JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum הפלזמודיום באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9.

Abstract

מלריה היא גורם משמעותי התחלואה והתמותה ברחבי העולם. מחלה זו, המשפיעה בעיקר הגרים באזורים טרופיים וסובטרופיים, נגרמת על ידי זיהום עם הפלזמודיום טפילים. הפיתוח של תרופות יעילות יותר מלריה לחימה יכול להיות מואץ על ידי שיפור ההבנה שלנו של הביולוגיה של טפיל זה מורכב. הנדסה גנטית של טפילים אלו הוא מפתח להבנת הביולוגיה שלהם; עם זאת, מבחינה היסטורית הגנום של falciparum פ היה קשה לתמרן. לאחרונה, CRISPR/Cas9 הגנום עריכה יש כבר מנוצל טפילי מלריה, המאפשרות קל יותר חלבון תיוג, דור של חלבון מותנה נפילות, ומחיקה של גנים. CRISPR/Cas9 הגנום עריכה הוכיחה להיות כלי רב עוצמה לקדם את תחום המחקר מלריה. כאן, אנו מתארים שיטה CRISPR/Cas9 ליצירת glmS-המבוסס על מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum פ. שיטה זו היא וישימה מאוד לסוגים אחרים של שינויים גנטיים, כולל חלבון תיוג והסתרות ג'ין.

Introduction

מלריה היא מחלה הרסנית הנגרמת על ידי טפילים protozoan של הסוג הפלזמודיום. Falciparum פ, טפיל המלריה קטלני אנושי ביותר, גורמת כ 445,000 מקרי מוות בשנה, בעיקר אצל ילדים מתחת לגיל חמש1. הפלזמודיום טפילים יש מחזור החיים מסובכים מעורבים וקטור יתוש לבין מחשב מארח חוליות. בני האדם הראשונים להידבק כאשר עקיצת היתוש הנגוע לוקח ארוחת דם. לאחר מכן, הטפיל פולש הכבד שבו זה גדל, מתפתח, מחלק למשך שבוע. לאחר תהליך זה, הטפילים משתחררים לזרם הדם, שם הם עוברים אל-זוויגית שכפול בתאי דם אדומים (RBCs). הצמיחה של הטפילים בתוך RBCs אחראים ישירות סימפטומים קליניים הקשורים עם מלריה2.

עד לאחרונה, ייצור הטרנסגניים falciparum פ היה תהליך מפרך, מעורבים כמה סבבים של מבחר סמים זה לקח חודשים רבים, היה שיעור גבוה כשל. Relieson זמן רב בהליך זה הדור של DNA אקראי שובר האזור עניין ויכולת אנדוגני של הטפיל לתקן את הגנום שלו למרות תיקון הומולוגי3,4,5,6 . לאחרונה, עריכה הגנום מקובצים באופן קבוע Interspaced Palindromic חוזר/Cas9 (CRISPR/Cas9) יש כבר בהצלחה מנוצל falciparum פ7,8. המבוא של טכנולוגיה חדשה זו במחקר המלריה כבר קריטי לקידום ההבנה של הביולוגיה של אלה טפילים הפלזמודיום קטלני. CRISPR/Cas9 מאפשר מיקוד ספציפי של גנים דרך מדריך RNAs (gRNAs) כי הם הומולוגיים אל הגן עניין. GRNA/Cas9 מורכבים מזהה את הגן דרך gRNA, Cas9 מציג ואז הפסקה כפולה-strand, מכריח את החניכה של מנגנוני תיקון האורגניזם9,10. כי falciparum פ חסר המנגנון כדי לתקן את ה-DNA פורץ דרך קצה שאינם הומולוגיים להצטרף, זה מנצל מנגנונים רקומבינציה הומולוגית ו משתלב transfected תבניות DNA הומולוגי כדי לתקן את Cas9/gRNA-induced זוגיות-strand break11,12.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של מוטציות תמונות ציפורים מותנה ב- falciparum פ באמצעות עריכת הגנום CRISPR/Cas9. הפרוטוקול מדגים את השימוש ריבוזים glmS רמות חלבון מותנית תמונות ציפורים של PfHsp70x (PF3D7_0831700), מלווה ב"יצוא falciparum פ לתוך המארח RBCs13,14. ריבוזים glmS מופעל על-ידי טיפול עם גלוקוזאמין (אשר מומר גלוקוזאמין-6-פוספט בתאים) כדי לדבוק mRNA המשויכת שלו, מוביל לירידה חלבון14. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לנצל כלים תמונות ציפורים מותנה אחרים, כגון הקשורה תחומים או RNA aptamers4,5,15. פרטי פרוטוקול שלנו הדור של פלסמיד תיקון המורכב hemagglutinin (HA) תג ו glmS ריבוזים קידוד רצף ולצדו רצפים שהם הומולוגי מסגרת קריאה פתוחה PfHsp70x (ORF) ו- 3'-UTR. אנו מתארים גם את הדור של פלסמיד השני נסיעה כביטוי של gRNA. פלסמידים אלה שני, לצד שלישי שמניע את הביטוי של Cas9, transfected לתוך RBCs, כדי לשנות את הגנום של טפילים falciparum פ . לבסוף, אנו מתארים את תגובת שרשרת פולימראזית (PCR)-מבוסס טכניקה כדי לוודא שילוב של ריבוזים התג ואת glmS . פרוטוקול זה הוא מאוד וישימה עבור שינוי או הסתרה מלאה של כל הגנים falciparum פ , שיפור היכולת שלנו ליצור תובנות חדשות הביולוגיה של טפיל המלריה.

