JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הדמיה מולקולרית עם מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) מאפשרת את המיפוי סימולטני של analytes מספר דגימות ביולוגיות. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול זיהוי, ויזואליזציה של חלבון עמילואיד β על רקמות המוח של מחלת אלצהיימר ודוגמאות angiopathy עמילואיד במוח באמצעות MALDI-IMS.

Abstract

Neuropathology של מחלת אלצהיימר (AD) מאופיין על ידי הצטברות של צבירה של פפטידים עמילואיד β (Aβ) לתוך שלטי חוץ-תאי של המוח. פפטידים Aβ, המורכב של חומצות אמינו 40, נוצרים של חלבונים מבשר עמילואיד (APP) על ידי β - ו γ-secretases. Aβ הוא מופקד לא רק ב- parenchyma מוחית, אלא גם leptomeningeal, מוחין כלי הדם, המכונה angiopathy עמילואיד במוח (סי). בעוד מגוון רחב של פפטידים Aβ אותרו, מפורט הפקה והפצה של פפטידים בודדים Aβ ברקמות פתולוגי של AD וסי יש לא מלא טופלו. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול של מטריקס בסיוע לייזר מבוססת על desorption/יינון הדמיה ספקטרומטר מסה (MALDI-IMS) על רקמות המוח האנושי שלאחר המוות כדי לקבל מיפוי מקיף חלבון. למטרה זו, דגימות בקליפת המוח האנושי התקבלו מהבנק המוח-מכון טוקיו מטרופוליטן של גרונטולוגיה. Cryosections קפוא חתוך והועבר לבית אינדיום-פח-אוקסיד (ITO)-מצופה זכוכית שקופיות. ספקטרה נרכשים באמצעות מערכת MALDI עם רזולוציה מרחבית עד 20 מיקרומטר. חומצה Sinapinic (SA) בצורה אחידה הופקד על השקופית באמצעות של ריסוס ידני או אוטומטי. עם היתרונות הטכניים הנוכחי של MALDI-IMS, ניתן לקבל ערכת נתונים טיפוסי של מינים שונים Aβ בתוך הנוכשה של המוח האנושי נותחה ללא הגששים ספציפיים. יתר על כן, ברזולוציה גבוהה (20 מיקרומטר) הדמיה של המוח לספירה ודגימת לפנות לסוכנות חמור מראה בבירור כי Aβ1-36 ל- Aβ1-41 הופקדו לתוך כלי leptomeningeal, בעוד Aβ1-42 ו- Aβ1-43 הופקדו ב- parenchyma מוחי כמו סנילי פלאק (SP). זה ריאלי לאמץ MALDI-IMS בגישה סטנדרטית בשילוב עם תצפיות קלינית גנטית, פתולוגי בהבנת הפתולוגיה של AD, סי, מחלות נוירולוגיות אחרות מבוסס על האסטרטגיה הנוכחית.

Introduction

על מנת להפוך את האבחנה, להבין בפתוגנזה של הפרעות ניווניות, זיהוי מולקולרי מדויק של הפקדות פתולוגי הוא חיוני1. במהלך לספירה, הוא Aβ המיוצר לעשות SPs ב- parenchyma מוחי, שהופקד כלי הרבה לפני המחלה תחילת2,3,4,5,6. בעוד Aβ1-42 פפטיד השולט ב SP המוחות לספירה, גרסאות Aβ אחרות, כגון N-מסוף או C-מסוף נחתך או שינוי Aβs, מזוהות מושפע לספירה המוח7,8,9, 10. תמונה מלאה של המין טווח רחב של Aβ במוח האנושי, במיוחד עם AD ולתקן מוחין עמילואיד angiopathy (סי)11, תסייע למדענים להבין Aβ ייצור, חילוף החומרים, ומשקעים.

כמו הגישה הקלאסית של neuropathology, כבר אימונוהיסטוכימיה (IHC) השיטה הויזואליות כדי לקבוע את המיקום של Aβs במוח רקמות12,13,14,15. באופן כללי, IHC לא יכול להבחין מולקולות כאשר epitopes מספר להתקיים בו זמנית. לעומת זאת, ניתוח מבוססת ספקטרומטר מסה פרוטיאומיה מבנית המתעוררים היא גישה יקר במיוחד עבור ניתוח מגוון מינים Aβ ברקמות המוח, אשר אינו יכול להיות מבודלים עם נוגדנים16,17. ניתוח קונבנציונלי מבוססי ספקטרומטר מסה של המוח lysates ודוגמאות זירז חיסונית לא יצליח לזהות פפטידים Aβ מינור ויאבד מידע והפצה של Aβ בתוך רקמת המוח.

בעבודות קודמות, להמחיש משקעי Aβ מוח העכבר הוכתרה בהצלחה באמצעות מודל של בעלי חיים מהונדס של AD, כגון APP23. עם זאת, תהליך זה עדיין זקוק פיתוחים טכניים להשוות IMS IHC ביחס רזולוציית ורגישות18,19,20. AD neuropathology צריך להילמד על המוח האנושי, השתמשנו בטכנולוגיה MALDI-IMS על רקמות המוח האנושי שלאחר המוות כדי לקבל מיפוי מקיף חלבון21. לשם כך, פיתחנו עבור סוג מתקדם של ספקטרומטר מסה זה יש את היתרונות שלו במהירות, רגישות ו הפארמצבטית פרוטוקול.

Protocol

כאן, נאספו דגימות רקמה בבית חולים גריאטרי המטרופוליני של טוקיו, אשר מספקת שירותי רפואה קהילתיים לאוכלוסיית הקשישים ביפן. הדגימות הנתיחה המוח השתמשו במחקר נרשמו לבנק המוח לחקר הזדקנות (BBAR) עם הסכמה מדעת של קרובי משפחה של המנוח. BBAR אושרה על ידי ועדת האתיקה של בית חולים גריאטרי המטרופוליני של טוקיו, המכון של גרונטולוגיה. שכל כל הרשומים בבנק המוח, השגנו ההסכמות מידיעה הכתובה לשימוש שלהם למחקר רפואי למטופלים או משפחותיהם. החולים הונחו בחדר קר (4 ° C) בתוך 2 h לאחר המוות כדי להפחית לאחר המוות שינויים במוח. כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי הבנק המוח ואוניברסיטת Doshisha לחקר הזדקנות, בית חולים גריאטרי המטרופוליני של טוקיו, המכון של גרונטולוגיה.

1. הכנה של רקמות מקטעים IMS

  1. עיבוד רקמה הבנוי autopsied מוח אנושי
    הערה: ודא כי הצעד הכנה לדוגמה עבור IMS משמר של המצב המקורי של הרקמה. למנוע שינויים זיהום, פוסט-מורטם. השלב הבא הוא קריטי.
    1. להשיג דגימות בקליפת המוח האנושי עבור IMS של המוח הוסר, מעובד, ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס בתוך 8 שעות לאחר המוות. קח את הדגימה המוח של קליפת המוח העורפית של חולי אלצהיימר, פקדים מתאימים לגיל21.
  2. הכנת קטעי רקמה קפוא
    1. חותכים הסעיפים רקמות על cryostat. במקום שקופיות זכוכית מיקרוסקופ מצופים איטו מוליך בתוך ה cryostat21.
    2. חמים הדגימה המוח הנתיחה מ-80 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות פנימה cryostat.
    3. להב חד פעמיות חדש לצרף cryostat בכל ניסוי. תמיד לנסות להשתמש בחלק נקי של הלהב.
    4. לשים את המוח הנתיחה קפוא על הבמה יחד עם כמות קטנה של המתחם OCT (מספיק כדי לכסות את האזור המרכזי של השלב; ראה טבלה של חומרים).
    5. בחר את התנאים עבור חלוקתה דק. IMS, להשתמש עובי של 10 – 12 μm למקטעי המוח האנושי. IMS, IHC, חותכים סעיפים 5-6 מ כל דגימה רקמה.
    6. כאשר הלהב רק מתחיל לחתוך את הרקמה, להפוך את הגלגל ואת "פנים" הרחוב עד כל הרקמה חשופה. אם יש פס קטן או דמעה של מעבר המקטע, לחכות קצת יותר ב- cryostat ההתאמה טמפרטורה אוטומטי מתקן את זה. לספור כמה שניות לפני פתיחת את גליל נגד עם ממחטה מתחת.
    7. מיד במקום הפרוסה רקמות על הצד מצופים איטו של השקופית זכוכית. להפשיר את הפרוסה רקמות על ידי לשים אצבע מתחת לשקופית על הצד שאינו מצופה איטו. הרקמה ידבק השקופית; ודא הרקמה שטוח ככל האפשר עם וללא קמטים. לבצע שלב זה בטמפרטורת החדר.
      הערה: ללבוש כפפות מסכות, חלוק מעבדה כי הדגימות אנושי יכול להכיל מזהמים ביולוגיים. כאשר כל המקטעים נעשו במשך היום, לנקות את cryostat, מברשות, חריטה עם מגבונים מעבדה ו- 200 מ ל 100% אתנול.
  3. שטיפה הסעיפים רקמות
    1. לטבול את הדגימות ב- 40-100 מ"ל אתנול 70%-30 s כדי להסיר שומנים אנדוגני מלחים אורגניים. . תשתמש בכוס מכתימה את הצנצנת.
    2. לשטוף את הדגימות עם 40 – 100 מ ל 100% אתנול ל 30 s, 40 – 100 מ של הפתרון של Carnoy במשך 3 דקות, 40 – 100 מ של 100% אתנול ל 30 s, 40 – 100 מ"ל של 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA) עבור 1 דקות, 40 – 100 מ ל 100% אתנול לשימוש ס' 30 זכוכית צביעת הצנצנת.
      הערה: הפתרון של Carnoy הוא מקבע מורכב 6 חלקים אתנול חומצה אצטית לשלושה חלקים, חלק אחד כלורופורם.
    3. יבשים בוואקום למשך 30 דקות.
  4. טיפול של הסעיפים רקמות עם האדים חומצה פורמית ליוניזציית טוב יותר של החלבונים Aβ רקמות המוח נתיחה שלאחר המוות
    1. הכינו את השקופית זכוכית בתנור אבן, ומסעדת הדגירה כדי לשמש את אידוי עוקבות 5 מ ל חומצה פורמית 100%. כדי להשיג טיפול חומצה משביע רצון, לשמור על לחות האוויר בצלחת זכוכית הדגירה ברמת רוויה לאורך כל שלב זה, לשמור על הטמפרטורה 60 מעלות צלזיוס. להעמיד את השקופיות רקמות בצלחת זכוכית הדגירה תוך הימנעות ועלייתו חומצה פורמית ולנהוג במשך 6 דקות.
    2. לקחת תמונה אופטי של הדגימות באמצעות של הסרט סורק, סורק ג'ל, או מיקרוסקופ דיגיטלי וכדומה לבצע שלב זה בטמפרטורת החדר. היישור של התמונה האופטי של הדגימות הכרחי כאשר המטרה מדגם ממוקם בתוך המכשיר. בדרך כלל, זה לא יהיה ניתן להבחין בסעיף רקמות מתחת לשכבת מטריקס.
      הערה: הדרך הנוחה ביותר לקחת תמונה אופטי היא להשתמש בסורק office. . זה רעיון טוב לשמור את התמונה בתוך תיקיית אחסון נתונים הדמיה.
    3. כדי לתאם את התמונות אופטי עם הדגימות, להפוך סימני מדריך הגלויים תמונה אופטי והן מתחת לשכבת מטריצה ב האופטי המצלמה. הדרך הקלה ביותר היא ספוט תיקון לפחות שלושה סימני נוזלים סביב המדגם לפני לקיחת תמונה אופטי.
  5. יישום מטריקס
    1. הכנה של הפתרון מטריקס
      1. ב- microtube הממס-סובלנית, אורגני להכין 10 מ"ג/מ"ל SA פתרון 50% acetonitrile (לחצן מצוקה) ו- 0.1% TFA. ביסודיות להמיס את שיוך האבטחה מורכב על-ידי vortexing או sonication קצרה עבור 10 דקות החנות הפתרון בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
        הערה: קיימות שלוש אפשרויות שונות עבור מטריצה ריסוס: באמצעות מברשת אוויר, ריסוס של אולטרה סאונד או של ריסוס אוטומטיים.
    2. ריסוס המטריקס עם מרסס צבע
      1. לבצע את הפעולה קבוע בטמפרטורת החדר (20 – 23 מעלות צלזיוס), לחות (40%-60%). הפרמטרים כדי לכוונן עבור ריסוס אופטימלית כוללים את גודל ה-droplet, הכמות של ערפל, זווית, המרחק בין הזרבובית, אזור הרקמה, מעבדה טמפרטורה ולחות. התאם תנאים אלה על ידי בדיקת התוצאות מיקרוסקופ.
        הערה: כפי גורמים מגבילים כוללים את גודל הקריסטל ואת ההומוגניות של כיסוי מטריקס וההגירה בלתי רצויות/פעפוע של analytes, קטן יותר הוא טוב יותר עבור גודל טיפה. הומוגניות הוא גם המטרה של הבדיקה.
    3. התזת המטריקס ריסוס אולטראסוניות
      1. להסיר את הרקמה ריסוס מן desiccator ולמקם אותו בבית הבליעה. ודא שהרקמה לא מכסה את החלון חיישן.
      2. להתחיל את ההכנות על-ידי לחיצה על לחצן התחל ; בדרך כלל, זמן ההכנה הוא בערך 90 דקות. ההכנה מוסדר באופן אוטומטי באמצעות הפיקוח על עובי השכבה מטריצה של רטיבות. בתום ההכנה, להסיר את השקופית, לאחסן אותו desiccator למשך 15 דקות לפני קריאתו בכלי MALDI.
      3. לנקות את הריסוס עם 2-3 מ"ל של 100% MeOH עד שיופיע בראש תרסיס מנקה.
        הערה: התמוססו לערפל של מטריקס טיפות מותר לשקוע לתוך הרקמה על ידי גיליון הכבידה. גודל של droplet ממוצע של 20 μm נוצר; קטרים droplet כל הם פחות מ-50 μm.
    4. התזת המטריקס ריסוס אוטומטיים
      1. תרסיס הפתרון מטריקס על פני רקמות עם ריסוס אוטומטיים. flow מתמדת של נדן מחוממת גז (N2, שוכן בגובה 10 psi ו- 75 ° C) תימסר בצמדים עם מטריקס פתרון הריסוס. להשתמש במערכת משאבת הממס (מוגדר ב 10 psi ו- 0.15 mL/min) כדי לספק את הפתרון מטריקס.
        הערה: והכי חשוב, עבודה תחת ביטחון הקבינט להמנע בכל שאיפה של מטריקס אירוסולים. לשלוט בטמפרטורת החדר לחות לשחזר את התגבשות מטריקס הומוגנית.

2. MALDI-IMS

  1. לבצע שהחור ספקטרומטר מסה.
    1. ביצוע ניסויים הדמיה תפוקה גבוהה ורזולוציה גבוהה-מרחבית עם MALDI-IMS מצויד nd: yag 10 קילו-הרץ (355 ננומטר) לייזר.
    2. למדידות ספקטרומטר מסה, מגדירים את אזורי רקמות באמצעות תוכנת השליטה MALDI תוכנה לניתוח נתונים.
    3. לרכוש ספקטרה במצב לינארי חיובי עם מגוון מסה m/z 2,000-20,000 רזולוציה מרחבית של 20 ו- 100 מיקרומטר.
    4. כדי להפוך את הכיול סטנדרטי, להמיס הכיול פפטיד סטנדרטי, כיול חלבון סטנדרטית עם יחס של 1:4 בחומצה אלפא-Cyano-4-הידרוקסיל-cinnamic (CHCA) בתמיסה TA30 (ACN:0.1% TFA = 30:70) ולאחר מכן למהול אותו 10 x. במקום μL 1 של כיול סטנדרטי על השקופית בארבעה מקומות שונים.
  2. שימוש בתוכנה היסטולוגיה מולקולרית (ראה טבלה של חומרים), כיסוי מספר תמונות יחיד למצוא קורלציה מרחבית של אותות שונים, כגון פפטידים Aβ שונה colocalizing של SPs, דפנות העורקים.

3. עיבוד נתונים

  1. עבור יישור ספקטרלי, ליישר הספקטרום רשימה שנבחרה מ/z הפרסום הקודם21.
  2. לייבא ערכת הנתונים MALDI-IMS לתוך תוכנת ניתוח סטטיסטי (ראה טבלה של חומרים) עם תוכנית בסיסית חיסור.
  3. לאתר אזורים מעניינים (ROIs) המבוססים על ידע היסטולוגית.
    1. ביצוע ניתוח univariate על עוצמות מרושע, סטיות תקן, בגילויה של שמסווגת m/z-סמנים (ניתוח ROC), בדיקות השערה, גילוי colocalized מ/z ערכים.
  4. ליצור מפת פילוח.
    1. לבצע ניתוח רב משתני ללא השגחה על חלוקת אלגוריתמית וניתוח רכיב על החילוץ של מגמות הבסיסית המרחבית.
    2. בחר ROIs אנטומי בהתבסס על מאפייני היסטולוגית, כגון parenchyma ועל השטח תת-עכבישי.
    3. הקצאת מבנים כמו ROIs בודדים, לתאם אותם עם הנתונים MS מעובד על מנת לזהות פפטידים המשויך שמותר סגמנטציה של האזור.

תוצאות

חולי אלצהיימר סדיר עם חוזים (n = 5; גיל ממוצע = 83.2 y) בגילאי בנבדקים עם רובד סנילי חינם (O SP) וסי (n = 5; גיל ממוצע = 77.2 y) היו ניתח (טבלה 1). הפנוטיפים לפנות לסוכנות של המטופל #3 היו הבולטים ביותר במחקר זה. הפצות של Aβ1-40, Aβ1-42 פיקדונות בתוך רקמת המוח מהמטופלת #3 היו דמיינו MALDI-IMS (איור 1). היו אין סימנים משמעותיים במוח בקרה nonpathological (חולים #9 ו- #10), כפי שמוצג באיור1. . הנה, MALDI-IMS דמיינו בבירור כי Aβ1-42 היה מעדיפים שהופקדו כמו של SPs parenchyma מוחי. לעומת זאת, Aβs קצרים יותר, כגון Aβ1-36 ל- 1-41, מעדיפים הופקדו על האזורים כלי הדם leptomeningeal (איור 1).

הפצות של Aβ40 ו Aβ42 היו עוד יותר לאמת עם IHC באמצעות חלקים קפואים סמוכים של הרקמות. נוגדן anti-Aβ40 תוויות סי (חיצים, איור 2B), אשר בניגוד ברור ההפצה של Aβ42 ב- parenchyma מוחי כמו של SPs. עבור Aβ1-41, אנחנו הראשונים לזהות שבר את המוח האנושי, יש לנו שנוצר נוגדנים ספציפיים יכולים להבדיל Aβ41 Aβ40 andAβ4221.

הרזולוציה המרחבית של MALDI-השמ בדרך כלל הגורם החשוב ביותר כדי לשפר. איור 1 ו- 2 איור להראות MALDI-IMS עם רזולוציה גובה 100 מיקרומטר, לקבל פרופיל הפצה הכוללת של שטח רחב יחסית21. קשה להגדיר את התצהיר עמילואיד בדיוק ברווח תת-עכבישי, כולל מבנה כלי הדם. כדי לתאר רקמה בסדר מבנים של כלי תת-עכבישי, השטח של קליפת המוח, דימות ברזולוציה של MALDI (מיקרומטר 40: איור 3; 20 מיקרומטר: איור 4 , איור 5) בוצעה. כתוצאה מכך, MALDI-IMS הפגינו בבירור Aβs קצרה יותר, כגון Aβ1-36 ל- 1-41, מופצים על קירות העורקים, אשר משולה עם IHC.

MALDI-IMS הפגינו חלוקות מפורט של Aβx-40 וגם Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ו 11pE) לספירה מלווה עם המוח לפנות לסוכנות מתונה. לדוגמה, בעוד Aβx-40 מינים הראה פרופיל הפצה דומה Aβ1-40, Aβx-42 מינים הראתה תבנית חלוקה שונה עם Aβ1-4221. על-ידי הפרוטוקול הנוכחי, יון בודד תמונות של פפטידים Aβ בודדים נצפו עם MALDI-IMS מוקצות מינים Aβ. לעומת זאת, רכשה תמונת נתונים יכול ייחקרו באמצעות סטטיסטיקה רב משתנית ללא השגחה על מנת לקבל סגמנטציה של אזורים אנטומי עניין לניתוח נוסף של חלבונים לא מוגדר. איור 5 מראה מפת פילוח שהושג עם ניתוח k-פירושו bisecting מוחל על אותו סעיף החולה #321. שיטה זו קיבוץ באשכולות לזהות מבנים דמויי-פלאק ב- parenchyma (כחול ב איור 5C) ומבנים כלי דם בחלל תת-עכבישי (ירוק ב- 5C איור). זה מעניין למצוא אזור עגול קטן ב- parenchyma, אשר מזוהה רק סביב arteriole קטן parenchyma, כמו גם בחלל תת-עכבישי (סגול ב- 5C איור). זה מאומת על ידי יון בודד תמונות של פפטידים Aβ בודדים אלה ב- 5D איור-5F.

figure-results-3176
איור 1: MALDI-IMS של המודעה קפוא/לפנות לסוכנות המוח סעיף. C שונים-מסוף נחתך Aβ פפטידים לספירה המלווה חמורה לפנות לסוכנות (החולה #3) הם דמיינו פאנל שמאלי, פקדים (החולה #9 על ימין ועל החולה #10 משמאל בכל התמונות) בלוח הימני. Aβ1-36 ל- Aβ1-41 מופקדים מעדיפים כלי דם leptomeningeal, בעוד Aβ1-42 ו- Aβ1-43 מופקדים parenchyma מוחי כמו סנילי הפלאק למקרה #3, למרות שלא היתה שום אות של חולי שליטה המוח (מקרים #9 ו- #10). רזולוציה = 100 μm. סרגל קנה מידה = 5 מ מ. דמות זו שונתה באישור Kakuda et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4001
איור 2: MALDI-IMS של המודעה קפוא/סי המוח מקטעים ומקטעים סמוכים של קליפת המוח העורפית של המוח AD- (א - ג) קפואה AD/סי המוח והמקטעים חלקים סמוכים (D ו- E) של קליפת המוח העורפית של המוח לספירה היו שהוכתמו החיסון, התמקדו arteriole parenchyma מוחי, באמצעות נוגדנים נגד Aβ40 (d: BA27) או Aβ42 (E: anti-Aβ42 polyclonal). שני ניתוחים הדגימו כי Aβ40 מעדיפים החודר לתוך כלי הדם leptomeningeal (החצים בלוח D), רבים בין תת-עכבישי החלל parenchyma מוחי ויוצרים לפנות לסוכנות. לעומת זאת, Aβ42 בעיקר מופקד SPs. עבור IMS, רזולוציה = 100 μm. סרגל קנה מידה = 5 מ מ (A, Bו- C) = 5 מ מ, 500 ( Eו-D ). דמות זו שונתה באישור Kakuda et al.21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5156
איור 3: MALD-IMS של המודעה קפוא/סי המוח מקטעים (החולה #3) ברזולוציה של 40 µm. C-מסוף שונים, N-מסוף נחתכות ו שונה Aβ פפטידים לספירה המלווה חמורה לפנות לסוכנות (החולה #3). Aβ1-36 ל- Aβ1-41 מופקדים מעדיפים כלי דם leptomeningeal, בעוד Aβ1-42 ו- Aβ1-43 מופקדים parenchyma מוחי כמו שלטי סנילי. גודל ברים = 1 מ"מ (A-B), 2 מ מ (שמאל למעלה). רזולוציה = 40 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5816
איור 4: MALDI-IMS של המודעה קפוא/סי המוח מקטעים (החולה #3) ברזולוציה של 20 מיקרומטר. לוח זה מציג שונים C-מסוף, N-מסוף נחתכות ו שונה Aβ פפטידים לספירה המלווה חמורה לפנות לסוכנות (החולה #3). Aβ1-36 ל- Aβ1-41 מופקדים מעדיפים כלי דם leptomeningeal, בעוד Aβ1-42 ו- Aβ1-43 מופקדים parenchyma מוחי כמו שלטי סנילי. גודל ברים = 200 μm (a, b, c), 1 מ מ (שמאל למעלה). רזולוציה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6500
איור 5: מפת פילוח, מתקבל על ידי MALDI-IMS של מקטע קפוא המוח לספירה, חושף רובד סנילי בשם מבנים תת-עכבישי קיבול גדול, קטן רבים parenchymal. (א) פילוח מפה המתקבל ניתוח רב משתנית התמונה של נתוני MALDI-IMS. Bisecting (B) k כלומר לפי ניתוח האשכולות זיהו מבנים דמויי פלאק, כלי דמוי קליפת המוח העורפית. האשכולות, substructures ועל קשריהם מוצגים כצמתים (e.g.,1-0-0). (ג) Aβ ברורים פפטיד לוקליזציה דפוסי הדומה הפלאק (כחול), כלי שיט תת-עכבישי (ירוק), ומבנים arteriole (אדום). שימו לב כי כמה אשכולות אדומים מופצים גם בחלל תת-עכבישי. זה מאומת על ידי יון בודד תמונות של פפטידים Aβ בודדים אלה ברזולוציה 20 מיקרומטר: (יח) Aβ 1-40, Aβ (E) 1-41, ו- Aβ (F) 1-42. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

התיקמגדרגיל לאחר המוותBraak ב SPלפנות לסוכנות
1M83C0.5
2M88C1
3M84C2
4M78C1
5M83C1
6M84O0
7M78O0
8M70O0
9M73O0
10M81O0

טבלה 1: נתונים קליניים ופתולוגיים של AD עם המקרים לפנות לסוכנות ונושאים SP O בגילאי. דגימות בקליפת המוח האנושי IMS, IHC התקבלו מהבנק המוח ב טוקיו מטרופוליטן המכון של גרונטולוגיה. כל הדגימות המוח נלקח קליפת המוח העורפית של חולי אלצהיימר חמש ופקדים מתאימים לגיל חמש. היקף התצהיר עמילואיד כפי שמוצג על ידי נוגדנים חד-שבטיים Aβ הוגדרה על ידי braak ב SP (עמילואיד) בשלבים. שלב O, ישנם כמעט אין שלטי סנילי ברחבי isocortex. שלב C, מושפעים כמעט כל האזורים isocortical. המוחות לספירה מחזוריים בשלב ג. טבלה זו שונתה באישור Kakuda et al.21.

Discussion

כאן אנחנו הפגינו פרוטוקול מפורט ותוצאות להדמיה של Aβ ושל שלה איזופורמים של מספר מוחות autopsied עם AD ו סי עם MALDI-IMS. לפרופיל התצהיר של Aβs שונתה באופן דרסטי Aβ1-42 לווריאציות N - ו C-מסוף שלה. Aβ1-41 היה הראשון המזוהה, דמיינו במוח האנושי עם פרוטוקול הנוכחי, אומתה נוסף עם IHC21. בהתחשב בכך כי המורפולוגיה של Aβ הופקדו על ידי IMS עם ניתוח ברזולוציה גבוהה (20 μm) חייב להיות הסכם טוב עם IHC, IMS IHC באותה מידה לתרום הבחנה פיקדונות Aβ על ידי חלבון התוכן והמיקום שלהם, כמו גם על ידי המורפולוגיה שלהם. כמו הניסוי כולו המתואר כאן נערך קליפת המוח העורפית, לומד הלוקליזציה של מינים שונים של בטא עמילואיד על פני כל אזורי המוח להכליל עם ניסויים עתידיים באמצעות פרוטוקול הנוכחי.

שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול נמצאים במרחק צעדים הכנה רקמות כדי לקבל יינון יעיל של חלבונים מצטברים ברקמות המוח האנושי. שכבה מטריקס דרוש כדי לספוג את האנרגיה לייזר זירוז desorption, יינון של analytes. בתהליך זה, מקטע רקמות כולו homogeneously מצופה קריסטלים קטנים. Cocrystallization הומוגנית של analyte עם המטריצה היא קריטית עבור הדמיה רגישות גבוהה וללא לכלוך. כל אחת מהשיטות ספריי שלושה יתרונות משלו. ציפוי ריסוס ידני הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר. מברשת אוויר נוח; עם זאת, זה דורש פעולה מיומנת. כמו טכניקה ניסיוני לשחזור ומדויק הוא חיוני, באמצעות ריסוס של אולטרה סאונד ו/או ריסוס אוטומטיים כפי שמתואר הפרוטוקולים הנוכחי מומלץ. ביחס ריסוס אולטראסוניות, זה לא תושפע של חום ולחות של החדר כי זה מרוסס לתא. בינתיים, עם ריסוס אוטומטיים, מתקבל רזולוציה מרחבית נשמר יחסית עם הפארמצבטית טוב. באופן כללי, הרזולוציה המרחבית שהושג עם העלייה שלוש שיטות לפי סדר 1) airbrush, התקן אוטומטי 2) ו ריסוס אולטראסוניות 3).

והכי חשוב, פרוטוקול זה נוצר במקור ויוכל להמחיש Aβs בדגימות המוח האנושי ינותח. הפריט החזותי של Aβs עם MALDI-IMS עבור עכברים APP23, אשר נוצר כמו במודל חיה של מודעה בהתבסס על המוטציה שוודי-סוג של APP אנושי, דווח קודם לכן על ידי אחרים עם18,קיימת שיטה19. עם זאת, פרוטוקול לשעבר חלה על APP23 לא היה מספיק כדי לדמיין Aβ שלה ברזולוציה לרוחב ורגישות. עבודות מוקדמות דנו כי ריכוזים גבוהים של Aβ מחוץ לגבול הרקמה הם בבירור חפצים ב APP23 הדמיה עם18,שלהם פרוטוקול19. משמעות הדבר היא מה שמכונה 'טשטוש' בין האמיתי של SPs IMS תמונות בשל השלב החילוץ ' מטריקס ' היה בלתי נמנע עם הדמיה מסוג MALDI. עם זאת, בפרוטוקול הנוכחי, הטשטוש נעלם, כל ספקטרום מיוצגים כל SP יחיד ב- parenchyma המוח.

כפי שמוצג כאן, אפשר לאתר Aβ1-41 בפעם הראשונה לספירה מוח לפנות לסוכנות עם MALDI-IMS, כמו גם עם IHC, עם נוגדנים ספציפיים על-ידי הדור שלנו21. על פי המודל עיבוד Aβ, Aβ1-38 נובע Aβ1-45 ויה Aβ1-42, בעוד Aβ1-41 נובע Aβ1-45 וγ-secretase המחשוף stepwise27,28,29,30,31 . משמעות הדבר היא כי בפרוטוקול הנוכחי תומך מודל זה. לגבי המגבלות של טכניקה זו, אנו חייבים לשקול את הטרוגניות של דגימות מן המוח האנושי הנתיחה שלאחר המוות. השלב הקריטי ביותר, במובן מסוים, הוא להעריך את רקמת המוח הנתיחה מוסמך עם הוכחה אתית. עם פרוטוקול הנוכחי על רקמות המוח האלה הנתיחה מוסמך, MALDI-IMS בנפרד לאתר את התפלגות שלם של מולקולות מורכבות יש מספר שינויים, כמו גם לא ידוע factor(s) ויסות בפתוגנזה של AD, שצריכות להיות מוגדרים. יתר על כן, בהבנת בפתוגנזה הכללית של neuropathology שונים במוח האנושי בגילאי, זה חייב להיות ריאלי לאמץ MALDI-IMS בגישה סטנדרטית, בשילוב עם תצפיות קלינית גנטית, פתולוגי במחלות נוירולוגיות .

צעד קריטי נוסף של MALDI-IMS הוא תהליך כריית נתונים של ערכת הנתונים שהושג, וזה תמיד זמן רב. כריית נתונים ידנית של כל הפצה שיא מחייב את המשתמשים לחץ על כל תמונה ולחפש הפצות אשר ייתכן תשבחות המורפולוגיה של המדגם שנותחה. פילוח המרחבית האוטומטית ניתן בשלב הראשון של הנתונים כרייה, מתן סקירה כללית של ערכת הנתונים, ומאפשר זיהוי מהיר של תכונות בולטות. בגישה זו, קווי דמיון בין ספקטרום של אזור נתון נקבעים מבחינה סטטיסטית, ספקטרה דומים מקובצים באשכול אחד. כל הפיקסלים מסומנים בצבעים לפי המשימה שלהם אשכול (איור 5). במחקר הנוכחי AD/סי, האזור עניין הוא המרחב של התצהירים Aβ פלאק parenchymal ואת המבנים וסקולרית תת-עכבישי, parenchymal. שתי הפסגות ייחודי אשר היו תוקף נוסף עם IHC היו ערכי מ/z Aβ1-40, Aβ1-4221. לכן, קל למצוא m/z colocalized עם Aβ1-40, Aβ1-42 אשר כבר היה Aβ קטום מוערת ל N - ו C-מסוף, כמו גם פפטידים לא ידוע, לצורך ניתוח נוסף.

ולר ועמיתיו דיווחו כי Aβ שמצטבר כלי הדם, יותר סביב העורקים מאשר סביב כלי הדם21. יתר על כן, שהוא הוצע כי נוזל בין-תאי (הקרן) כולל Aβs מופרש מן parenchyma מוחין הצומת לימפה דרך בגודל perivascular ניקוז מסלול22,23,24,25 ,26. בפרוטוקול הנוכחי כדי ליצור מפה פילוח המבוסס על ערכת נתונים MALDI-IMS ברזולוציה מיקרומטר 20 תומך קיום אפשרי מסלולים ניקוז perivascular של המוח (איור 5), אשר תורמים באופן משמעותי לפנות לסוכנות לספירה21 , 32. יתר על כן, אנו יכולים לגלות סמן חלבונים colocalized עם שלט, להערכת תת-עכבישי על-ידי חישוב המתאם של כל ערכי מ/z. בהבנת בפתוגנזה הכללית של neuropathology שונים במוח האנושי בגילאי, זה חייב להיות ריאלי לאמץ MALDI-IMS כמו בגישה רב-עוצמה בשילוב עם הוקמה IHC נתונים קליניים, גנטי, ותצפיות פתולוגי ב נוירולוגית מחלות.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (חלבון להזדקנות המוח, דמנציה הבקרה 26117004; מ. ע. ו ט. מ). מחקר זה מומן בחלקו על ידי תוכנית מחקר אסטרטגי למדעי המוח מהסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED). כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות יגיעו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CryostatLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyCM1950
Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slideBruker Daltonics#237001
Blade (disposable)Leica Microsystems, Wetzlar, Germany#117394
O.C.T. CompoundLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyFSC 22 Blue
ScannerEPSONGT-980
Air-BrushGSI CreosPS274
CompressorMRHOBBYMr.Linear compressor L5
Ultrasonic sprayerBruker DaltonicsImagePrep
Automatic sprayerHTX TechnologiesTM Sprayer
Confocal-laser-scanning-microscopeCarl Zeiss Inc.LSM 700
Ultra high speed MALDI instrumentBruker DaltonicsrapifleX MALDI Tissuetyper
MALDI control softwareBruker DaltonicsFlexControl 3.8
Data analysis softwareBruker DaltonicsFlexImaging 5.0
Molecular histology softwareSCiLS, Bremen, GermanySciLS Lab 2016a
Statistical softwareSCiLS, Bremen, GermanySciLS Lab 2016a
Sinapinic acid (SA)Nacalai tesque30494-91
Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA)Wako037-19261
Calibration standardBruker Daltonics
Biotinylated anti-mouse IgG antibodiesVector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Biotinylated anti-rabbit IgG antibodiesVector Laboratories, Inc., Burlingame, CA
Avidin and biotinylated HRP complex.Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CAVectastain Elite ABC kit
3,3-diaminobenzidine (DAB)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CAVectastain Elite ABC kit

References

  1. Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189(2016).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
  3. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
  4. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
  5. Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
  6. Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
  7. Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
  8. Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24(2016).
  9. Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
  10. Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
  11. Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
  12. Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
  13. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
  14. Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
  15. Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
  16. Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
  17. Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
  18. Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
  19. Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
  20. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
  21. Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73(2017).
  22. Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
  23. Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
  24. Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
  25. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
  26. Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
  27. Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
  28. Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
  29. Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
  30. Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
  31. Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
  32. Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

145MALDIangiopathy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved