Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

Zusammenfassung

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der murinen Utricle und Cochlea in optisch klar Kollagen ich bewahren angeborene Gewebe Morphologie Gele ermöglichen für mechanische Stimulation durch Anpassung der Matrix Steifigkeit und Virus-vermittelten gen Lieferung zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die Sinnesorgane des Innenohrs sind eine Herausforderung, um bei Säugetieren wegen ihrer Unzugänglichkeit experimentelle Manipulation und optischen Beobachtung zu studieren. Darüber hinaus obwohl bestehende Kulturtechniken biochemische Störungen können, bieten diese Methoden keine Mittel zur Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft und Gewebe Steifigkeit während der Entwicklung der Sinnesorgane Innenohr. Hier beschreiben wir eine Methode zur dreidimensionalen organotypischen Kultur der intakten murinen Utricle und Cochlea, die diese Grenzen überwindet. Die Technik für die Anpassung der eine dreidimensionale Matrix Steifigkeit, die hier beschriebenen ermöglicht Manipulation die elastische Kraft gegen Gewebewachstum. Diese Methode kann daher zur Untersuchung der Rolle von mechanischen Kräfte während der Innenohr-Entwicklung. Darüber hinaus erlauben die Kulturen Virus-vermittelten gen Lieferung, die für Gewinn und Verlust-of-Function-Experimente genutzt werden kann. Diese Kultur-Methode bewahrt angeborene Haarzellen und Unterstützung von Zellen und dient als eine potentiell überlegene Alternative zu traditionellen zweidimensionalen Kultur der vestibulären und akustische Sinnesorgane.

Einleitung

Die Studie der meisten Aspekte der Säugetier-Organentwicklung wurde durch in-vitro- Systeme erleichtert. Zwei Hauptmethoden werden jetzt verwendet, für die Kultur der vestibulären Sinnesorgane: freischwebende¹ und anhaftende² Vorbereitungen. Beide Methoden erlauben die Untersuchung der Haarzelle Schwachstellen³ und Regeneration^1,4 in Vitro. Darüber hinaus haben die entwicklungspolitischen Rollen der Kerbe^5,6, Wnt^7,8und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)^9,10 Signalisierung Kaskaden im Innenohr etabliert, unter anderem durch den Einsatz von in-vitro- Kulturen von sensorischen Epithelien. Jedoch sind Zellwachstum und Differenzierung, nicht nur durch die Signalisierung von Morphogens, sondern auch durch physikalische und mechanische Signale z. B. interzellulären Kontakte, der Steifigkeit der extrazellulären Matrix und mechanische Dehnung oder Verengung gesteuert. Die Rolle solcher mechanischer Reize ist eine Herausforderung, in den Entwicklungsländern Innenohr in Vivozu untersuchen. Bestehenden freischwebend und anhaftende Kulturmethoden eignen sich darüber hinaus nicht für solche Studien in Vitro. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale organotypischen Kultur in Kollagen ich Gele unterschiedlicher Steifigkeit. Diese Methode weitgehend bewahrt die in Vivo -Architektur der vestibulären und Cochlea-Sinnesorgane und ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der mechanischen Kraft auf Wachstum und Differenzierung¹¹.

Da mechanische Reize bekannt sind, um nachgeschaltete molekularen Ereignisse, z. B. das Nilpferd Weg^12,13,14,15, Signalisierung zu aktivieren ist es wichtig, mechanische Stimulation kombinieren zu können mit biochemischen und genetischen Manipulationen. Die hier beschriebene Methode Kultur gestattet Virus-vermittelten gen Lieferung und kann daher verwendet werden, um mechanische und molekularen Signalisierung im Innenohr Entwicklung¹¹zu studieren.

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschüsse der Rockefeller University und der University of Southern California zugelassen.

1. (optional) Vorbereitung des Kollagens ich Lösung von Mouse-tail sehnen

Hinweis: Kollagen ich Lösungen sind im Handel erhältlich. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für Gel-Vorbereitung.