Protocol

תרבות רציפה של falciparum פ מחייב שימוש RBCs האנושי, אנחנו מנוצל היחידות שנרכשו מסחרית של דם היו ללא כל מזהי, תשוחררנה. ועדת הבדיקה מוסדיים ו- Office של אבטחה ב אוניברסיטה של גאורגיה לסקור את כל מנגנוני ואושר כל הפרוטוקולים בשימוש המעבדה שלנו.

1. בחירת gRNA רצף

  1. ללכת צ'ופצ'ופ (http://chopchop.cbu.uib.no/) ובחר ' Fasta היעד '. תחת 'יעד', להדביק את זוגות בסיס 200 מסוף 3' של מסגרת קריאה פתוחה (ORF) של גנים ו- 200 בסיסי זוגות מנקודת ההתחלה של 3'-UTR ג'ין. תחת 'בתוך', בחר 'falciparum פ' (3D 7 v 3.0), ובחר ' CRISPR/Cas9 ' תחת 'שימוש'. לאחר מכן, לחץ על ' למצוא אתרי היעד '.
  2. בחר gRNA רצף האפשרויות המוצגות, להעדיף gRNA היעילה ביותר זה קרוב לאתר של השינוי ושיש לה את האתרים את המטרה המצומצמות.
    הערה: רצפים gRNA פוטנציאליים מזוהים כי הם מיד במעלה הזרם של Protospacer הסמוך מוטיב (פאם), אשר נדרש עבור גיוס של Cas9 ל- DNA. רצף זה הוא משובטים לתוך pMK-U6, הווקטור שמניע את הביטוי gRNA, הוא בסיסי 20 מיד הזרם של פאם. פאם ספציפיות עבור הפישחה ינפל תומימת ס Cas9 הרצף נוקלאוטיד הגולה, שאין לכלול ברצף, כי הוא משובטים לתוך pMK-U6.
    הערה: צ'ופצ'ופ חזותית מדרג את רצפי gRNA, הצגת האפשרויות הטובות ביותר בירוק, האפשרויות פחות אידיאלי בתוך ענבר, ואפשרויות הגרוע באדום. צ'ופצ'ופ נותן כל רצף gRNA ציון יעילות המחושבת באמצעות הפרמטרים העדכנית ביותר שנמצאו בספרות, הם חזו את המטרה אתרים יכולים להיות מזוהים על-ידי gRNA. שניים או שלושה רצפים gRNA ייתכן שתצטרך להיות ניסו למצוא את gRNA הכי מתאים גן מסוים.
  3. לרכוש את רצף gRNA ולא הפוכה-המשלים שלו כמו oligos מטוהרים לזיהוי בג'ל. ניתן למצוא את רצף gRNA המשמש למטרה PfHSP70x איור 1B.
    הערה: oligo זו צריכה לכלול 15 בסיסי זוגות הומולוגי ל פלסמיד לבטא gRNA, אשר נחוצים רצף, ללא תלות מצדו שיבוט (לשרוף את הנגיף) לתוך ה-וקטור pMK-U616.

