וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה מודדים פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של תאי שריר הלב לאחר היפוקסיה/Reoxygenation

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי של התאים לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.

Abstract

פגיעה reperfusion מתוזמן ויעיל של העורק הראשי occluded היא האסטרטגיה הטובה ביותר עבור הפחתת גודל לאוטם שריר הלב בחולים עם מקטע ST גבוהות אוטם שריר הלב. עם זאת, פגיעה reperfusion כשלעצמה יכול לגרום עוד יותר cardiomyocyte מוות, תופעה הידועה כ פגיעה reperfusion פציעה. הפתח של הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP), עם ירידה של קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאליים (MMP) או מיטוכונדריאלי דפולריזציה, אוניברסלית מזוהה כמספר השלב הסופי של פגיעה פגיעה reperfusion, אחראי על מיטוכונדריאלי ומוות cardiomyocyte. JC-1 הוא צבע cationic lipophilic שמצטבר בתוך המיטוכונדריה בהתאם לערך של MMP. הוא MMP גבוה יותר, וככל JC-1 מצטבר בתוך המיטוכונדריה. כמויות הולכות וגדלות של JC-1 בתוך המיטוכונדריה יכולים להשתקף על-ידי שינוי פליטת קרינה פלואורסצנטית מירוק (~ 530 ננומטר) אדום (~ 590 ננומטר). לכן, ההפחתה של היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק ניתן לציין את דפולריזציה של המיטוכונדריה. כאן, אנחנו לוקחים את היתרון של JC-1 כדי למדוד MMP, או הפתח של mPTP של תאי שריר הלב האנושי לאחר היפוקסיה/reoxygenation, זוהה על ידי cytometry זרימה.

Introduction

מחלת לב כלילית היא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם. טיפול הבחירה עבור הפחתת איסכמי והגבלת גודל לאוטם בחולים עם ST-קטע גבוהות אוטם שריר הלב הוא בזמן ויעילים שריר הלב פגיעה reperfusion דרך הראשית התערבות כלילית מלעורית (PCI)^{1, 2}. עם זאת, פגיעה reperfusion גורמת לנזק נוסף, אשר יכול להסביר עד 30 אחוזים של גודל לאוטם הסופי³. זה הוא טרטוריות כי הנקבובית המעבר חדירות מיטוכונדריאלי (mPTP) אינה רק המרכזית נזק מיטוכונדריאלי ומוות תא במהלך איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R), אבל הוא גם יעד משולבות של נמצא איתות^{4 , 5}. כמו הפתח mPTP תמיט דפולריזציה של הממברנה הפנימית מיטוכונדריאלי (MMP) פוטנציאל⁴, הבחנו mPTP פתיחה באמצעות ה-5, יונקות, בתו 6′-בסדר-1, 6, 3, 3′-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) וזמינותו.

וזמינותו JC-1 היא שיטה cytofluorimetric כי הוא גם איכותי וגם כמותית, זה אומתה עוד יותר על-ידי ניתוח של MMP ברמה של המיטוכונדריה יחידה⁶. JC-1 קיים טופס צבור, מניב אדומה תפוזים בצבע פליטה (590 ± 17.5 ננומטר) המטריצה של המיטוכונדריה עם MMP נורמלי; עם אובדן MMP, JC-1 מומר לטופס monomeric המניבה פלורסצנטיות ירוק עם פליטה של 530 ± 15 ננומטר. לכן, ירידה ברמת היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית אדום/ירוק יכול להצביע על ההפחתה של MMP במצבים כגון איסכמיה/פגיעה reperfusion (אני / R).

בנוסף JC-1, MMP למד גם אצל קרום חדיר קטיונים lipophilic כגון Rhodamine 123 ו- 3, 3′-dihexyloxadicarbocyanine יודיד [DiOC6(3)]. עם זאת, בהשוואה לאלה שני רגשים, JC-1 הוא אמין יותר לניתוח MMP. Rhodamine 123 יש רגישות הדלה יחסית (במיוחד ב שכבתה מצב^7,8) וספציפיות המסכן. התזוזה בממוצע rhodamine 123 לפעמים הוא כל כך קטן כי זה קשה עבור חוקרים או ציוד להתבונן/לזהות. חוץ מזה, בתא בודד, ישנם אתרי קישור מיטוכונדריון שונים עבור rhodamine 123, אז זה עשויה להיות פליטת קרינה פלואורסצנטית שונים⁹. DiOC6(3) אינו מומלץ לגילוי MMP או כפי זה מגיב ברגישות דפולריזציה של קרום פלזמה¹⁰.

לכן, כאן אנו משתמשים וזמינותו JC-1 כדי להעריך את MMP HCMs לאחר נחשפים היפוקסיה/reoxygenation עם או בלי סוכן מגן.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

1. להכין בינוני מלא האנושי של תאי שריר הלב (HCMs) על-ידי הוספת 25 מ של מדיום הגידול Myocyte תוספת לערבב עד 500 מ"ל של מדיום הגידול Myocyte לפי הוראות היצרן. החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
2. הכנת Tongxinluo (TXL) פתרון על ידי המסת אבקת חדה במיוחד TXL סרום/גלוקוז ללא של Dulbecco שונה בינוני של הנשר (DMEM) ולהתאים את ריכוז TXL כדי µg 400/mL על-ידי הוספת DMEM (לקבלת פרטים נוספים, ראה¹¹). החנות 4 ° C וחמים עד 37 ° C לפני השימוש.
3. להכין 5 מ של הפתרון עובד JC-1 על-ידי הוספת µL 25 מניות פתרון (200 x) JC-1, 4 מיליליטר מים הנדסה גנטית ו 1 מ"ל של מניות מכתים מאגר (5 x) בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל בחושך. Pipette את התערובת לאורך מספר פעמים וחם עד 37 ° C לפני השימוש.
4. הכנת 30 מ של עובדים מאגר צביעת על-ידי הוספת 24 מ ל מים הנדסה גנטית 6 מ של מניות מכתים מאגר (5 x) בשפופרת צנטרפוגה 50 מ. השתמש פתרון זה קרה כקרח.

2. הקמת מודל היפוקסיה/Reoxygenation

1. צלחת 1.0 x 10⁵ תאים לכל באר עם HCM להשלים במדיום צלחת טוב 6. לגדול כדי להגיע עם confluency של 70% חממה התא המכיל 5% CO אוויר₂ ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
2. לשטוף HCMs עם פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS). חושפים אותם בפני טיפולים שונים (400 µg/mL TXL או לא) ב 2 מ של סרום/גלוקוז ללא DMEM למשך 30 דקות לפני היפוקסיה ב חממה התא המכיל 5% CO אוויר₂ ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
3. דגירה HCMs בצנצנת אטום של חמצן (2.5 L) מצוידים עם זרז ניקוי חמצן חופשי, זירוז היפוקסיה עבור 18 h (איור 1 א'), ומחוון אנאירובית כדי למדוד את המתח חמצן בינוני^{11,12, 13}, בחממה התא המכיל 5% CO אוויר₂ ו- 95% ב- 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: זה לוקח בערך 1.5 h עבור catalyst ל ניקוי חמצן חופשי בצנצנת. לכן, HCMs נשמרים בצנצנת עבור 19.5 h לפני פתיחת הצנצנת. הצבע של מחוון אנאירובית משתנה מכחול בהיר בסביבה normoxic לבן חיוור במצב ובשפתיים (איור 1B).
4. Reoxygenate HCMs על-ידי הזזת את הצלחת היטב 6 בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO אוויר₂ ו- 95% עבור 2 h.

3. הכנה של HCMs עבור Cytometry זרימה

1. לחמם את פתרון חומצה (EDTA) טריפסין-ethylenediaminetetraacetic 0.25% ו- PBS כדי 37 מעלות צלזיוס.
2. וביופסיה בינוני מכל טוב, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולהוסיף 0.5 מ של 0.25% טריפסין לאורך החומה של הבאר.
3. דגירה ב 37 ° C עד כל HCMs כמעט מנותק (בערך 1 דקות).
4. להוסיף 1 מ"ל DMEM מלאה בינוני (DMEM בינוני עם 10% סרום שור עוברית) הבארות לנטרל את טריפסין. להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, גלולה HCMs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
5. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.
6. להוסיף 0.5 מ"ל של HCM בינוני מלא ו- 0.5 מ של הפתרון עובד JC-1 כל שפופרת. Resuspend את HCMs על ידי pipetting למעלה ולמטה.
7. מכסה כל הצינורות ברדיד אלומיניום, כדי למנוע הלבנת המחוון פלורסנט, תקופת דגירה HCMs בתנאים נורמליים (ב 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO₂ ו- 95% אוויר) של 20 דקות.
8. HCMs צנפה מאת צריך שתוציאו ב 500 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
9. לשטוף HCMs פעמיים עם 2 מ"ל כקרח מאגר מכתימים JC-1.
10. Resuspend HCMs באמצעי אחסון הסופי של µL 300 קר כקרח מכתימים המאגר בצינור מדגם (12 מ"מ x 75 מ"מ) ולהשתמש התאים לניתוח בתוך 30 דקות.
    הערה: השתמש קרבוניל ציאניד m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), מעכב חזק של שרשרת הנשימה תחבורה אלקטרון, טיפול HCMs h 1 ריכוז של 20 מיקרומטר, עבור הפקד חיובי.

4. זרימה Cytometer ההתקנה

1. להתחיל את cytometer זרימה ולהבטיח כי התוכנה מחובר אליו.
2. לבצע אתחול פלואידיקה, להתחיל את הזרם ולהגדיר את breakoff.
3. החלונות הפתוחים של מגרש נקודה שני בתוכנה cytometry זרימה.
   1. קדימה בחר פזורים אור (FSC) בציר ה-X ואת הצד מפוזרים האור (האס) על ציר Y בחלקה הראשון ' נקודה ' כדי לייצג את המאפיינים של התאים מבחינת גודלם, צפיפות שלהם, בהתאמה.
   2. בחר PE (575 ± 26 ננומטר) זיהוי הערוץ עבור ציר Y ו- FITC (530 ± 30 ננומטר) עבור ציר ה-X באמצעות לוגריתמי בעלילה נקודה שנייה, אשר נמצא בשימוש כדי למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית JC-1 צבע בתאים.

5. לזרום Cytometry מדידה וניתוח נתונים

1. לחץ על ביטול טעינה לתת את הצינור לתמוך בזרוע ומקם את ריק (HCMs זה לא היה כבר לצבוע עם JC-1) מדגם צינור על זה. לחץ על טען כדי להחזיר את הזרוע תמיכה צינור למיקום העבודה.
2. לחץ על רשומה כדי לאסוף חלקיקי מהשעיה בצינור מדגם ריק ואז שער האוכלוסייה תא (P1) לצורך ניתוח נוסף בעלילה נקודה ראשונה (איור 3).
3. לאסוף HCMs צינורות אחרים דוגמת ולמטב את המדידה על-ידי התאמת החשמלי של ערוצי פלורסצנטיות, כדי לוודא כי הנקודה תא ממוקם באזור מרכזי של העלילה נקודה שנייה.
4. הצגת הנתונים הסטטיסטיים של כל שפופרת מדגם ולחשב את MMPs של כל דגימה על-ידי חלוקת היחס בעוצמה פלואורסצנטי אדום על ידי קרינה פלואורסצנטית ירוק בעוצמה.

תוצאות

לפני ביצוע וזמינותו JC-1 כדי להעריך את השינויים של MMP, מומלץ מאוד כי ניסויים להתבצע כדי לאשר את התנאים בהצלחה הגדר על ידי החוקרים. כפי שמוצג על ידי התוצאות cytometry זרימה (איור 2), בהשוואה עם הקבוצה נורמלי, היפוקסיה/reoxygenation (H/R) המושרה באופן משמעותי את אפופטוזיס של ...

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה JC-1 צבע כדי להעריך את MMP של תאים לאחר חשיפה H/ר זוהה על ידי assay JC-1, MMP של תאים הוא עצמאי של גורמים כגון גודל מיטוכונדריאלי, הצורה צפיפות שעשוי להשפיע על רכיב יחיד קרינה פלואורסצנטית אותות¹⁴. כתוצאה מכך, התוצאות של JC-1 assay אמינים יחסית. חוץ מזה, זה נוח, לחי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Beyodtime, China	C2006	In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powder	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Human cardiac myocyte	Promocell, Germany	C-12810
Myocyte Growth Medium (SupplementMix)	Promocell, Germany	C-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell, Germany	C-22070	used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENbox	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96127	2.5L
Catalyst (AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan	C-1
Anaerobic indicator	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96118
Flow cytometer	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Version8.0.1
Sample tube	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01