1. Einschläfern Sie 5-10 junger Erwachsener (3-5 Wochen alt) Mäusen Wildtyp-Stamm mit Kohlendioxid gemäß dem Protokoll genehmigt von den relevanten institutionellen Animal Care und Use Committee¹⁶. Sammeln Sie die Schwänzen und Desinfizieren sie durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol bei einem Mindestaufenthalt von 4 h bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Für mehr als 48 h Inkubation sollte vermieden werden, da zu übermäßigem Gewebe Dehydrierung führt und die Sehne-Extraktion behindert.
2. Entfernen Sie die Haut jeden Schwanz durch die Einführung eines längs-Schnitt mit einem Skalpellklinge und zurückziehen die ganze Haut mit einer Pinzette. Übertragen Sie die dunkelhäutigen Schwänzen auf einer 100-mm-Petrischale gefüllt mit sauberen 70 % Ethanol und in 10-mm-Segmente schneiden.
   Hinweis: Entsorgen Sie die dünnsten Teile des Tails, die schwierig zu handhaben sind.
3. Mit Pinzette, sichern Sie jedes Segment der Rute auf den Boden der Petrischale zu und verwenden Sie ein zweites Paar feine Pinzette, um die Sehnen vom Heck eine zu einem Zeitpunkt zu extrahieren. Einzelne Sehne Fasern sollten mit minimalem Widerstand entstehen.
   Hinweis: Alte, Matte #5 Pinzetten eignen sich gut für diesen Schritt.
4. 100 mL einer 0,1 % Lösung (nach Volumen) von Essigsäure in sterilen, Molekulare-Grade Wasser bereiten und eine sterile Petrischale 100 mm 10 mL der Lösung hinzufügen. Übertragen Sie die Sehnen in der Petrischale und verlassen Sie ich für 1 h bei Raumtemperatur zu denaturieren die Kollagen zu.
5. Verwenden Sie eine sterile Schere Skalpell oder Iridektomie mit stumpfen, gebogene Spitzen, um die Sehne in 1 – 2 mm Fragmente Blatt vor den Mund. Übertragen Sie die Hackfleisch / sehnen, ein steriles 50-mL-Röhrchen und fügen Sie 0,1 % Essigsäure um die Lautstärke auf 50 mL zu bringen.
   Hinweis: Verwenden Sie vier oder fünf Schwänzen für je 50 mL Säure, ein Kollagen zu erreichen ich Konzentration von 2,0-2,5 mg/mL.
6. Kühlen Sie das Kollagen ich Lösung bei 4 ° C für mindestens 48 h, komplettes Protein-Denaturierung zu erleichtern. Wirbel mit einer Tischplatte Vortex soll die maximale Geschwindigkeit für 1 min zweimal am Tag.
7. Die Proteinkonzentration der Lösung mit der Bicinchoninic Säure-Test zu messen, stellen Sie das Kollagen ich Konzentration auf 2,0-2,5 mg/mL durch Zugabe von 0,1 % ige Lösung von Essigsäure und Store bei 4 ° C.
   Hinweis: Kollagen ich Lösung kann ein bis zwei Jahre lang aufbewahrt werden.
8. (Optional) Das Kollagen Zentrifuge ich Lösung bei 2.000 x g für 1 h bei 4 ° C und die Nutzung der transluzente Top Bruchteil (ca. die Hälfte des Volumens), optisch klare Kollagen zu erreichen in Abschnitt 4 Gele.

