני באמצעות התאמה של מטריקס נוקשות, אישור המסירה הגן וירוס בתיווך.

Abstract

אברי החישה של האוזן הפנימית הם מאתגרים ללמוד אצל יונקים בשל הנגישות שלהם כדי מניפולציה ניסויית והתבוננות אופטי. יתר על כן, למרות שיטות חקלאות הקיים לאפשר לפליטת הביוכימי, שיטות אלה אינם מספקים אמצעי כדי לבחון את השפעות כוח מכני וקשיחות ברקמות במהלך הפיתוח של אברי החישה באוזן הפנימית. כאן נתאר שיטת organotypic תלת מימדי התרבות של utricle מאתר ללא פגע, שבלול מתגבר על מגבלות אלה. הטכניקה עבור התאמת מנדנד מטריקס תלת מימדי המתוארים כאן מאפשר מניפולציה של כוח אלסטי מנוגדות של רקמה. שיטה זו ולכן ניתן ללמוד את התפקיד של כוחות מכני במהלך הפיתוח באוזן הפנימית. בנוסף, התרבויות אישור המסירה הגן וירוס בתיווך, אשר יכול לשמש לניסויים רווח, הפסד-של-פונקציה. שיטה זו תרבות משמרת תאים שיער מולדת של תמיכה תאים, משמש חלופה מעולה שעשוי להיות לתרבות דו-ממדית מסורתית של איברי חישה שיווי המשקל ושמיעתיים.

Introduction

כבר בהנחייתם של המחקר של רוב ההיבטים של התפתחות האיברים בתרבית של מערכות במבחנה . שתי השיטות העיקריות המשמשים כיום עבור התרבות של איברי חישה שיווי המשקל: לתרשים¹ וההכנות חסיד² . שתי השיטות היתר החקירה של תא שיער פגיעויות³ והתחדשות^1,4 בתוך חוץ גופית. בנוסף, יש התפקידים התפתחותית של דרגה^5,6,^7,ונ ט⁸, גורם הגדילה באפידרמיס קולטן (EGFR)^9,10 איתות cascades באוזן הפנימית הוקם, בין השאר, באמצעות תרבויות במבחנה של epithelia חושית. עם זאת, צמיחת תאים ובידול נשלטים, לא רק באמצעות איתות על ידי אורגניזם, אלא גם דרך רמזים הפיזי ועל מכניים כגון אנשי קשר המערכת, את הנוקשות של מטריצה חוץ-תאית, ו מכני מתיחה או כיווץ. התפקיד של גירויים מכניים כזה הוא מאתגר לחקור ב האוזן הפנימית המתפתח בתוך vivo. יתר על כן, קיימות שיטות התרבות לתרשים חסיד אינם מתאימים כגון לימודי חוץ גופית בתוך. כאן נתאר שיטת לתרבות organotypic תלת מימד של קולגן אני ג ' לים של נוקשות בדרגות שונות. בשיטה זו במידה רבה שומרת על הארכיטקטורה ויוו של אברי החישה שיווי המשקל, שבלול, מאפשר חקירה של השפעות כוח מכני בהתפתחותם¹¹.

מאחר גירויים מכניים ידועים כדי להפעיל אירועים מולקולריים במורד הזרם, כגון ההיפופוטם איתות לשביל^12,13,14,15, חשוב להיות מסוגל לשלב בין גירוי מכני עם מניפולציות גנטיות הביוכימי. שיטת תרבות המתוארים כאן אישורי המסירה הגן וירוס בתיווך, ולכן ניתן ללמוד מכני וגם מולקולרית איתות במהלך פיתוח באוזן הפנימית¹¹.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות של אוניברסיטת רוקפלר, של אוניברסיטת דרום קליפורניה.

1. (אופציונלי) הכנת קולגן אני הפתרון של הגידים Mouse-tail

הערה: קולגן אני פתרונות זמינים מסחרית. בצע הוראות היצרן להכנה ג'ל.

1. המתת חסד 5-10 עכברים צעירים מבוגר (בן 3-5 שבועות) של כל זן פראי סוג עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש¹⁶. לאסוף את הזנב ולחטא אותם על ידי השוקע אתנול 70% למשך תקופה מינימלית של 4 שעות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הדגירה במשך יותר מ 48 שעות יש להימנע, כפי שהוא מתבטא התייבשות יתר רקמת פוגעת תהליך החילוץ גיד.
2. הסר את העור כל זנב על ידי היכרות עם חתך האורך עם להב סכין היציבה העור שלם עם מלקחיים. להעביר את זנבות עור צלחת פיטרי 100-מ מ מלא עם אתנול 70% נקי וחתכו אותם לחלקים 10 מ מ.
   הערה: למחוק את החלקים הדק של הזנבות, אשר קשה לתמרן.
3. באמצעות מלקחיים, להבטיח שכל קטע של הזנב לתחתית הפטרי ולהשתמש זוג מלקחיים בסדר השני כדי לחלץ את הגידים זנב אחד בכל פעם. סיבי הגיד הפרט צריך להגיח עם התנגדות מינימלית.
   הערה: מלקחיים #5 הישן, משעמם עובד היטב עבור שלב זה.
4. להכין 100 מ של פתרון 0.1% (לפי נפח) של חומצה אצטית במים סטרילי, ברמה המולקולרית ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון זה צלחת פטרי סטריליות 100-מ מ. להעביר את הגידים הפטרי, להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר כדי denature הקולגן.
5. השתמש מספריים אזמל או iridectomy סטרילי עם טיפים בוטה, מעוגל כדי מינצ הגיד לחלקים 1-2 מ מ. להעביר את הגידים טחון שפופרת 50-mL סטרילי ולהוסיף 0.1% חומצה אצטית להביא את אמצעי האחסון 50 מ.
   הערה: להשתמש ארבע או חמש זנבות על כל 50 מ ל חומצה כדי להשיג קולגן אני ריכוז של 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל.
6. להכניס למקרר הקולגן אני הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 48 שעות כדי להקל על דנטורציה של חלבונים מלאה. מערבולת עם מערבולת שולחן להגדיר את מהירות מקסימאלית עבור 1 דקות פעמיים ביום.
7. למדוד את ריכוז חלבון הפתרון באמצעות וזמינותו חומצה bicinchoninic, להתאים את הקולגן אני ריכוז 2.0-2.5 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 0.1% תמיסת חומצה אצטית, וחנות ב 4 º C.
   הערה: קולגן אני הפתרון ניתן לאחסן במשך שנה-שנתיים.
8. (אופציונלי) Centrifuge הקולגן אני הפתרון ב- g x 2,000 עבור h 1-4 ° C ושימוש שקוף העליון השבר (כמחצית האחסון), כדי להשיג קולגן שטיחות ברור ג ' לים בסעיף 4.

2. ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים

1. המתת חסד עכברים בהריון של כל זן עם פחמן דו חמצני לפי הפרוטוקול אושר על ידי ה הרלוונטיים אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש¹⁶. לחלץ, לערוף את העוברים.
   הערה: Lfng-CreER^T2/tdTomato עכברים יכול לשמש כדי לאפשר תיוג קבוע לתמוך תאים עם חשיפה ל 4-hydroxytamoxifen¹⁷.
2. לעקר כל משטחי עבודה, כלי ניתוח, כולל שני זוגות של מלקחיים #5, הסכין שיער¹⁸, על-ידי ניקוי אותם עם 70% אתנול.
3. פיצול כל ראש לשני חצאים על ידי הצגת חתך האורך עם להב האזמל סטרילי או באמצעות שני זוגות #5 מלקחיים. לחלץ עצמות הרקה, להכיל את לאוזניים הפנימיות¹⁹, ומניחים ל-15 מיליליטר של האנק כקרח מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) בצלוחית 60 מ מ. שמור את המנה על קרח.
   הערה: העוברים במגוון שלבים מ E13.5 כדי E18.5 שימשו בהצלחה.
4. (אופציונלי) לשטוף לאוזניים הפנימיות על ידי בעדינות בטילטול 50 מ ל צינור חרוטי המכיל 30 מ ל קרה כקרח HBSS והחלפה של HBSS של שלוש או ארבע פעמים. שמור את הצינורית על קרח.
   הערה: שלב זה מגביל זיהום אפשרי של התרבות רקמות ומביא במהירות את הטמפרטורה עד 4 ° C, המונע מוות השפלה ותא רקמות.
5. באמצעות שני זוגות של מלקחיים #5 בסדר, להפריד לאוזניים הפנימיות הרקה, להעביר את האוזניים, שלושה או ארבעה בכל פעם, לתוך צלחת פטרי 60 מ מ מלא HBSS קר כקרח.
6. לנתח את אברי החישה שיווי המשקל.
   1. אוריינט הצד המדיאלי אוזניים למעלה ואתר את utricle. עם שני זוגות של מלקחיים #5, הסר את הסחוס המקיף של אברי שיווי המשקל. בעדינות סבר העצב vestibular, הקשר בין utricle את saccule, ואת התעלות semicircular, כפי שמוצג באיור1. משוך בעדינות את utricle, את אמפולות המצורפת של התעלות semicircular מעולה ואופקיים מהאוזן.
      הערה: שיטה זו יכולה לשמש על אוזניים הפנימיות של שלבי E16.5 - E18.5. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
7. לנתח שבלול.
   1. הסר את רקמות הסחוס המקיפים את האיבר שמיעה עם שני זוגות #5 מלקחיים. בעדינות לנתק את הקשר בין הבסיס שבלולי saccule כפי שמוצג באיור1.
      הערה: עבור שלבים E13.5 - E14.5, לרכך את הסחוס לפני ניתוח על ידי טיפול הפנימי אוזניים עם collagenase 0.25% אני בפתרון באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשמר את שברי סחוס בסעיף 3 להלן.
8. שימוש pipet 200-µL מצויד טיפ רחב nonstick, להעביר את utricles ואת cochleae צלחת פטרי 30-מ מ מלא עם מדיום הגידול הכוללת DMEM/F12 בתוספת 33 מ מ Dglucose, 19 מ מ סודיום ביקרבונט, 15 מ מ 4(2hydroxyethyl)- חומצה 1piperazineethanesulfonic (HEPES) 1 מ"מ גלוטמין, 1 מ"מ nicotinamide, גורם הגדילה באפידרמיס 20 מ ג/ליטר, 20 מ ג/ליטר פיברובלסט גורם גידול, אינסולין 10 mg/L, transferrin 5.5 מ ג/ליטר, 5 µg/L סודיום סלניט.
9. לשמור על ההכנות utricle עד 3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר ריפוי של קיצוץ האפיתל הציג במהלך הקרע. שבלול הכנות צריך להעביר את הג'ל קולגן 10 דקות לאחר הקרע.
   הערה: כי הקרע מבוצע ב HBSS קר כקרח, שאין אין צורך לחמם את מדיום הגידול כדי 37 מעלות צלזיוס.

3. (אופציונלי) להתאים קולגן אני ג'ל קשיחות על-ידי הוספת ריכוזים שונים של Chondrocytes

הערה: שיטת chondrocyte בידוד שונה מ- Gosset. et al. ²⁰

1. להכין פתרון 1% של collagenase אני עקר 1 x PBS וחנות 100-200 µL aliquots ב-80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח בעת הצורך, הימנעות מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.
2. מלקחיים בסדר להשתמש כדי לאסוף את השברים של הסחוס נשאר ניתוח אברי שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים 10-12. נפרד רקמות החיבור ואת האוזן הפנימית של הסחוס. להעביר את הסחוס צלחת פטרי 30-מ מ ולהוסיף 300 µL של מדיום הגידול סטרילי.
3. השתמש האזמל סטרילי להב או iridectomy מספריים עם טיפים מעוקל בוטה לרכך את הרקמה כדי להשיג חתיכות הסחוס כ 0.5 מ מ אורך.
4. להוסיף collagenase את המדיום עם סחוס כדי להשיג ריכוז האנזים הסופי של 0.25%. להעביר את המנה חממה תרביות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. Pipet נמרצות באמצעות pipet 1,000 µL כל 20 דקות עד חתיכות הסחוס מביצועם הם כבר לא ניתן להבחנה בפתרון, ואז תקופת דגירה של 20 דקות נוספות.
   הערה: במקרה של ההכנות utricle, בידוד chondrocyte יכול להתבצע במהלך שלב 2.9; זה לוקח כ 2 h (3-4 סיבובים pipetting).
5. לאסוף את התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל ולכוונן את העוצמה עד 10 מ"ל עם PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה ב 800 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של PBS x 1 סטרילי. צנטריפוגה-g x 800 עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
   הערה: חשוב לשטוף את התאים פעמיים; כל collagenase הנותרים לעכל הקולגן שאני ג'ל.
6. שימוש pipet 200-µL, להוסיף 100 µL של תרבות בינוני ה תא גלולה ל pipet בעדינות כדי resuspend. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולשמור אותם על קרח לפני השימוש.
7. כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף chondrocytes הקולגן ינוטרלו ג'ל פתרון (סעיף 1). ומערבבים במהירות כדי להפיץ את התאים לאורך כל הג'ל לפני התמצקות.
   הערה: הנפח של הקולגן אני ג'ל (מידת קשיחות), עולה באופן ליניארי עם מספר chondrocytes הוסיף¹¹. הגומלין מתואר על ידי פונקציה לינארית השפעול נחוש E = 206· Nc + 15, שבו E הוא הנפח פסקל ומתגבר, Nc הוא המספר של chondrocytes במיליונים. עבור פרוטוקול מפורט עבור ג'ל קשיחות מדידות נא עיין במאמר המקורי¹¹.

4. מניחים את האיבר חושית שיווי המשקל או שמיעתי ב קולגן שאני ג'ל

1. צינור 1.5-mL סטרילי, להכין קולגן אני הפילמור פתרון על ידי ערבוב µL 160 ל- PBS x 10 עם מחוון ה-pH פנול אדום, 133 µL של 0.34 M נתרן הידרוקסידי, µL 70 של 0.9 M סודיום ביקרבונט µL 40 של 1 מ' HEPES. שמור את הצינורית על קרח.
   הערה: המתכון הזה מספק את הפתרון הפילמור דרושים כדי להכין 2 מ"ל של קולגן ג'ל, אבל ניתן לשנות לפי הצורך.
2. מיקס 100 µL של פתרון פלמור, µL 400 של קולגן אני פתרון על הקרח על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה צינור 1.5-mL צוננת. כדי להגביר את ג'ל קשיחות, להוסיף 50 µL של מדיום הגידול המכיל chondrocytes ולערבב בעדינות כמתואר בסעיף 3.
3. העברת µL 500 של הקולגן ינוטרלו אני הפתרון 30-מ מ פטרי צונן עם הוספת זכוכית 10 מ מהתחתון או טוב של צלחת ארבע-. טוב.
   הערה: חשוב לשמור את כל ריאגנטים על קרח כדי למנוע פלמור מהירה, לא אחיד של הקולגן אני.
4. העבר במהירות את cochleae או utricles כדי לנטרל הקולגן אני הפתרון ולהתאים את האיברים לעמדות הרצוי שלהם עם שיער סטרילי הסכין¹⁸ או זוג מלקחיים בסדר.
   הערה: קולגן אני הפילמור הופך להיות מורגש לאחר 1-2 דקות כמו הפתרון הופך עכורים.
5. לאחר הפתרון סביב הרקמה יש polymerized, למקם את צלחת פטרי או ארבע-ובכן לוח עבור 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו חמצני כדי להבטיח הפילמור מלאה.
6. להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת 0.5% סרום שור עוברית (FBS) לכל צלחת פטרי או 500 µL של המדיום אותו לאדם טוב של צלחת ארבע-. טוב. לשמור על התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני. אם רצונך בכך, תוספת מדיום הגידול עם 10 מיקרומטר 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) לסמן תאים מתרבים.
   הערה: ריכוז FBS גבוה יכול לשמש במקרה הצורך.

5. נגיפי זריקות בתרבויות תלת מימדי של שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

1. מפשירים את הוירוס הרצוי על קרח ומערבבים עם פתרון trypan blue 0.5 mL צינור חרוטי להשגת ריכוז לצבוע הסופי של 0.05%. השתמש 10-20 x צבע כדי למנוע דילול משמעותי של הנגיף. לשמור על הקרח.
   הערה: אדנו אדנו 5 עובד בצורה הטובה ביותר להדביק תאים התומכים ב- utricle¹⁹, ואילו וירוס adeno-הקשורים Anc80 יכול להדביק תאים שיער הן ותמיכה התאים את utricle ואת ה שבלול²¹.
2. לשבור את קצה מחט זכוכית שהוכנו על פולר micropipette עם מלקחיים נקי בסדר תוך התבוננות על זה ברמת ההגדלה הגבוהה ביותר של המשקפת לנתח מיקרוסקופ.
   הערה: חשוב למטב את הגדרות פולר המחט. מחטים עם שאנקס 9 - 12 מ מ ו- 20 - 30-מיקרומטר פתחים פועלות בצורה הטובה ביותר.
3. הסר את תרבות איבר החישה של החממה. לצרף את המחט microinjector ולמלא את זה עם 2-3 µL של תערובת לצבוע ווירוסים. תוחבים את המחט לתוך איבר החישה תוך התבוננות על זה תחת התאום לנתח מיקרוסקופ.
4. לנהוג בעדינות את מחט דרך שכבות mesenchymal ואפיתל של הגג של תרבות utricular תלת מימדי. להזריק את התערובת ויראלי עד החללים של utricle, אמפולות למלא הצבע הכחול.
   הערה: כי זה מאפשר גישה נוחה אל איברי חישה, צלחת פטרי 10 מ מ זכוכית-התחתון היא אופטימלית על הזריקות.
5. דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה ראגנטים בגז עם 5% פחמן דו-חמצני.
   הערה: כאשר חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום נעשה שימוש הבונה ויראלי, ידי קרינה פלואורסצנטית הוא לכאורה 24 שעות לאחר התמרה חושית ויראלי.

תוצאות

אברי החישה שיווי המשקל ושמיעתיים מהאוזניים עובריים, תרבותי ב- 40-Pa קולגן אני ג'לים מחקה קשיות נמוכה תנאים עובריים¹¹, שומרים על מבנים תלת מימדיים רגיל יחסית (איור 1) ולשמור על תאים שיער ו תומכים תאים (איור 2 , איור 3). ...

Discussion

האותות מולקולרית כי הצמיחה התחלקות ובידול באוזן הפנימית במהלך הפיתוח כבר למד בהרחבה^5,6,7,8,9,10. עם זאת, ראיות שהושגו ממערכת דגם utricular מרמז כי רמזים מכני, חש דרך צמתי תא והפעלה של היפו אי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146