Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию

Резюме

Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска оценить потенциал митохондриальной мембраны клеток после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.

Аннотация

Своевременное и эффективное реперфузии перекрытых коронарной артерии является лучшей стратегией для уменьшения размера при инфаркте миокарда у больных с ST-сегмента повышенных инфаркт миокарда. Однако реперфузия само по себе может привести к дальнейшей cardiomyocyte смерти, явление, известное как реперфузионных повреждений. Открытие митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP), с уменьшение потенциальных митохондриальной мембраны (СПП), или митохондриальной деполяризации, повсеместно признается в качестве заключительного шага реперфузионных повреждений и отвечает за митохондриальных и смерть cardiomyocyte. JC-1 является липофильных Катионный красителем, который накапливается в митохондрии в зависимости от значения ММП. Выше МЦП, больше JC-1 накапливается в митохондриях. Все большее количество JC-1 в митохондриях могут быть отражены с флуоресцентным выбросов переход от зеленого (~ 530 Нм) красный (~ 590 нм). Таким образом сокращение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может указывать деполяризации митохондрий. Здесь мы берем преимущество JC-1 для измерения ММП, или открытие mPTP в культивировании человека после гипоксии/реоксигенацию, обнаруживаемых проточной цитометрии.

Введение

Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире. Препаратом выбора для уменьшения ишемических повреждений и ограничивая размер infarct у больных с ST-сегмента повышенной инфаркт миокарда является своевременным и эффективным миокарда реперфузии через первичного чрескожного коронарного вмешательства (PCI)^{1, 2}. Однако реперфузия вызывает дополнительные повреждения, которые могут составлять до 30 процентов окончательной инфаркте размер³. Повсеместно признается, что митохондриальной проницаемость переходного поры (mPTP) не только Центральной в митохондриальной смерти повреждения и клетки во время ишемии/реперфузии (I / R), но также сходящихся мишенью кардиопротекторное сигнализации^{4 , 5}. как открытие mPTP принесет деполяризации внутренней митохондриальной мембраны потенциал (СПП)⁴, мы обнаружили mPTP открытия с помощью 5, 5 ', 6, 6 ' тетрахлор-1, 1′, 3, 3 ' тетраэтил imidacarbocyanineiodide (JC-1) пробирного.

Assay JC-1 является метод cytofluorimetric, который как качественные, так и количественных, и он далее протестирована, анализируя ММП на уровне одной митохондрии⁶. JC-1 существует в агрегированной форме, уступая красный оранжевый цветные выбросов (590 нм ± 17,5) в матрице митохондрий с обычной СПП; с потерей ММП JC-1 преобразуется в односегментную форму, которая дает зеленый флуоресценции с выбросами 530 нм ± 15. Таким образом, снижение коэффициента интенсивности флуоресценции красный/зеленый может означать сокращение ММП в условиях ишемии/реперфузии (I / R).

В дополнение к JC-1 ММП также были изучены с проницаемой мембраны липофильных катионов как родамин 123 и 3, 3 ' dihexyloxadicarbocyanine йодид [DiOC6(3)]. Однако по сравнению с этих двух зондов, JC-1 является более надежным для анализа ММП. Родамин 123 имеет сравнительно бедных чувствительность (особенно в закалки режим^7,8) и бедных специфичности. Сдвиг в родамин 123 иногда настолько мала, что это трудно для исследователей или оборудование для обнаружения и наблюдения. Кроме того в отдельной ячейке, есть различные митохондрий привязки сайтов для родамин 123 и так, что оно может иметь различные флуоресценции выбросов⁹. DiOC6(3) не рекомендуется для обнаружения MMP либо, как он чутко реагирует на деполяризации мембраны плазмы¹⁰.

Таким образом здесь мы используем пробирного JC-1 для оценки СПП МСБ после воздействия гипоксии/реоксигенацию с или без защитного агента.

протокол

1. Подготовка реагентов и решения

1. Подготовка полного среднего человека культивировании (МСБ) путем добавления 25 мл смеси среднего роста Myocyte дополнение к 500 мл Myocyte среднего роста в соответствии с инструкциями производителя. Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
2. Приготовляют раствор Tongxinluo (TXL) путем растворения TXL ультрадисперсных порошок в сыворотке крови, глюкоза свободно Дульбекко изменение средних орла (DMEM) и регулировка концентрации TXL до 400 мкг/мл, добавив DMEM (для более подробной информации, см.¹¹). Хранить при 4 ° C и тепло до 37 ° C перед использованием.
3. Подготовьте 5 мл JC-1 рабочего раствора путем добавления 25 мкл Стоковый раствор (200 x) JC-1, 4 мл сверхчистой воды и 1 мл бульона, окрашивание буфера (5 x) в пластиковых пробирок 15мл в темноте. Пипетка смесь вверх и вниз несколько раз и нагреть до 37 ° C перед использованием.
4. Подготовьте работы окрашивание буфера путем добавления 6 мл бульона, окрашивание буфера (5 x) в 50 мл пластиковых пробирок 24 мл ультрачистая вода по 30 мл. Используйте это решение ледяной.

2. Создание гипоксии/реоксигенацию модели

1. Пластина 1.0 x 10⁵ клеток на колодец с полного среднего HCM в 6 пластины хорошо. Расти, чтобы достичь confluency около 70% в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха при 37 ° C.
2. Промойте МСБ фосфатный буфер (PBS). Предоставить различные виды лечения (400 мкг/мл TXL или нет) по 2 мл сыворотки/глюкозы-Free DMEM за 30 мин до гипоксии в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха при 37 ° C.
3. Инкубировать МСБ в герметичном и гипоксических банку (2,5 Л) оснащены катализатором Мусоробот свободного кислорода и заставить гипоксии для 18 h (рис. 1A) и анаэробной индикатор для измерения напряжения кислорода в средних^{11,12, 13}, в инкубаторе ячейки, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха при 37 ° C.
   Примечание: Она занимает около 1,5 часа для катализатора очистить свободного кислорода в банку. Таким образом МСБ хранятся в банку для 19,5 ч, перед открытием jar. Цвет анаэробных индикатора меняется от светло-голубой в нормоксические среде бледно белый в состоянии гипоксии (рис. 1B).
4. Reoxygenate МСБ, перемещая 6 хорошо пластины в инкубаторе набор при 37 ° C, содержащих 5% CO₂ и 95% воздуха за 2 ч.

3. Подготовка МСБ для проточной цитометрии

1. Теплый 0,25% раствор трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и PBS до 37 ° C.
2. Аспирационная среднего от каждой скважины, промойте клетки с 1 мл раствора PBS и добавить 0,5 мл 0,25% трипсина вдоль стены колодца.
3. Инкубируйте при 37 ° C, до тех пор, пока все МСБ почти отдельностоящий (около 1 мин).
4. Добавьте 1 mL DMEM полной среды (DMEM средний с 10% плода бычьим сывороточным) к скважинам для нейтрализации трипсина. Передать пластиковых пробирок 15 мл суспензии клеток и Пелле МСБ центрифугированием на 500 g x 3 мин при комнатной температуре.
5. Тщательно удалить супернатант не нарушая гранулы.
6. Добавьте 0,5 мл HCM полного среднего и 0,5 мл JC-1 рабочего раствора в каждую пробирку. Ресуспензируйте МСБ, закупорить вверх и вниз.
7. Покрывают весь трубы с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентный индикатор и инкубировать МСБ в нормальных условиях (при 37 ° C, содержащих 5% CO₂ и 95% воздуха) 20 мин.
8. Пелле МСБ центрифугированием на 500 g x 3 мин при 4 ° C.
9. Промойте МСБ дважды с 2 мл ледяной JC-1 окрашивание буфера.
10. Ресуспензируйте МСБ в окончательный объем 300 мкл ледяной окрашивание буфера в образец трубки (12 мм x 75 мм) и использовать клетки для анализа в течение 30 мин.
    Примечание: Используйте карбонильных цианида m хлорфенил гидразоны (CCCP), мощный ингибитор дыхания электрон-транспортной цепи, для лечения МСБ на 1 ч в концентрации 20 мкм, для позитивного элемента управления.

4. потока цитометр установки

1. Запустите проточный цитометр и убедитесь, что программное обеспечение подключен к нему.
2. Выполняют fluidics запуска, запуск потока и создать отрыв.
3. Откройте два окна участок точка в программном обеспечении цитометрия потоков.
   1. Выберите вперед разбросаны свет (FSC) на оси X и стороны рассеянного света (SSC) на оси Y в первый участок точка представляют характеристики клеток с точки зрения их размера и их гранулярности, соответственно.
   2. Выберите канал обнаружения (575 Нм ± 26) PE для оси Y и FITC (530 ± 30 Нм) для оси X, используя логарифмическую шкалу в второй участок точка, которая используется для измерения интенсивности флуоресценции JC-1 краска в клетках.

5. поток цитометрии измерение и анализ данных

1. Нажмите кнопку выгрузить из трубки поддержка руку и поместите пустой (МСБ, не был окрашенных с JC-1) образец трубки на нем. Нажмите кнопку загрузки для возвращения трубки поддержка руку в рабочее положение.
2. Нажмите кнопку запись для сбора частиц взвеси в пустой образец трубки и затем ворота популяции клеток (P1) для дальнейшего анализа в первой точкой сюжета (рис. 3).
3. Собирать МСБ в других пробоотборные трубки и оптимизировать измерение, регулируя напряжение флуоресценции каналов, чтобы убедиться, что клетки точка расположен в центральном районе второго участка точка.
4. Отображение статистики каждого образца трубки и рассчитать путем деления отношение интенсивности красной флуоресценцией, зеленой флуоресценцией интенсивности равенству каждого образца.

Результаты

Перед выполнением assay JC-1 для оценки изменений ММП, настоятельно рекомендуется, что быть проведены эксперименты для подтверждения условий успешно установленные исследователи. Как показывают результаты цитометрии потока (рис. 2), по сравнению с обычной ?...

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол, использующий JC-1 краска для оценки СПП клеток после подвергнуться Ч/р. обнаружено пробирного JC-1, ММП клеток зависит от таких факторов, как митохондриальных размер, форму и плотность, которые могут повлиять однокомпонентный флуоресценции сигналы

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Beyodtime, China	C2006	In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafine powder	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Human cardiac myocyte	Promocell, Germany	C-12810
Myocyte Growth Medium (SupplementMix)	Promocell, Germany	C-39275
Myocyte Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell, Germany	C-22070	used with Myocyte Growth Medium SupplementMix
GENbox	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96127	2.5L
Catalyst (AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan	C-1
Anaerobic indicator	BioMérieux, Marcy l’Etoile, France	96118
Flow cytometer	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Version8.0.1
Sample tube	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01