2. Präparation des auditorischen und vestibulären Organe

1. Einschläfern Sie Schwangere Mäusen Belastung mit Kohlendioxid gemäß dem Protokoll von den relevanten institutionellen Animal Care und Use Committee¹⁶genehmigt. Extrahieren und die Embryonen zu enthaupten.
   Hinweis: Lfng-CreER^T2/tdTomato Mäuse können verwendet werden, ermöglichen dauerhafte Kennzeichnung von Stützzellen nach Exposition gegenüber 4-Hydroxytamoxifen¹⁷.
2. Sterilisieren Sie alle Arbeitsflächen und Dissektion Instrumente, darunter zwei Paare von #5 Zangen und ein Haar Messer¹⁸, mit 70 % igem Ethanol reinigt.
3. Jeder Kopf in zwei Hälften durch die Einführung eines längs-Schnitt mit einem sterilen Skalpellklinge oder mithilfe von zwei Paaren von #5 Pinzetten aufgeteilt. Extrahieren Sie die Temporal Knochen, die die inneren Ohren¹⁹enthalten, und legen Sie sie in 15 mL eiskaltes Hank ausgeglichene Salzlösung (HBSS) in einer Petrischale 60 mm. Halten Sie die Schüssel auf dem Eis.
   Hinweis: Embryonen bei einer Reihe von Phasen von E13.5 bis E18.5 sind erfolgreich benutzt worden.
4. (Optional) Waschen Sie die inneren Ohren durch Schütteln sie vorsichtig in ein 50 mL konische Röhrchen mit 30 mL eiskaltes HBSS und ersetzen die HBSS drei-oder viermal. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
   Hinweis: Dieser Schritt begrenzt mögliche Kontamination der Gewebekultur und bringt schnell die Temperatur um 4 ° C, die Erniedrigung und Zelle Absterben von Gewebe verhindert.
5. Mit zwei Paaren von feinen #5 Pinzetten, trennen Sie die inneren Ohren aus dem Felsenbein und übertragen Sie die Ohren, drei oder vier in einer Zeit, in eine 60 mm Petrischale gefüllt mit eiskalten HBSS.
6. Die vestibulären Sinnesorgane zu sezieren.
   1. Orientieren Sie die Ohren medialen Seite oben zu und suchen Sie die Utricle. Entfernen Sie mit zwei Paaren von #5 Pinzetten den Knorpel umgibt die vestibulären Organe. Trennen Sie vorsichtig Nervus Vestibular, die Verbindung zwischen der Utricle und Gleichgewichtsorgan und Bogengängen, wie in Abbildung 1dargestellt. Ziehen Sie vorsichtig die Utricle und die beigefügten Glasphiolen von superior und horizontale Bogengängen aus dem Ohr.
      Hinweis: Diese Methode kann auf inneren Ohren Stufen E16.5 - E18.5 verwendet werden. Bewahren Sie die Knorpel-Fragmente für Abschnitt 3 unten.
7. Die Cochlea zu sezieren.
   1. Die knorpelige Gewebe um das Hörorgan mit zwei Paaren von #5 Zange zu entfernen. Trennen Sie vorsichtig die Verbindung zwischen der Cochlea-Basis und das Gleichgewichtsorgan, wie in Abbildung 1dargestellt.
      Hinweis: Für Stufen E13.5 - E14.5, den Knorpel vor Dissektion erweichen durch die Behandlung der Inneres Ohren ich mit 0,25 % Kollagenase Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Bewahren Sie die Knorpel-Fragmente für Abschnitt 3 unten.
8. Mit einem 200-µL-Pipettieren mit einer breiten beschichteten Spitze ausgestattet, der Utricles und Cochleae auf einer 30-mm-Petrischale gefüllt mit Wachstumsmedium bestehend aus DMEM/F12 ergänzt mit 33 mM Dglucose, Natriumbicarbonat 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - übertragen 1piperazineethanesulfonic Säure (HEPES), 1 mM Glutamin 1 mM Nicotinamid, 20 mg/L epidermalen Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 mg/L, 10 mg/L Insulin, 5,5 mg/L Transferrin und 5 µg/L Natriumselenit.
9. Pflegen Sie die Utricle Vorbereitungen für bis zu 3 h bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast erlauben Heilung der Schnitte in das Epithel, die während der Präparation eingeführt. Cochlea-Vorbereitungen sollten auf das Kollagen Gel 10 min nach der Dissektion übertragen werden.
   Hinweis: Weil die Zerlegung in eiskalten HBSS durchgeführt wird, gibt es keine Notwendigkeit, das Wachstumsmedium auf 37 ° c Vorwärmen

3. (optional) passen Sie Kollagen Gel ich Steifigkeit durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentrationen von Chondrozyten

Hinweis: Die Methode für die Knorpelzelltransplantation Isolierung wurde von Gosset Et Al. modifiziert. ²⁰

