Self-standing eletroquímica set-up para enriquecer o ânodo-proliferação de bactérias no local

Resumo

Técnicas de cultivo microbianas no local da enriquecimento ou em situ podem facilitar o isolamento dos táxons de difícil-para-cultura microbianos, especialmente de ambientes de baixa biomassa ou geoquímica extremas. Aqui, descrevemos um set-up eletroquímico sem usar uma fonte de alimentação externa para enriquecer cepas microbianas capazes de transporte de elétrons extracelular (EET).

Resumo

Respiração anaeróbica, juntamente com o transporte de elétrons para minerais insolúveis (referido como o transporte de elétrons extracelular [EET]) é pensada para ser crítico para a produção de energia microbiana e persistência em muitos ambientes de subsuperfície, especialmente aqueles falta de aceitadores de electrões terminal solúvel. Enquanto micróbios capazes de EET foram isolados com sucesso de vários ambientes, a diversidade de bactérias capazes de EET é ainda mal compreendida, especialmente em difícil-para-amostra, baixa energia ou ambientes extremos, como muitos subsuperficial ecossistemas. Aqui, descrevemos um sistema eletroquímico no local para enriquecer bactérias EET-capaz usando um ânodo como um aceptor de elétron terminal respiratória. Este ânodo está ligado a um cátodo capaz de catalisar a redução de oxigênio abióticos. Comparar esta abordagem com electrocultivation métodos que usam um potentiostat para equilibrar o potencial de eletrodo, o sistema de dois-eletrodo não requer uma fonte de energia externa. Nós apresentamos um exemplo de nosso enriquecimento no local utilizado em um lago alcalino, cedros, um site serpentinization terrestres no norte da Califórnia. Tentativas anteriores para cultivar bactérias redutoras minerais foram infrutíferas, que é provavelmente devido a natureza de baixa biomassa deste site e/ou a baixa abundância relativa de metal reduzindo os micróbios. Antes de implementar nosso enriquecimento de dois elétrodos, medimos o perfil vertical da concentração de oxigénio dissolvido. Isso nos permitiu colocar o carbono de feltro ânodo e platina-galvanizado carbono feltro cátodo em profundidades que apoiaria aeróbias e anaeróbias processa, respectivamente. Após incubação no local, estamos ainda mais enriquecido o elétrodo anódico em laboratório e confirmou uma comunidade microbiana distinta em comparação com a superfície-anexado ou comunidades de biofilme normalmente observadas nos Cedros. Este enriquecimento que posteriormente levado ao isolamento do primeiro micróbio electrogenic de cedros. Este método de enriquecimento microbiano no local tem o potencial para aumentar consideravelmente o isolamento de bactérias EET-capaz de baixa biomassa ou difícil a habitats de amostra.

Introdução

Vários minerais-reduzindo micróbios foram mostrados para utilizar minerais de fase sólida como aceitadores de electrões terminal, por processos de transporte de elétrons extracelular (EET) que conduzir elétrons para o exterior da célula através de de enzimas redox¹. EET é fundamental, não apenas para processos de micróbio-mineral mas também energia aplicada e tecnologias ambientais, tais como células de combustível microbianas², síntese de eletrodo³e biorremediação⁴. Nova bactéria capaz de EET é muito procuradas e têm sido muito estudadas a partir de uma perspectiva fundamental ou aplicada⁵. No entanto, temos apenas limitado insight sobre a importância ecológica ou biogeoquímico destas bactérias. A maioria dos micróbios capazes de EET foram isolada após enriquecimento do aqua, sedimentos ou Digestores anaeróbicos usando aceitadores de electrões sólido como MnO₂, Fe₂O₃ ou eletrodos preparados no laboratório^{6, 7 , 8}. no entanto, esses métodos produzem frequentemente similares consórcios e potencialmente perder os táxons mais sensíveis que podem dominar a baixa energia ou sistemas de biomassa baixa, a capacidade destes micróbios para adaptar-se ao laboratório ou ambiente de cultura axénica⁹ de polarização . Geralmente para ambientes de baixa biomassa, grandes quantidades de água de um site são filtradas para concentrar as células bacterianas. No entanto, bactérias capazes de EET, muitas vezes, apresentam metabolismo anaeróbico e, portanto, exposição de oxigênio ainda mais pode inibir ou impedir o seu cultivo. Metodologias no local alternativas para concentrar as células sem expô-los ao oxigênio poderiam facilitar o isolamento de bactérias capazes de EET. Aqui, nós relatamos detalhes de configuração para uma técnica eletroquímica no local enriquecer o micróbio capaz de EET durante um longo período de tempo sem a necessidade de uma fonte de energia externa.

Usando nossos experimentos de electrocultivation de uma fonte altamente alcalina no norte da Califórnia, os cedros¹⁰, descrevemos esta técnica eletroquímica no local. A geoquímica das molas nos cedros são impactados por serpentinization no subsolo. As molas são altamente redutoras, com concentrações de oxigênio abaixo do limite de detecção sob a interface ar água, destacando o potencial para a produção de energia microbiana através de EET neste ambiente anóxico funcionalmente¹¹. No entanto, não há provas para apoiar a micróbios EET-capaz de cedros (em 16S rRNA ou análise de Metagenomic). Mesmo que este ambiente tem sido caracterizado como aceitador de electrões limitado, o potencial para o uso de minerais insolúveis como aceitadores de electrões terminal, incluindo minerais tais como o ferro descobrindo minerais que resultam de serpentinization (i.e., magnetita), não tem sido extensivamente investigada¹². Nós, portanto, implantado o nosso sistema eletroquímico no parque de campismo da Primavera, uma mola de pH elevado em cedros, enriquecer para EET-capaz de micróbios (Figura1)¹³.

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Protocolo

1. construção de um sistema de dois-eletrodo para incubação ambiental

1. Preparação do material do ânodo e tratamento de carbono sentiram eletrodo (Figura 2).
   1. Corte o carbono sentiu igual dimensões dependendo do enriquecimento de biomassa desejado. Mergulhe cada eletrodo em etanol a 90% por 30 min e, em seguida, enxágue pelo menos 8 vezes com água desionizada, sonicating por 1 min depois de cada lavagem.
   2. Lave os eletrodos duas vezes em 1 M de HCl, mexendo durante um período mínimo de 12 h para cada lavagem.
   3. Seque os eléctrodos em forno quente (37 ° C) por 6-12 h ou até livre de líquido.
   4. Coloque eléctrodos ao fio de titânio, usando cola epoxy de grafite por protocolo do fabricante em um prato de politetrafluoroetileno (superfície non-stick).
      Nota: Usamos um fio de titânio devido à sua alta tolerância à corrosão aeróbia.
   5. Asse o eletrodo a 120 ° C, durante 6 h.
   6. Teste a resistência entre o fio de titânio e carbono de feltro com um ohmímetro e confirmar que a resistência entre o fio e eletrodos de feltro é inferior a 5 ohms.
2. Electroplation de platina sobre o carbono sentiu eletrodo para preparação do material do cátodo
   1. Mergulhe os elétrodos do carbono feltro, preparados na etapa 1.1, em M 2 KOH durante um período mínimo de 12 h em um recipiente de vidro.
   2. Para limpeza eletroquímica, coloque o eléctrodo como eletrodo (WE) a trabalhar em um reator de três-elétrodo, que também acomoda uma referência (RE) e o elétrodo contrário (CE). Conectar-se a nós, RE e CE para o potentiostat pelo jacaré. Confirme todas as conexões com um ohmímetro.
      Nota: Usamos uma Ag/AgCl (KCl saturado) arame eletrodo e um de platina como RE e CE, respectivamente.
   3. Poise o eletrodo no 1,0 V vs. Ag/AgCl para 600 s em solução eletrolítica contendo 2 M KOH (usando uma quantidade suficiente para submergir o eléctrodo inteiro). Retire o eletrodo do reator eletroquímico (que é feito de vidro). Enxague o eletrodo em água desionizada pelo menos 8 vezes, sonicating por 1 min depois de cada lavagem. Eletrodos de secos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h.
   4. Para preparar a solução do chapeamento, adicione 100 g de ácido cítrico, 5 g de sulfato de sódio e 2 g de-hidrogenofosfato hexachloroplatinate (IV) hexa-hidratado para 1 L de ácido sulfúrico de 2m.
   5. Pesagem limpos secos eletrodos como preparado em etapas 1.2.1–1.2.2 e em seguida, cobrir o eletrodo em uma solução do chapeamento como preparado na etapa 1.2.3. Proceda à sonicação o eletrodo na solução do chapeamento três vezes para 30 s cada.
   6. Galvanizar os eléctrodos por equilibrar o potencial de eletrodo no-0.2 V vs Ag/AgCl para 460 s no chapeamento de solução. Lave os eletrodos duas vezes em água desionizada e descartar os resíduos de platina.
   7. Lave os eléctrodos em água desionizada pelo menos 3 vezes, sonicating por 20 s após cada lavagem. Enxaguar sem sonication pelo menos três vezes mais.
   8. Eletrodos a 100 ° C, durante pelo menos 12 h. eletrodo de pesagem para quantificar a platina eletrodepositada sobre o eletrodo de carbono sentiu a seco.

2. construção e instalação do sistema dois-eletrodo

1. Investigação do local de instalação para cada eletrodo no ambiente natural.
   1. Determine a concentração de oxigênio usando uma sonda de oxigênio dissolvido (DO).
   2. Verificar o perfil de profundidade de fazer no site.
      Nota: As condições ambientais desejadas para o ânodo são anóxia e hidratação consistente. Se desejado, remova a influência da fotossíntese oxygenic protegendo o ânodo de luz. As condições ideais para a colocação do cátodo são consistentemente hidratadas e perto de superfície águas fossem oxic. Se necessário, fixe flutuadores para manter contato de superfície no cátodo.
2. Construção do sistema de incubação de 2-eletrodo de tipo de célula de combustível
   1. Conecte o fio isolado de comprimento desejado e uma pista de fio de titânio de eletrodos (um ânodo e um cátodo chapeado platina) rodando as duas linhas. Cobrir as conexões com cera resistente à água e proteger ainda mais usando tubos de encolher calor marinho da classe.
   2. Conecte dois cabos com um cátodo e um ânodo por um resistor de resistência conhecida.
      Nota: Para sistemas biológicos, resistores de baixas (10 a 1.000 Ω) resultam em atividade biológica mais consistente. Se desejado, um resistor de resistência elevada impedirá atividade biológica, como controlo negativo. Para evitar a corrosão de qualquer conexão entre o resistor e pistas, protegemos com tubos de psiquiatra do calor.
3. Medição de tensão e registro de temperatura ao longo do tempo.
   1. Verificar a tensão entre as extremidades do resistor para estimar a produção atual da reação da célula de combustível.
   2. Medir a diferença de tensão ao longo do tempo usando um voltímetro de log de dados com as conexões apropriadas, levando para o ânodo e o cátodo (Veja o protocolo do fabricante).
      Nota: O registo de dados de temperatura simultânea é opcional, mas esta informação pode ajudar a relacionar as alterações no atual para abióticos em oposição a flutuações biológicas.
4. Proteção de registrador de dados e conexões elétricas
   1. Use um saco estacionário e/ou plástico para proteger o agente de log e todas as conexões elétricas de chuva.
   2. Fixe os cabos firmemente para proteger do vento forte e um saco de plástico. Um exemplo é mostrado na Figura 1.

3. coleta da amostra do eletrodo de meio ambiente

1. Para impedir que a qualidade da amostra ânodo sendo danificado devido a contaminação, colete o eletrodo sob condições anaeróbicas.
2. Pelo menos 30 min antes da coleta da amostra de eletrodo, colocar um tubo de ensaio em uma localização anaeróbica. Por exemplo, colocar o tubo de ensaio e tampa separadamente na parte inferior da lagoa para fazer a garrafa dentro anaeróbica.
3. Cortar a ponta do elétrodo com um cortador de fio de titânio, delicadamente coletar a amostra de eletrodo para o tubo de ensaio e selá-lo na zona anaeróbica água. Para manter a amostra fresca, armazene a amostra a 4 ° C imediatamente após a coleta de amostra.
   Nota: Como alternativa, eletrodos podem ser transferidos diretamente para anóxica (N₂ purgado) médio. Usamos um meio de cedros (descrito por Suzuki et al . ¹¹) que foi concebido a partir da geoquímica aquosa medido no local e alterado para fornecer nutrientes suficientes para o crescimento microbiano. Essa mídia foi modificada para experimentos de laboratório diferente.

4. laboratório confirmação para a atual produção e análise de DNA

1. Eletroquímica confirmação para a atual capacidade de produção de consórcios microbianos anexar para o eletrodo.
   1. Construir um reator eletroquímico de^14,15 com uma Ag/AgCl (KCl saturado), um fio de platina e o eletrodo amostrado eletrodo como nós, CE e ré, respectivamente, em uma câmara anaeróbica. Encha o reator eletroquímico com meio de cedros contendo doadores de elétron de carboidratos solúveis.
   2. Equilíbrio do potencial de eletrodo no + 0,2 V vs Ag/AgCl e a medida da produção atual.
2. Extração de DNA da amostra eletrodo usando um DNA microbiano kit (veja a tabela de materiais).
   1. Limpar o interior do anaeróbico luvas com 70% de etanol e colocar um prato esterilizado em papel alumínio.
      Nota: Câmara anaeróbica mantém a concentração de oxigênio a menos de 1 ppm por manter uma atmosfera de hidrogênio em torno de ~ 2-3% para eliminar o oxigênio na presença de um catalisador de paládio.
   2. Abra o reator eletroquímico no porta luvas, colocar o eletrodo de amostra sobre o prato e cortar para um tamanho para caber o tubo utilizado no kit de DNA. Prossiga com o protocolo do fabricante.

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Resultados

Produção atual foi medida com êxito durante cerca de 3 meses usando um registrador de dados de tensão conforme mostrado na Figura 3. Desta vez foi escolhida como era o mais longo período de incubação estável para a primavera, devido à forte queda de chuvas que afetam a primavera. Um período mais curto pode ser suficiente, apesar de um período mais longo poderia fornecer mais forte enriquecimento da biomassa. Nós confirmou a conexão do sistema de ...

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Discussão

O estudo descrito, vamos mostrar o enriquecimento de um consórcio microbiano, ligado com a produção atual em situ . Dimensiona os padrões observados no atual apoio atividade microbiana neste sistema ao longo do tempo curto e longo. O passo fundamental para a construção de um sistema funcional dois elétrodos (tipo de célula de combustível) está identificando e utilizando um local com um estábulo nível de água e concentração de oxigênio no ambiente. O cátodo é exposto ao oxigênio na interface á...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon felt sheet	n/a	n/a	Used for anode and cathode
Titanium wire	The Nilaco Cooporation	TI-451485	Used to construct fuel cell system
Graphite epoxy	Electrolytica lnc.	n/a	Used to connect the electrodes and Ti wire
Drying oven	Yamato	DY300	bake the electrode to solidify conductive graphite epoxy
Digital multi meter	Fluke	616-1454	to check the ohmic value of resistance
Dissolved oxygen probe	Sper Science	#  850045	to check the oxygen concentration in the environments
Resistor	Sodial		Used to construct fuel cell system
Conducting wire	Pico	81141s	Used to construct fuel cell system
Voltmeter and Data logger	T&D corporation	VR-71	Used for data recording
Hydrogen Hexachloroplatinate(IV) Hexahydrate	wako	18497-13-7	Used for electropolation
Citric acid	Wako	038-06925	Used for electropolation
Sulfuric acid	Wako	192-04696	Used for electropolation
HCl	Wako	083-01095	Used for electrode washing
Glass cylinder	N/A	N/A	Custom-made, used as the electrochemical reactor
PTFE cover and base	N/A	N/A	Custom-made, used as a cover and a foundation of the electrochemical reactor
Buthyl rubber	N/A	N/A	Custom-made, inserted between each component of electrochemical reactor
Septa	GL Science	3007-16101	Used as an injection port of electrochemical reactor
Indium tin-doped oxide (ITO) electrode	GEOMATEC	No.0001	Used as a working electrode, 5Ω/sq
Ag/AgCl KCl saturated electrode	HOKUTO DENKO	HX-R5	Used as a reference electrode, Φ0.30mm
Platinum wire	The Nilaco Cooporation	PT-351325	Used as a counter electrode
NaHCO3	Wako	191-01305	Used for The Cedars Media (CMS)
CaCO3	Wako	030-00385	Used for CMS
NH4Cl	Wako	011-03015	Used for CMS
MgCl2 • 6H2O	Wako	135-00165	Used for CMS
NaOH	Wako	198-13765	Used for CMS
Na2SO4	Wako	194-03355	Used for CMS
K2HPO4	Wako	164-04295	Used for CMS
CABS	SANTA CRUZ	SC-285279	Used for CMS
Incubator	TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.	LTI-601SD	Used for precultivation
Autoclave machine	TOMY SEIKO CO. LTD.	LSX-500	Used for sterilization of the electrochemical reactor and the medium
Clean bench	SANYO	MCV-91BNF	Used to prevent the contamination of the electrochemical reactor and the medium with other microbes
Centrifuge separator	Eppendorf	5430R	Rotational speed upto 6000×g is required
Nitrogen gas generator	Puequ CO. LTD.	PNTN-2	Nitrogen gas cylinder can also be used instead of gas generator
UV-vis spectrometer	SHIMADZU	UV-1800	Used for optimization of cell density
Potentiostat	BioLogic	VMP3	Used for biofilm formation and kinetic isotope effect experiments
Thermal water circulator	AS ONE	TR-1A	Used for maintanance of temperature of electrochemcial reactor
Faraday cage	HOKUTO DENKO	HS-201S	Used for electrochemical experiments
Anaerobic Chamber	COY	TypeB (Vinyl)	TO conduct experiments under anaerobic condition
Ultraclean DNA Extraction kit	MoBio