הגדרת אלקטרוכימי העומד בפני עצמו להעשיר respiring אנודת חיידקים באתר

Summary

באתר מיקרוביאלי העשרה או בחיי עיר הטיפוח-תרגול טכניקות יכול להקל את ניתוקה של taxa חיידקים קשה-עד-תרבות, במיוחד של סביבות נמוך-ביומסה או geochemically קיצוני. כאן, אנו מתארים את הגדרת אלקטרוכימי של ללא שימוש במקור כוח חיצוני כדי להעשיר את זני חיידקים המסוגלים אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET).

Abstract

נשימה אנאירובית בשילוב עם אלקטרון התחבורה המינרלים לא מסיסים (המכונה אלקטרון חוץ-תאית התחבורה [EET]) הוא חשב להיות קריטי עבור הפקת אנרגיה מיקרוביאלי והתמדה בסביבות מהסבא רבים, במיוחד אלה חסר אלקטרון מסוף מסיסים acceptors. בעוד חיידקים בעלי יכולת EET כבר בהצלחה מבודד סביבות שונות, המגוון של חיידקים מסוגלים EET הוא עדיין גרוע. מובן, ובמיוחד קשה-עד-לדוגמה, נמוך אנרגיה או סביבות קיצוניות, כמו רבים מהסבא המערכות האקולוגיות. כאן נתאר מערכת אלקטרוכימי באתר להעשיר חיידקים EET בעל יכולת שימוש אנודת מקבל אלקטרון מסוף הנשימה. אנודת זה מקושר עם קטודה מסוגל ותזרז ירידה בחמצן והאביוטיים. השוואה בין גישה זו עם שיטות electrocultivation להשתמש potentiostat עבור poising האלקטרודה פוטנציאליים, מערכת 2-אלקטרודה לא דורשת במקור כוח חיצוני. נציג דוגמה של העשרה באתר שלנו מנוצל באגם אלקליין-הארזים, אתר serpentinization יבשתי בצפון קליפורניה. ניסיונות קודמים לטפח חיידקים תוך צמצום מינרלים הצליחו להזיזה, אשר סביר עקב האופי נמוך-ביומסה של אתר זה ו/או את השפע יחסית נמוכה של מתכת הפחתת חיידקים. לפני יישום העשרה שלנו שני-אלקטרודה, מדדנו את הפרופיל האנכי של ריכוז חמצן מומס. זה אפשר לנו למקם את הפחמן הרגיש אנודת ופחמן electroplated פלטינה הרגיש קטודית בעומק כי יתמכו מתקנים אנארוביים מעבד, בהתאמה. בעקבות הדגירה באתר, אנו עוד יותר מועשר האלקטרודה אנודי במעבדה, אישר קהילה מיקרוביאלי ברורים לעומת את השטח-attached או קהילות biofilm נצפו בדרך כלל על הארזים. העשרה זו לאחר מכן הוביל את הבידוד של תא החיידק electrogenic הראשון של הארזים. שיטה זו של העשרה מיקרוביאלית באתר יש את היכולת לרומם את הבידוד של חיידקים בעלי יכולת EET מ ביומסה נמוך או קשה דוגמת בתי גידול.

Introduction

מספר החיידקים בהפחתת מינרליים הוכחו מנצלים מינרלים מוצק-שלב כמו acceptors אלקטרון מסוף, על-ידי תהליכים אלקטרונים חוץ-תאית תחבורה (EET) כי התנהלות אלקטרונים החיצוני של התא באמצעות אנזימים חמצון-חיזור¹. EET הוא קריטי, לא רק עבור חיידק-מינרליים תהליכים אבל גם אנרגיה שימושית, טכנולוגיות סביבתיות, כגון חיידקים בתאי דלק², סינתזה אלקטרודה³למצבה⁴. חיידקים בעלי יכולת EET חדשים מבוקשים מאוד, נחקרו בהרחבה מן היסוד או מוחלת פרספקטיבה⁵. עם זאת, אנחנו רק מוגבלת תובנה החשיבות האקולוגית או biogeochemical של חיידקים אלו. הרוב המכריע של חיידקים בעלי יכולת EET היה מבודד בעקבות העשרה אקווה, משקעים או אנאירובית digesters באמצעות acceptors אלקטרון מוצק כגון המפעילים הוירטואליים ובעלי התשתית₂, Fe₂O₃ או אלקטרודות לראיון במעבדה^{6, 7 , 8}. עם זאת, שיטות אלה לעיתים קרובות לייצר קונסורציומים דומה, שעלולים להחמיץ taxa רגישים יותר זה יכול לשלוט באנרגיה נמוכה או מערכות ביומסה נמוך, ממתח היכולת של החיידקים האלה כדי להתאים המעבדה או תרבות axenic הסביבה⁹ . בדרך כלל עבור ביומסה נמוך סביבות, כמויות גדולות של מים מאתר מסוננים להתרכז תאים חיידקיים. אולם, חיידקים בעלי יכולת EET לעתים קרובות להפגין שיטות ההזנה אנאירובית, ולכן החשיפה חמצן עשוי נוסף לעכב או למנוע הטיפוח-תרגול. מתודולוגיות באתר חלופי להתרכז תאים מבלי לחשוף אותם חמצן יכול להקל את הבידוד של חיידקים EET בעל יכולת. כאן, אנו מדווחים פרטים ההתקנה עבור שיטת אלקטרוכימי באתר להעשיר את חיידק בעל יכולת EET על פני תקופה ארוכה של זמן ללא הצורך במקור כוח חיצוני.

באמצעות ניסויים electrocultivation שלנו ממעיין אלקליין מאוד בצפון קליפורניה, ארזים¹⁰, אנו מתארים שיטה אלקטרוכימי באתר זו. ה גאוכימיה של המעיינות בסידרס שמושפעים serpentinization ב תת הקרקע. המעיינות הם מאוד מוטעה, עם ריכוז חמצן מתחת לגבול של זיהוי תחת ממשק מים אוויר סימון הפוטנציאל לייצור אנרגיה חיידקים באמצעות EET זו סביבה פונקציונאלית אנאוקסיים¹¹. עם זאת, יש שום ראיות שיתמכו חיידקים EET בעל יכולת של הארזים (ב- rRNA מטוסי אף-16 או ניתוח Metagenomic). למרות שהסביבה הזאת מלווה כמו מקבל האלקטרונים מוגבל, הפוטנציאל באמצעות מינרלים לא מסיסים כמו acceptors אלקטרון מסוף, כולל מינרלים כמו ברזל חושף מינרלים הנובעים serpentinization (קרי, מגנטיט), לא היתה בהרחבה ובדוקים¹². אנו, לכן, יישמה מערכת אלקטרוכימי שלנו המחנה מעיין, מעיין pH גבוה-הארזים, להעשיר עבור חיידקים (איור1) תומך-EET¹³.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. בניית מערכת דו-אלקטרודה עבור הסביבה דגירה

1. הכנת החומר אנודת וטיפול של פחמן הרגיש אלקטרודה (איור 2).
   1. חותכים הפחמן. הרגישה ממדים שווים בהתאם העשרה ביומסה הרצוי. לטבול כל אלקטרודה 90% אתנול במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף לפחות 8 פעמים עם מים יונים, sonicating עבור 1 דקות לאחר כל שטיפה.
   2. לשטוף את האלקטרודות פעמיים ב- HCl M 1, תוך ערבוב במשך לפחות 12 שעות עבור כל כביסה.
   3. יבש האלקטרודות בתנור חם (37 מעלות צלזיוס) למשך 6-12 שעות או עד חינם של נוזל.
   4. לצרף אלקטרודות טיטניום תיל בעזרת גרפיט אפוקסי לכל הפרוטוקול של היצרן על צלחת טפלון (משטח טפלון).
      הערה: השתמשנו חוט טיטניום בגלל שלה עמידות גבוהה בפני קורוזיה אירובי.
   5. אופים האלקטרודה ב 120 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות.
   6. לבדוק את ההתנגדות בין חוט טיטניום, הרגשתי עם מד התנגדות פחמן לאשר ההתנגדות בין חוט אלקטרודות הרגיש הוא פחות מ 5 אוהם.
2. Electroplation פלטינה על הפחמן הרגיש אלקטרודה עבור הכנת החומר קטודה
   1. להטביע אלקטרודות הרגיש פחמן, מוכן בשלב 1.1, ב- 2 מ' KOH למינימום 12 שעות בתוך מיכל זכוכית.
   2. לניקוי אלקטרוכימי, מקום האלקטרודה עבודה אלקטרודה (WE) כור שלוש-אלקטרודה, המכיל גם הפניה (RE) עם מונה אלקטרודה (CE). לחבר, מחדש, ו- CE potentiostat על ידי תנין קליפים. לאשר כל הקשרים עם מד התנגדות.
      הערה: השתמשנו של Ag/AgCl (אשלגן כלורי רווי) אלקטרודה ופלטינה חוט כמו רי ו- CE, בהתאמה.
   3. פויז האלקטרודה ב V 1.0 vs. Ag/AgCl עבור 600 s בפתרון אלקטרוליט המכיל 2 מ' קו (באמצעות כמות מספקת כדי להטביע את כל אלקטרודה). להוציא את האלקטרודה מן הכור אלקטרוכימי (אשר עשוי זכוכית). לשטוף את האלקטרודה במים יונים לפחות 8 פעמים, sonicating על 1 דקות לאחר כל שטיפה. אלקטרודות יבש ב 100 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 שעות.
   4. כדי להכין ציפוי פתרון, להוסיף 100 גר' חומצת לימון, 5 גר' נתרן גופרתי, 2 גר' dihydrogen hexachloroplatinate (IV) hexahydrate 1 ליטר של חומצה גופרתית 2 מ'.
   5. שוקלים ניקה, אלקטרודות כפי המבושלות צעדים 1.2.1–1.2.2 מיובשות ואז מכסים את האלקטרודה בפתרון ציפוי מוכן בשלב 1.2.3. Sonicate האלקטרודה בפתרון ציפוי שלוש פעמים ב-30 s כל.
   6. Electroplate האלקטרודות מאת poising האלקטרודה פוטנציאליים--0.2 V לעומת Ag/AgCl עבור 460 s בציפוי פתרון. לשטוף אלקטרודות פעמיים במים יונים וזורקים את הפסולת פלטינה.
   7. לשטוף אלקטרודות במים יונים לפחות 3 פעמים, sonicating עבור 20 s לאחר כל שטיפה. שוטפים ללא sonication לפחות שלוש פעמים נוספות.
   8. אלקטרודות יבש ב 100 מעלות צלזיוס במשך לפחות 12 ח' שוקלים אלקטרודה לכמת פלטינה electroplated על הפחמן הרגיש אלקטרודה.

2. בנייה והתקנה של מערכת דו-אלקטרודה

1. חקירת ההתקנה באתר עבור כל אלקטרודה בסביבה הטבעית.
   1. לקבוע ריכוז חמצן באמצעות בדיקה חמצן מומס (DO).
   2. בדוק את עומק פרופיל דו באתר.
      הערה: לתנאי הסביבה הרצויה עבור האנודה הם עקביים הידרציה אנוקסיה. אם רצונך בכך, להסיר את השפעת פוטוסינתזה oxygenic על ידי מיגון האנודה מהאור. תנאים אידיאליים עבור מיקום קטודית בעקביות hydrated, סמוך לפני השטח ווטרס להיות oxic. במידת הצורך, לצרף צף כדי לשמור על מרחק מהמטרה של הקתודה.
2. בניית תא דלק סוג 2-אלקטרודה הדגירה מערכת
   1. מחברים את החוט מבודד באורך הרצוי חוט טיטניום תיל מ האלקטרודות (אנודת אחד, אחד קטודית מצופה פלטינה) על ידי סיבוך שתי השורות. מכסה את החיבורים עם שעווה עמיד במים, הגנה נוספת על שימוש כיתה ימית חום כיווץ שפופרות.
   2. לחבר שני חוטי ועם של הקתודה אנודת מאת הנגד של התנגדות ידועה.
      הערה: במערכות ביולוגיות, נגדים התחתון (10 עד 1,000 Ω) לגרום בפעילות ביולוגי עקבי יותר. אם רצונך בכך, עמידות גבוהה הנגד תמנע פעילות ביולוגית, כפקד שלילי. כדי למנוע קורוזיה של קשרים בין resistor ומוביל, אנחנו מוגנים אותם עם חום הפסיכיאטר צינורות
3. המידה עבור מתח ורישום טמפרטורה לאורך זמן.
   1. בדוק את המתח בין קצות resistor עבור הערכת הייצור הנוכחי של התגובה תא דלק.
   2. למדוד את ההבדל מתח לאורך זמן בעזרת וולטמטר רישום נתונים עם הקשרים המתאימים המוביל אנודת קטודית (ראה הפרוטוקול של היצרן).
      הערה: רישום נתונים טמפרטורה סימולטני הוא אופציונלי, אך מידע זה יכול לסייע מתייחסים לשינויים הנוכחי כדי והאביוטיים בניגוד תנודות ביולוגי.
4. הגנה על לוגר נתונים וחיבורי החשמל
   1. השתמש שקית נייח ו/או פלסטיק כדי להגן על לוגר ועל כל חיבורי החשמל מפני גשם.
   2. לתקן את שקית הניילון והכבלים בחוזקה כדי להגן מפני רוח חזקה. לדוגמה מוצג באיור1.

3. אוסף של המדגם אלקטרודה מן הסביבה הטבעית

1. כדי למנוע את איכות המדגם אנודת להיות ניזוק עקב זיהום החמצן, לאסוף את האלקטרודה בתנאי אנאירובית.
2. לפחות 30 דקות לפני איסוף הדגימה אלקטרודה, הכניסו למבחנה ממיקום אנאירובית. לדוגמה, לשים את מבחנה המכסה בנפרד בתחתית האגם כדי להפוך את הבקבוק בתוך אנאירובית.
3. לחתוך את ההובלה טיטניום של האלקטרודה עם חותך חוט לאסוף את הדגימה אלקטרודה לתוך מבחנה ובעדינות לאטום אותו בשטח מים אנאירובית. כדי לרענן את הדגימה, לאחסן את הדגימה ב 4 ° C מיד לאחר איסוף הדגימה.
   הערה: לחלופין, אלקטרודות ניתן להעביר ישירות לבינונית (N₂ לצמיתות) אנאוקסיים. השתמשנו מדיום ארזים (שתואר על ידי סוזוקי. et al. ¹¹) זה תוכנן מן ה גאוכימיה מימית נמדד באתר ותוקן לספק מספיק חומרים מזינים לצמיחה מיקרוביאלי. מדיה זו שונתה בשביל ניסויי מעבדה שונות.

4. מעבדה אישור עבור הייצור הנוכחי וניתוח הדנ א

1. אישור אלקטרוכימי יכולת הייצור הנוכחי של חיידקים קונסורציומים הצמדת האלקטרודה.
   1. לבנות מטוס^14,כור אלקטרוכימי¹⁵ עם האלקטרודה שנדגמו, חוט פלטינה של Ag/AgCl (אשלגן כלורי רווי) אלקטרודה כפי שאנו, לסה נ, ו רה, בהתאמה, בתוך תא אנארובי. למלא את הכור אלקטרוכימי ארזים בינוני המכילים פחמימות מסיסים התורמים אלקטרון.
   2. שלווה האלקטרודה פוטנציאליים-+0.2 V לעומת Ag/AgCl ולמדוד הייצור הנוכחי.
2. מיצוי DNA מדגם אלקטרודה באמצעות DNA מיקרוביאלית של קיט (ראה טבלה של חומרים).
   1. החלק הפנימי של הכפפות אנאירובית עם 70% אתנול ונקי לשים קערת סטיריליים על רדיד אלומיניום.
      הערה: תא אנארובי שומר ריכוז חמצן במרחק של פחות מ 1 עמודים לדקה על-ידי שמירה על אווירה מימן בסביבות ~ 2-3% צריכים חמצן בנוכחות זרז פלדיום.
   2. פתח את הכור אלקטרוכימי בתא הכפפות, לשים האלקטרודה מדגם על המנה ולאחר לחתוך לגודל כדי להתאים את הצינור המשמשים את ערכת ה-DNA. להמשיך עם הפרוטוקול של היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הייצור הנוכחי נמדדה בהצלחה במשך כ 3 חודשים באמצעות לוגר נתונים של מתח כמוצג באיור3. הפעם נבחר כפי שהיה תקופת הדגירה יציב הארוך של המעיין, בשל הגשמים חזקה המשפיעים על המעיין. תקופה קצרה יותר יכול להיות מספיק, אבל פרק זמן ארוך יותר יכול לספק העשרה חזקה של ביומ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר שתואר, אנו מראים את העשרת של קונסורציום מיקרוביאלי, מקושר עם בחיי עיר הייצור הנוכחי. אומד הדפוסים שנצפו בתמיכה מיקרוביאלי הפעילות הנוכחית במערכת זו לאורך זמן קצר וארוך. השלב הקריטי עבור בניית מערכת תפקודית שני-אלקטרודה (סוג תא דלק) הוא בזיהוי וניצול מיקום עם אורווה במפלס המים וש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon felt sheet	n/a	n/a	Used for anode and cathode
Titanium wire	The Nilaco Cooporation	TI-451485	Used to construct fuel cell system
Graphite epoxy	Electrolytica lnc.	n/a	Used to connect the electrodes and Ti wire
Drying oven	Yamato	DY300	bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy
Digital multi meter	Fluke	616-1454	to check the ohmic value of resistance
Dissolved oxygen probe	Sper Science	#  850045	to check the oxygen concentration in the environments
Resistor	Sodial		Used to construct fuel cell system
Conducting wire	Pico	81141s	Used to construct fuel cell system
Voltmeter and Data logger	T&D corporation	VR-71	Used for data recording
Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate	wako	18497-13-7	Used for electropolation
Citric acid	Wako	038-06925	Used for electropolation
Sulfuric acid	Wako	192-04696	Used for electropolation
HCl	Wako	083-01095	Used for electrode washing
Glass cylinder	N/A	N/A	Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base	N/A	N/A	Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber	N/A	N/A	Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa	GL Science	3007-16101	Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode	GEOMATEC	No.0001	Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode	HOKUTO DENKO	HX-R5	Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire	The Nilaco Cooporation	PT-351325	Used as a counter electrode
NaHCO3	Wako	191-01305	Used for The Cedars Media (CMS)
CaCO3	Wako	030-00385	Used for CMS
NH4Cl	Wako	011-03015	Used for CMS
MgCl2 • 6H2O	Wako	135-00165	Used for CMS
NaOH	Wako	198-13765	Used for CMS
Na2SO4	Wako	194-03355	Used for CMS
K2HPO4	Wako	164-04295	Used for CMS
CABS	SANTA CRUZ	SC-285279	Used for CMS
Incubator	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Used for precultivation
Autoclave machine	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench	SANYO	MCV-91BNF	Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator	Eppendorf	5430R	Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer	SHIMADZU	UV-1800	Used for optimization of cell density
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator	AS ONE	TR-1A	Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage	HOKUTO DENKO	HS-201S	Used for electrochemical experiments
Anaerobic Chamber	COY	TypeB (Vinyl)	TO conduct experiments under anaerobic condition
Ultraclean DNA Extraction kit	MoBio