1. Bereiten Sie eine 1 % ige Lösung von Kollagenase ich in sterilen 1 x PBS und Speicher 100-200 µL Aliquots bei-80 ° C. Auf dem Eis bei Bedarf Auftauen, mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden.
2. Die Zerlegung der auditorischen und vestibulären Organe von 10-12 Ohren übrig Nutzung feine Pinzette, die Stücke des Knorpels zu sammeln. Separate Bindegewebe und Innenohr Gewebe aus dem Knorpel. Übertragen des Knorpels zu einer 30-mm-Petrischale und fügen Sie 300 µL der sterilen Nährmedium.
3. Verwenden Sie ein steriles Skalpell Klinge oder Iridektomie Schere mit stumpfen gebogenen Spitzen um zu hacken das Gewebe um Knorpel Stücke ca. 0,5 mm in der Länge zu erreichen.
4. Hinzufügen von Kollagenase ich auf das Medium mit Knorpel, eine abschließende Enzym-Konzentration von 0,25 % zu erreichen. Übertragen Sie die Schale in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid vergast. Pipettieren kräftig mit einem 1.000 µL pipettieren alle 20 min bis Stücke des Knorpels distanzieren und unterscheiden sich nicht mehr in der Lösung dann inkubieren eine zusätzliche 20 min.
   Hinweis: Im Falle der Utricle Vorbereitungen kann Knorpelzelltransplantation Isolierung während Schritt 2,9 durchgeführt werden; Es dauert ca. 2 h (3-4 pipettieren Runden).
5. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konische Röhrchen zu und stellen Sie die Lautstärke auf 10 mL mit sterilen 1 X PBS. Zentrifuge bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL sterile 1 X PBS. Bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den überstand zu entfernen.
   Hinweis: Es ist entscheidend für die Zellen zweimal waschen; Alle übrigen Kollagenase wird ich das Kollagen, die, das ich Gel, verdauen.
6. Mit einem 200-µL-pipettieren, hinzu kommen 100 µL Kulturmedium der Zelle Pellet und pipettieren sanft zu Aufschwemmen. Zählen der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer und auf Eis vor dem Gebrauch zu halten.
7. Chondrozyten hinzufügen um Gel Steifigkeit zu erhöhen, die neutralisierte Kollagen ich gel-Lösung (Abschnitt 1) und schnell mischen, die Zellen im ganzen das Gel vor Erstarrung zu verteilen.
   Hinweis: Der Elastizitätsmodul des Kollagen gel ich (ein Maß für die Steifigkeit), steigt linear mit der Anzahl der Chondrozyten hinzugefügt¹¹. Das Verhältnis wird beschrieben durch die experimentell ermittelten lineare Funktion E = 206· NC + 15, in denen E der Elastizitätsmodul in Pascals und Nc ist, ist die Zahl der Chondrozyten in Millionenhöhe. Ein detailliertes Protokoll für Gel entnehmen Steifigkeit Maße Sie bitte den ursprünglichen Artikel¹¹.

4. Legen Sie die vestibuläre oder auditive Sinnesorgan in einem Kollagen, die ich Gel

1. In ein steriles Röhrchen 1,5 mL, bereiten Sie Kollagen ich Polymerisation Lösung durch Mischen von 160 µL 10 X PBS mit Phenol rot pH-Indikator, 133 µL 0,34 M Natronlauge, 70 µL von 0,9 M Natriumbicarbonat und 40 µL 1 M HEPES. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
   Hinweis: Dieses Rezept ist die Polymerisation Lösung 2 mL des Kollagens vorbereiten ich gel, aber kann je nach Bedarf skaliert werden musste.
2. Mix 100 µL der Polymerisation Lösung und 400 µL des Kollagens ich Lösung auf Eis durch sanft nach oben und unten in einem gekühlten 1,5 mL Röhrchen pipettieren. Um Gel Steifigkeit zu erhöhen, fügen Sie 50 µL der Chondrozyten-haltigem Wachstumsmedium hinzu und mischen Sie, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
3. 500 µL des neutralisierten Kollagen zu übertragen ich Lösung auf einer gekühlten 30-mm-Petrischale mit einem 10-mm-Glasboden-Einsatz oder einem Brunnen der vier-Well-Platte.
   Hinweis: Es ist wichtig, alle Reagenzien auf Eis, um zu verhindern, dass schnelle und ungleichmäßige Polymerisation des Kollagens zu halten ich.
4. Schnelle Übertragung von Cochleae oder Utricles auf die neutralisierte Kollagen ich Lösung und stellen Sie die Organe auf ihre gewünschte Position mit einer sterilen Haar Messer¹⁸ oder ein paar feine Pinzette.
   Hinweis: Kollagen ich Polymerisation wird nach 1-2 min spürbar, da die Lösung trüb wird.
5. Nachdem die Lösung, um das Gewebe polymerisiert ist, platzieren Sie die Petrischale oder vier-Well-Platte für 20 min bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator vergast mit 5 % Kohlendioxid um vollständige Polymerisation zu gewährleisten.
6. Fügen Sie 3 mL Wachstumsmedium ergänzt mit 0,5 % fetalen bovine Serum (FBS) pro Petrischale oder 500 µL des gleichen Mediums pro Bohrloch eine vier-Well-Platte. Pflegen Sie die Kultur bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast. Auf Wunsch ergänzen Sie das Wachstumsmedium mit 10 µM 5-Ethynyl-winkel2-Deoxyuridine (EdU), wuchernde Zellen zu kennzeichnen.
   Hinweis: Höhere Konzentrationen der FBS können bei Bedarf verwendet werden.

(5) virale Injektionen in dreidimensionale Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

1. Tauen Sie das gewünschte Virus auf Eis und mischen mit Trypan blau-Lösung in einem 0,5 mL konische Rohr, eine endgültige Farbstoff-Konzentration von 0,05 % zu erreichen. Verwenden Sie 10-20 X Farbstoff um zu erheblichen Verdünnung des Virus zu vermeiden. Halten Sie auf dem Eis.
   Hinweis: Adenovirus Serotyp 5 funktioniert am besten für Stützzellen im Utricle¹⁹, zu infizieren, während Adeno-assoziierten Virus Anc80 beide Haarzellen infizieren kann und Stützzellen in der Utricle und Cochlea-²¹.
2. Brechen Sie ein Glas Nadelspitze vorbereitet auf einer Mikropipette Abzieher mit sauberen feinen Pinzette während Sie mit der höchsten Vergrößerung ein Fernglas Mikroskop sezieren beobachten.
   Hinweis: Es ist wichtig, um die Einstellungen auf der Nadel Abzieher zu optimieren. Nadeln mit 9 - 12 mm Schäfte und 20 - 30 µm Öffnungen am besten funktionieren.
3. Entfernen Sie eine Sinnesorgan Kultur aus dem Inkubator. Legen Sie die Nadel auf die Microinjector und füllen Sie ihn mit 2-3 µL Farbstoff und Virus-Gemisch. Vorantreiben Sie die Nadel in das Sinnesorgan, während Sie unter dem Binokular Mikroskop sezieren beobachten.
4. Fahren Sie vorsichtig die Nadelspitze durch mesenchymale und epithelialen Schichten des Daches einer dreidimensionalen utricular Kultur. Die virale Mischung zu injizieren, bis die Hohlräume der Utricle und Glasphiolen mit blauen Farbstoff füllen.
   Hinweis: Weil sie leichten Zugang zu Sinnesorgane ermöglicht, ist ein 10-mm-Glasboden-Petrischale optimal für die Injektionen.
5. Inkubation bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % Kohlendioxid vergast.
   Hinweis: Wenn grünes oder rotes fluoreszierendes Protein in der viralen Konstrukt verwendet wird, ist die Fluoreszenz sichtbar 24 h nach virale Transduktion.

Ergebnisse

Vestibuläre und akustische Sinnesorgane aus embryonalen Ohren kultiviert in 40-Pa Kollagen Gele imitiert geringe Steifigkeit embryonalen Bedingungen¹¹, relativ normale dreidimensionale Strukturen (Abbildung 1) behalten und pflegen Haarzellen und Stützzellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Obwohl Zelldichte zu unterstützen um über 30 % verringert (Studenten t -Test:...

Diskussion

Die molekularen Signale, die vermitteln Wachstum und Differenzierung im Innenohr während der Entwicklung wurden studiert ausgiebig^5,6,7,8,9,10. Aus der utricular Modellsystem erlangte Beweismittel deuten jedoch darauf hin, dass mechanische Hinweise, spürte durch Zelle Kreuzungen und die Aktivierung von Hippo-Signalisierung,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Surgical Blades	Miltex	4-110
#5 Forceps	Dumont	11252-20
100 mm Petri dish	Sigma	P5856-500EA
250 uL large orifice pipette tips	USA Scientific	1011-8406
30 mm glass-bottom Petri dish	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 well plate	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H7904
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acetic acid	Sigma	537020
Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Anti-GFP, chicken IgY fraction	Invitrogen	A10262
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Sox2 Antibody (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Bicinchoninic acid assay	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12	Gibco	11320033
Epidermal growth factor	Sigma	E9644
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Fibroblast growth factor	Sigma	F5392
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
Hemocytometer	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insulin	Sigma	I3536
Iridectomy scissors	Zepf Medical Instruments	08-1201-10
Microinjector	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7.4	Gibco	10010023
Phenol Red pH indicator	Sigma	P4633
Pure Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2716
RFP antibody	ChromoTek	5F8
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium hydroxide	Sigma	S8045
Sodium selenite	Sigma	S5261
Tabletop vortex	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan blue	Sigma	T6146