2. שיבוט gRNA את רצף לתוך pMK-U6

  1. לעכל את pMK-U6 עם BtgZI.
    1. Μg 10 תקציר של pMK-U6 עם 5 μL של האנזים BtgZI (5,000 יחידות/mL) עבור h 3 ב 60 מעלות צלזיוס. פעלתי לפי הנהלים של היצרן אנזים עבור תנאי ריאקציה
    2. לאחר תקופת הדגירה 3 h, להוסיף על μL 3 נוספים של BtgZI התגובה כדי להבטיח עיכול מלאה פלסמיד. לעכל עבור h 3 נוספים, עדיין עוקב להוראות היצרן להבטחת התנאים התגובה הנכונה.
    3. לטהר בקו U6-pMK מעוכל מן התגובה, להשתמש ערכת ניקוי PCR מבוססי עמודה לפי הוראות היצרן.
    4. להפריד את ה-DNA מעוכל בעזרת ג'ל agarose כ- 0.7% ולחלץ את הלהקה זוג 4,200-בסיסים.
  2. Anneal את oligos המכיל את רצף gRNA.
    1. לשקם את oligos טהור-דף כדי ריכוז של 100 μM בעזרת נוקלאז ללא מים.
    2. לשלב 10 μL של כל oligo עם μL 2.2 x 10 מאגר 2 (ראה טבלה של חומרים). ודא שעוצמת התגובה הכולל 22.2 μL.
    3. להפעיל את gRNA חישול בתוכנית thermocycler: שלב 1: 95 ° C, 10 דקות; צעד 2: 95 ° C, 1 s, עם ירידה בטמפרטורה של 0.6 ° C/מחזור; שלב 3: עבור לשלב 2, 16 פעמים; שלב 4: 85 ° C, 1 דקות; שלב 5: 85 ° C, 1 s, עם ירידה בטמפרטורה של 0.6 מעלות צלזיוס/מחזור; שלב 6: עבור לשלב 5, 16 פעמים; שלב 7: 75 ° C, 1 דקות; שלב 8: 75 ° C, 1 s, עם ירידה בטמפרטורה של 0.6 ° C/מחזור; שלב 9: עבור לשלב 8, 16 פעמים. שלבים 10 21: חזור על הפעולות להשתמש בשלבים 4 – 9 עד שהטמפרטורה מגיע ל- 25 ° C; שלב 22:25 ° C, 1 דקות.
  3. הכנס את oligos annealed gRNA פלסמיד BtgZI-מעוכלים וטיהרו ג'ל pMK-U6.
    1. Ng לשלב 100 של pMK מעוכל-U6 עם μL 1 של 10 x מאגר 2.1 ו- 3 μL של oligos annealed gRNA. להגדיל את נפח כדי μL 9.5 נוקלאז ללא מים.
    2. להוסיף 0.5 μL של פולימראז T4, דגירה התגובה בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות.
    3. להעביר את התגובה קרח, תקופת דגירה של 10 דקות.
    4. מיד להפוך μL 5 התגובה לתוך המוסמכת e. coli בהתאם להוראות של הספק חיידקים. צלחת את החיידקים על פלטות אגר Lysogeny מרק (ליברות) המכיל 100 μg/mL אמפיצילין.
    5. לאפשר טרנספורמציה לחיידקים לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן בחר מושבות ולחלץ את הדנ א בעזרת ערכת miniprep פלסמיד זמינים מסחרית.

3. תכנון אזורי הומולוגיה של תבנית תיקון

  1. עיצוב מגן מוטציות בתוך תבנית תיקון הומולוגיה כדי למנוע חיתוך מחדש של ה-DNA כי משולב לתוך הגנום.
    הערה: מוטציה המגן מורכב בדרך כלל של היכרות עם מוטציה שקטה כדי לשנות את פאם, כך Cas9 לא יניעו הפסקה בתבנית תיקון. פאם הנדרש עבור Cas9 בשימוש פרוטוקול זה הוא הרצף נוקלאוטיד "הגולה", איפה "N" נוקלאוטיד כלשהו. במידת האפשר, לשנות את אחד נוקלאוטידים G A, C, או טי
    1. אם פאם לא יכולה להיות מוטציה בשקט, להציג לפחות 2 מוטציות שקטות לתוך זוגות בסיס 6 סמוכים ישירות פאם7,8.
      הערה: מוטציות אלה למנוע הכרה של תבנית תיקון על ידי gRNA ולמנוע מחדש חיתוך של מיקומה תוקן על ידי Cas9/gRNA מורכבות. מוטציות מגן שיוכל להיכנס לתוך האזור הומולוגיה על ידי הגברה ה-DNA עם תחל המכילים את המוטציה.
  2. להגביר את האזור הומולוגיה ORF עבור תבנית תיקון.
    1. באמצעות PCR, להגביר את 800 בסיסי זוגות מהקצה 3' של ORF ג'ין היעד. עיצוב תחל שישמש כדי לא לכלול את stop codon אמפליקון הזה.
    2. לעצב את צבעי יסוד החדרת אמפליקון הזה לתוך פא -glmS זה עיכולו עם SacII ו- AfeI דרך ה-DNA מצדו תגובה או לשרוף את הנגיף16.
  3. להגביר את האזור הומולוגיה 3'-UTR עבור תבנית תיקון.
    1. באמצעות PCR, להגביר את זוגות בסיס 800 מיד לאחר את stop codon של הגן היעד. עיצוב צבעי יסוד החדרת אמפליקון הזה לתוך פא -glmS זה עיכולו ועם HindIII NheI דרך ה-DNA מצדו תגובה או לשרוף את הנגיף16.
      הערה: הגבוה-תוכן של הגנום פ falciparum יכול להקשות הגברה של אזורים כגון UTRs. גישה חלופית באמצעות PCR היא סינתזה האזורים הומולוגיה.

4. שיבוט את האזורים הומולוגיה לתוך פלסמיד לתקן

  1. הכנס את האזור הומולוגיה ORF פא -glmS.
    1. לעכל את פא -glmS עם SacII, AfeI, על פי הוראות היצרן אנזים. הכנס את המוצר PCR ORF אזור הומולוגיה פלסמיד מעוכל בעזרת לשרוף את הנגיף16.
    2. להפוך המוסמכת e. coli כפי שבוצע בשלבים 2.3.4 ו 2.3.5.
  2. להכניס את האזור הומולוגיה 3'-UTR פלסמיד פא-glmS שכבר מכיל את אזור הומולוגיה ORF (ראה שלב 4.1).
    1. לעכל את פלסמיד עם HindIII, NheI על פי הוראות היצרן אנזים. הכנס את 3'-UTR הומולוגיה אזור אמפליקון פלסמיד מעוכל בעזרת לשרוף את הנגיף16.
    2. להפוך המוסמכת e. coli ולחלץ את פלסמיד ה-DNA (שלבים 2.3.4 ו 2.3.5).

5. מאיצים את הדנ א של תרביות תאים

  1. להוסיף 40 μg כל של pMK-U6 pUF1-Cas9, פא -glmS DNA (עבור סכום כולל של 120 μg של ה-DNA) לתוך צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי.
  2. להוסיף 1/10th האחסון של ה-DNA של 3 מ' סודיום אצטט במים (pH 5.2) אל הצינור ומערבבים היטב בעזרת מערבולת (למשל, אם אמצעי האחסון בשלב 5.1 היה 100 μL, להוסיף 10 μL של סודיום אצטט).
  3. להוסיף פי 2.5 הנפח של 100% אתנול הצינור ומערבבים היטב בעזרת מערבולת לפחות ב-30 s (למשל, אם האחסון ב- 5.1 היה 100 μL, להוסיף 250 μL של 100% אתנול).
  4. מקם את הצינורית על קרח או ב-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. Centrifuge את הצינור ב x 18,300 g למשך 30 דקות ב 4 º C.
  6. הסר בזהירות את תגובת שיקוע מהצינור. נא לא להפריע בגדר.
  7. להוסיף 3 פעמים את הנפח של 70% אתנול הצינור ומערבבים בקצרה באמצעות מערבולת (למשל., אם האחסון ב- 5.1 היה 100 μL, להוסיף 300 μL של 70% אתנול).
  8. Centrifuge את הצינור ב x 18,300 g למשך 30 דקות ב 4 º C.
    הערה: שלב זה צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בבטיחות הביולוגי ארון.
  9. הסר בזהירות את תגובת שיקוע מהצינור. נא לא להפריע בגדר. השאר את השפופרת פתוח ולאפשר בגדר מילה נהדרת. למשך 15 דקות.
  10. חנות ה-DNA precipitated ב-20 ° C עד הוא נדרש עבור תרביות תאים.

6. בידוד RBCs האנושי של דם מלא כהכנה תרביות תאים

  1. דם טרי aliquot לתוך צינורות חרוט סטרילי 50 מ ל (כ 25 mL למחזור).
  2. Centrifuge הצינורות ב x 1,088 g למשך 12 דקות, עם בלמים צנטריפוגה מוגדרת כ- 4.
  3. . תשאף המעיל supernatant, באפי. Resuspend בגדר RBC עם אמצעי אחסון שווה של RPMI לא שלם.
    הערה: לא שלם RPMI מוכן להשלים RPMI 1640 עם תימידין μM 10.32 110.2 μM hypoxanthine, 1 מ מ נתרן פירובט, 30 מ מ סודיום ביקרבונט, 5 מ מ HEPES, מ"מ 11.1 גלוקוז, גנטמיצין 0.02% (v/v).
  4. חזור על שלבים 6.2-6.3 פעמיים. לאחר השטיפה האחרונה resuspend את RBCs שווה ףקיהב RPMI לא שלם ולאחסן את הצינורות ב 4 º C.

7. transfecting RBCs עם פלסמידים CRISPR/Cas9 (כדי לבצע גילוח ורחיצה כירורגית)

הערה: תרבויות falciparum פ נשמרים כפי שמתואר הדוחות האחרים17. לשמור על כל התרבויות ב 37 ° C תחת 3% או2, 3% CO2ו- 94% N2 אלא אם צוין אחרת. בכל פעם דם נעשה שימוש בפרוטוקול זה, זה מתייחס כדוריות דם אדומות טהור מוכן בשלב 6. הדם בשימוש לא אמור שגילן עולה על 6 שבועות, כפי שיש בדרך כלל בירידה תפוצת הטפיל בדם בוגרים. השלבים הבאים מתארים RBCs טעינת מראש עם ה-DNA והוספת תרבות טפיל על התאים transfected. פרוטוקולים מבוססת תקנים אחרים תואמים transfecting18,אלה בונה19.

  1. להכין מאגר x cytomix 1 במים (120 מ"מ אשלגן כלורי, 0.15 מ מ CaCl2, 2 מ מ EGTA, 5 מ מ MgCl2, 10 מ מ K2HPO4, 25 מ מ HEPES, pH 7.6). מסנן-המאגר באמצעות מסנן 0.22 μm לחטא.
  2. הוסף μL 380 של cytomix 1 x ל- DNA זירז בשלב 5 ו מערבולת להתמוסס. לאפשר את ה-DNA להמיס cytomix 1 x במשך 10 דקות, vortexing כל 3 דקות 10 s.
  3. בצינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל, לשלב μL 300 של RBCs (המטוקריט 50%, משלב 6) ב RPMI לא שלם עם 4 מ ל 1 x cytomix.
  4. Centrifuge את RBCs מהשלב 7.3 ב x 870 g למשך 3 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע בגדר RBC.
  5. Resuspend של RBC גלולה עם התערובת DNA/cytomix מ שלב 6.2 ומעבר cuvette אלקטרופורציה 0.2 ס מ.
  6. Electroporate RBCs שימוש בתנאים הבאים: 0.32 נקודות kV, 925 μF, קיבוליות מוגדר "כובע גבוה", והתנגדות מוגדר "אינסוף".
  7. בעקבות אלקטרופורציה, להעביר את התוכן cuvette mL 15 מ"ל 5 המכיל חרוט של שלמה RPMI (cRPMI). Centrifuge את הצינור ב x 870 g למשך 3 דקות ב- 20 ° C ולאחר מכן decant את תגובת שיקוע.
    הערה: cRPMI מוכן באמצעות השיטה זהה RPMI לא שלם עם התוספת של 0.25% (w/v) פרה עתירת שומנים בדם אלבומין.
  8. Resuspend בגדר ב 4 מ"ל של cRPMI, העברה אל באר אחת בצלחת תרביות רקמה 6-. טוב. להוסיף 400 μL של תרבות גבוהה-schizont (parasitemia schizont 7 – 10% הוא אידיאלי) RBCs transfected.
    הערה: Parasitemia מוגדר כאחוז RBCs נגוע טפיל.
  9. למחרת, לשטוף את התרבות עם 4 מ של cRPMI. Centrifuge התרבות ב g x 870 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend התרבות ב- 4 מ של cRPMI.
  10. 48 שעות לאחר השלמת שלב 7.6, לשטוף את התרבות עם 4 מ של cRPMI. ואז resuspend את התרבות ב- cRPMI המכיל 1 μM DSM1 כדי למצוא פלסמיד Cas9.
  11. ממשיכים לשטוף את התרבויות כל יום עם cRPMI עד טפילים אינן גלויות על ידי דם. לאחר נקודה זו, להחליף את המדיום תרבות עם cRPMI טרי בתוספת 1 μM DSM1 כל 48 שעות.
    1. כדי להפוך את דם להימרח, פיפטה 150 μL של תרבות לתוך שפופרת צנטרפוגה 0.6 מ"ל. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב x 1,700 g ב-30 s.
    2. תשאף את תגובת שיקוע. להשתמש פיפטה כדי להעביר את התאים pelleted זכוכית. סלייד זכוכית השני החזיק בזווית של 45° לשקופית הראשונה, ימרחו דם ה-droplet. מכתים את השקופית באמצעות ערכת מכתימים זמינים מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. הצג טפילים באמצעות 100 X שמן טבילה אובייקטיבי.
  12. מתחיל 5 ימים שלאחר תרביות תאים (שלב 7.6), להסיר 2 מ"ל של התרבות עם RBCs resuspended במדיום תרבות. להוסיף גב 2 מ"ל בינוני טריים (cRPMI פלוס 1 μM DSM1) ואת הדם-המטוקריט 2%. הוסף דם טרי באופן זה לפקדים לאחר שבוע עד טפילים להופיע שוב, כפי שנקבע על ידי דם דליל השמצות (שלב 7.11).
    הערה: אם שילוב מוצלח, טפילים בדרך כלל יופיעו מחדש בתרבות לפי תקנים שלאחר חודש אחד.
  13. פעם טפילים צצים, להסיר את הלחץ סמים DSM1. לחלופין, הסרת הלחץ סמים לאחר טפילים שיבוט החוצה.

8. בדיקת טפילים שילוב של תבנית תיקון

  1. כאשר טפילים גלויים שוב על ידי דם דקים, לבודד דנ א מתרבות באמצעות ערכת המתאים.
  2. השתמש PCR כדי להגביר את האזור שונה של הגנום כדי לקבוע אם מיקומה יישוב שונתה בהצלחה ואם מיקומה פראי-סוג שלא שונתה (מרמז על טפילים פראי-סוג) לזיהוי.
    1. כדי לזהות טפילים שילבו את תבנית תיקון, השתמש פריימר לפנים שיושב בתחילת ORF, מחוץ לאזור הומולוגיה משובטים. השתמש פריימר הפוך זה יושב על 3'-UTR.
      הערה: כפי הגברה זו כוללת מסדרות התגים HA ואת ריבוזים glmS , amplicons תוזנה משולב יהיה יותר באותו אזור מוגבר בפראי-סוג טפילים.

9. שיבוט את הטפילים על-ידי הגבלת דילול

  1. ביצוע דילולים טורי של התרבות טפיל מהשלב 7.13 להשגת ריכוז סופי של 0.5 μL טפילים/200. להוסיף 200 μL של התרבות מדולל הבארות של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן.
    הערה: מאחר parasitemia מוגדר כאחוז RBCs נגוע המטוקריט הוא גם מספר מוגדר (2%), המספר של טפילים לכל יחידת נפח היא בקלות להסיק.
    1. להכין 1 מ"ל של התרבות ב- cRPMI ב 5% parasitemia ו- 2% המטוקריט (ברמות האלה parasitemia, המטוקריט, התרבות מכילה טפילים7 עונה 1 פרק 10/mL).
    2. לדלל הזה בטחונות תרבות עם cRPMI. לדלל שוב מטריים עם cRPMI.
    3. לדלל 1:400. לבצע דילול זו על-ידי הוספת μL 62.5 של תרבות 25 מ של cRPMI ו- 1 מ"ל של דם. דילול זה תוצאות הריכוז הרצויה של 0.5 μL טפילים/200.
  2. לשמור על הצלחת השיבוט עד טפילים לזיהוי הבארות.
    1. כל 48 שעות, החלף את המדיום בצלחת 96-ובכן בינוני טריים.
    2. פעם בשבוע, החל 5 ימים לאחר תחילת את הצלחת השיבוט (שלב 9.1), להסיר 100 μL מכל קידוח ולהוסיף בחזרה 100 μL בינוני טריים + הדם (המטוקריט 2%).
  3. לזהות כל בארות המכיל טפילים.
    1. מקם את הצלחת 96-ובכן בזווית של 45 מעלות במשך כ- 20 דקות, המאפשר את הדם להתיישב בזווית בתוך הלוח.
    2. מניחים את הצלחת 96-ובכן על תיבת האור. שים לב כי הבארות המכיל טפילים להכיל מדיה צהוב בצבע, לעומת התקשורת ורוד של בארות נטולת טפיל, עקב לחומצי המדיום על ידי הטפילים.
    3. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התוכן של הבארות המכילות טפיל צלחת 24-ובכן תרביות רקמה כדי לאפשר הרחבה של parasitemia.
    4. באמצעות ניתוח PCR כפי שמתואר בשלב 8, בדוק שורות אלה טפיל המשובטים לשילוב הנכון.

10. נוקאאוט של החלבון על ידי טיפול טפילים גלוקוזאמין, אישור דרך ניתוח תספיג חלבון

  1. להכין פתרון מניות GlcN (גלוקוזאמין) 0.5 M, יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C.
  2. להוסיף GlcN התרבויות טפיל glmS ולאפשר להם לגדול בנוכחות GlcN.
    הערה: הריכוז הסופי ואת העיתוי של טיפול GlcN תלוי הקו ניסוי, טפיל. GlcN יכולים להשפיע טפיל הצמיחה, כך המתח טפיל הורים צריך להיחשף ריכוזים טווח של GlcN כדי לקבוע את הרגישות שלה למתחם. לעתים קרובות, ריכוז של 2.0-7.5 מ מ GlcN הוא בשימוש13,14,20.
  3. לבודד חלבון דגימות שטופלו GlcN טפילים13.
  4. השתמש דגימות חלבון לניתוח תספיג לזהות הפחתות חלבון13.
    1. השתמש נוגדן anti-HA לפי הוראות היצרן כדי לזהות את החלבון HA-glmS-מתויגים '. להשוות את הלהקה HA פקד הטעינה, כגון PfEF1α.

תוצאות

תיאור סכמטי של פלסמידים בשימוש בשיטה זו, כמו גם דוגמה של מוטציה מגן מוצגים באיור1. כדוגמה כיצד לזהות טפילים מוטציה לאחר תרביות תאים, תוצאות מותני לבדיקת קליטת HA -glmS לבנות מוצגים באיור2. תמונת הנציגה של צלחת שיבוט מוצג באיור

Discussion

היישום של CRISPR/Cas9 ב falciparum פ יש את יעילות של והן ירד כמות הזמן הנדרשת עבור שינוי הגנום של הטפיל, לעומת שיטות קודמות של הנדסה גנטית. פרוטוקול מקיף זה מתאר את השלבים הנחוצים ליצירת מוטציות מותנה באמצעות CRISPR/Cas9 ב פ falciparum. בעוד השיטה כאן מיועדת במיוחד עבור הדור של HA -glmS מוטציות, אסטרט...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים kandasamy ב Muthugapatti בתוך ליבת מיקרוסקופ הביו-רפואית מאוניברסיטת ג'ורג'יה (עוגה) לקבלת סיוע טכני, חואן חוסה לופז-רוביו על שיתוף של פלסמידים pUF1-Cas9 ו- pL6. עבודה זו נתמכה על ידי קשתות קרן פרסים D.W.C., H.M.K., עוגה כספים אתחול כדי V.M., מענקים מקרן מרץ של מטבעות (בזיליקום אוקונור Starter מלומד מחקר פרס) V.M., לנו מכון הבריאות הלאומי מעניק (R00AI099156, R01AI130139) כדי V.M., (T32AI060546) כדי H.M.K.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
AmpicilinFisherBP1760-25We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. LouisYou can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubesFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)Fisher22-122-911You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.Fisher12-544-3

References

  1. World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139CRISPRglmS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved