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Resumo

Nós descrevemos um método para gerar MLG-baseado condicionais "knockdown" mutantes do Plasmodium falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma.

Resumo

A malária é uma importante causa de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Esta doença, que afeta principalmente aqueles que vivem em regiões tropicais e subtropicais, é causada pela infecção por parasitas Plasmodium . O desenvolvimento de drogas mais eficazes para combater malária pode ser acelerado por melhorar a nossa compreensão da biologia do parasita deste complexa. Manipulação genética destes parasitas é a chave para entender a biologia deles; no entanto, historicamente o genoma de p. falciparum tem sido difícil de manipular. Recentemente, a edição de genoma CRISPR/Cas9 tem sido utilizada em parasitas da malária, permitindo a proteína mais fácil tagging, geração de knockdowns proteína condicional e a supressão de genes. Edição de CRISPR/Cas9 genoma provou para ser uma ferramenta poderosa para fazer avançar o campo da investigação de malária. Aqui, descrevemos um método CRISPR/Cas9 para gerar MLG-baseado condicionais mutantes knockdown no p. falciparum. Este método é altamente adaptável a outros tipos de manipulações genéticas, incluindo a proteína de marcação e nocautes de gene.

Introdução

A malária é uma doença devastadora causada por protozoários parasitas do gênero Plasmodium. Por p. falciparum, parasita da malária humana mortal mais, faz com que aproximadamente 445.000 mortes por ano, principalmente em crianças menores de cinco1. Plasmodium parasitas têm um ciclo de vida intrincado envolvendo um vetor mosquito e um hospedeiro vertebrado. Os seres humanos primeiro tornar-se infectado quando um mosquito infectado leva uma refeição de sangue. Então, o parasita invade o fígado, onde cresce, se desenvolve e divide-se por aproximadamente uma semana. Após este processo, os parasitas são liberados na corrente sanguínea, onde passam a replicação assexuada em glóbulos vermelhos (hemácias). Crescimento dos parasitas dentro as hemácias são diretamente responsáveis pelos sintomas clínicos associados com malária2.

Até recentemente, a produção de transgênicos por p. falciparum era um processo trabalhoso, envolvendo várias rodadas de seleção de drogas que levou muitos meses e tinha uma taxa de falhas elevada. Este procedimento demorado relieson a geração de DNA aleatória quebra na região de interesse e a capacidade endógena do parasita para emendar o seu genoma no entanto reparo homólogo3,4,5,6 . Recentemente, agrupado regularmente intercaladas Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoma edição tem sido com sucesso utilizada no p. falciparum7,8. A introdução desta nova tecnologia na investigação da malária tem sido fundamental para fazer avançar a compreensão da biologia desses parasitas Plasmodium mortal. CRISPR/Cas9 permite a segmentação específica de genes através de guia de RNAs (gRNAs) que são homólogas ao gene de interesse. O complexo de gRNA/Cas9 reconhece o gene através a gRNA e Cas9 então introduz uma ruptura da dobro-costa, forçando a iniciação dos mecanismos de reparação no organismo9,10. Porque por p. falciparum não possui a maquinaria para reparar quebras de DNA através de fim não-homóloga juntando, ele utiliza mecanismos de recombinação homóloga e integra modelos de DNA homólogos transfectados para reparar o Cas9/gRNA-induzido ruptura da dobro-Costa11,12.

Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de mutantes "knockdown" condicionais em p. falciparum usando CRISPR/Cas9 edição do genoma. O protocolo demonstra o uso da ribozima MLG para níveis da proteína condicionalmente knockdown de PfHsp70x (PF3D7_0831700), um acompanhante exportados pelo p. falciparum em host de hemácias13,14. A ribozima MLG é ativada pelo tratamento com glucosamina (que é convertido em glucosamina-6-fosfato nas células) para decompor seu mRNA associado, levando a uma redução na proteína14. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar outras ferramentas knockdown condicionais, como domínios de desestabilização ou RNA aptamers4,5,15. Nossos detalhes de protocolo a geração de um plasmídeo de reparo que consiste de uma ribozima hemaglutinina (HA) de marca e MLG sequência flanqueada por sequências de código que são homólogas ao frame de leitura aberto PfHsp70x (ORF) e 3'-UTR. Também descrevemos a geração de um plasmídeo segundo a expressão de unidade da gRNA. Estes dois plasmídeos, juntamente com um terceiro que impulsiona a expressão de Cas9, são transfectados em hemácias e usados para modificar o genoma de parasitas por p. falciparum . Finalmente, descrevemos uma reação em cadeia do polymerase (PCR)-com base técnica para verificar a integração da ribozima tag e MLG . Este protocolo é altamente adaptável para a modificação ou nocaute completo de quaisquer genes de p. falciparum , aumentando nossa capacidade de gerar novos insights sobre a biologia do parasita da malária.

Protocolo

Cultura contínua de p. falciparum requer o uso de hemácias humanas, e utilizamos o comercialmente adquiridas unidades de sangue que foi despojado de todos os identificadores e anónimos. O Conselho de revisão institucional e o escritório de Biossegurança da Universidade da Geórgia revistos nossos protocolos e aprovaram todos os protocolos utilizados em nosso laboratório.

1. escolher uma sequência de gRNA

  1. Vá para CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) e selecione ' Fasta destino '. Em 'Destino', Cole os 200 pares de base da extremidade 3' do quadro de leitura aberta (ORF) de um gene e 200 pares de base desde o início do 3'-UTR do gene. Em 'In', selecione 'P. falciparum' (3 a 7 v 3.0) e selecione ' CRISPR/Cas9 ' sob 'Using'. Em seguida, clique em ' encontrar Sites de destino '.
  2. Selecione uma sequência de gRNA as opções apresentadas, dando preferência para a gRNA mais eficiente, que está mais próximo do local da modificação e que tem os menor número locais fora do alvo.
    Nota: Sequências de gRNA potenciais são identificadas porque eles são imediatamente rio acima de um Protospacer adjacentes Motif (PAM), que é necessário para o recrutamento de Cas9 ao DNA. A sequência que é clonada em pMK-U6, o vetor que impulsiona a gRNA expressão, é as 20 bases imediatamente a montante do PAM. O PAM específico para S. pyogenes Cas9 é a sequência de nucleotídeos NGG e não deve ser incluído na sequência que é clonada em pMK-U6.
    Nota: CHOPCHOP visualmente classifica as sequências de gRNA, exibindo as melhores opções em verde, as opções menos ideais em âmbar e as piores opções em vermelho. CHOPCHOP dá cada sequência de gRNA um escore de eficiência que é calculado usando os parâmetros mais atualizados encontrados na literatura, e predizem sites fora do alvo que podem ser reconhecidos pela gRNA. Duas ou três sequências de gRNA podem precisar ser tentou encontrar a gRNA melhor adequado para um determinado gene.
  3. Compra a sequência de gRNA e seu reverso-complemento como oligos purificado por eletroforese em Gel de poliacrilamida. A sequência de gRNA usada para alvo PfHSP70x pode ser encontrada na figura 1B.
    Nota: Este oligo deve incluir 15 pares de bases homólogas para o plasmídeo expressando a gRNA, que são necessários para a sequência e independente de ligadura da clonagem (SLIC) para o vetor de pMK-U616.

2. clonagem a gRNA sequência em pMK-U6

  1. Digeri o pMK-U6 com BtgZI.
    1. Digest 10 μg de pMK-U6 com 5 μL de enzima BtgZI (5.000 unidades/mL) por 3 h a 60 ° C. Siga o protocolo do fabricante enzima para condições de reação.
    2. Após o período de incubação de 3 h, adicione um adicional 3 μL de BtgZI para a reação para garantir a digestão completa do plasmídeo. Digerir por um adicional 3 h, ainda seguindo as instruções do fabricante para garantir as condições de reação correta.
    3. Para purificar o pMK-U6 digerido da reação, use um kit de limpeza PCR baseados em colunas de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Separar o DNA digerido usando um gel de agarose 0.7% e extrair a banda base de 4.200 par.
  2. Recoze a oligos contendo a sequência de gRNA.
    1. Reconstitua os oligos purificado de página para uma concentração de 100 μM usando água livre de nuclease.
    2. Combine 10 μL de cada oligo com 2.2 μL de tampão de x 10 2 (ver Tabela de materiais). Certifique-se de que o volume total da reação é 22,2 μL.
    3. Executar o programa em um thermocycler do recozimento gRNA: passo 1: 95 ° C, 10 min; Passo 2: 95 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 3: Vá para a etapa 2, 16 vezes; Passo 4: 85 ° C, 1 min; Passo 5: 85 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 6: Vá para o passo 5, 16 vezes; Passo 7: 75 ° C, 1 min; Passo 8: 75 ° C, 1 s, com uma redução na temperatura de 0,6 ° C/ciclo; Passo 9: Vá para o passo 8, 16 vezes. Etapas de 10 a 21: repita o procedimento usado nas etapas 4 a 9 até que a temperatura atinja 25 ° C; Passo 22:25 ° C, a 1 min.
  3. Insira os oligos recozido gRNA o plasmídeo pMK-U6 BtgZI-digerido e gel-purificado.
    1. Combinam 100 ng de pMK-U6 digerido com 1 μL de 10x buffer 2.1 e 3 μL de oligos gRNA recozido. Aumente o volume para 9,5 μL com água livre de nuclease.
    2. Adicionar 0,5 μL de T4 polimerase e incubar a reação na temperatura de quarto para 2,5 min.
    3. Mova a reação ao gelo e incubar durante 10 min.
    4. Imediatamente transforme 5 μL da reação em competentes de Escherichia coli de acordo com as instruções do fornecedor de bactérias. Placa de bactérias em placas de ágar caldo lisogenia (LB), contendo 100 μg/mL ampicilina.
    5. Permitir que as bactérias transformadas para crescer a 37 ° C durante a noite, em seguida, selecionar colônias e extrair DNA com um kit de miniprep plasmídeo comercialmente disponível.

3. criação de regiões de homologia do modelo de reparação

  1. Projeto escudo mutações dentro do modelo de reparação de homologia para evitar re-corte do DNA que é integrado no genoma.
    Nota: Uma mutação de escudo normalmente consiste em introduzir uma mutação silenciosa para alterar o PAM para que Cas9 não induzirá uma ruptura no modelo de reparação. O PAM necessários para o Cas9 usado neste protocolo é a sequência de nucleotídeos "NGG", onde "N" é qualquer nucleotídeo. Se possível, mudar um dos nucleotídeos G para um A, C ou T.
    1. Se o PAM não pode ser mutated silenciosamente, apresente pelo menos 2 mutações silenciosas para os 6 pares de base diretamente adjacentes ao PAM7,8.
      Nota: Estas mutações poderá impedir o reconhecimento do modelo de reparação pela gRNA e evitar a re-corte do locus reparado pelo Cas9/gRNA complexo. As mutações do escudo podem ser introduzidas na região de homologia amplificando o DNA com primers que contêm a mutação.
  2. Amplifica a região de homologia ORF para o modelo de reparação.
    1. Usando o PCR, amplifica 800 pares de base da extremidade 3' da ORF do gene do alvo. Desenha os primers que serão usados para excluir o codão stop esta amplicon.
    2. Desenha os primers para a inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com SacII e AfeI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
  3. Amplifica a região 3'-UTR de homologia para o modelo de reparação.
    1. Usando o PCR, amplifica as 800 pares de bases, imediatamente após o stop códon do gene do alvo. Desenho de primers para inserção deste amplicon na pHA -MLG tem sido digerido com HindIII e NheI através de uma reação de ligadura do ADN ou SLIC16.
      Nota: O alto no conteúdo do genoma de p. falciparum pode dificultar a amplificação de regiões como UTRs. Uma abordagem alternativa ao uso de PCR está sintetizando as regiões de homologia.

4. clonagem de regiões de homologia no plasmídeo de reparação

  1. Inserir a pHA -MLG, região de homologia ORF.
    1. Digeri a pHA -MLG com SacII e AfeI, de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Insira o produto PCR de região de homologia ORF o plasmídeo digerido usando SLIC16.
    2. Transforme em competentes de Escherichia coli como realizado em etapas 2.3.4 e 2.3.5.
  2. Inserir a região 3'-UTR de homologia em um plasmídeo de pHA-MLG que já contém a região de homologia ORF (consulte a etapa 4.1).
    1. Digeri o plasmídeo com HindIII e NheI de acordo com as instruções do fabricante da enzima. Inserir o plasmídeo digerido usando SLIC16o 3'-UTR homologia região amplicon.
    2. Transformar em competentes de Escherichia coli e extrair o plasmídeo (etapas 2.3.4 e 2.3.5).

5. precipitação de DNA para transfeccao

  1. Adicione 40 μg de pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA -MLG DNA (para um total de 120 μg de DNA) em um tubo de microcentrifuga estéril 1,5 mL.
  2. Adicionar 1/10th do volume de DNA de 3 M de acetato de sódio em água (pH 5.2) para o tubo e misture bem, usando um vórtice (por exemplo, se o volume na etapa 5.1 foi 100 μL, adicionar 10 μL de acetato de sódio).
  3. Adicionar 2,5 vezes o volume de 100% de etanol ao tubo e misture bem, usando um vórtice pelo menos 30 s (por exemplo, se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 250 μL de 100% de etanol).
  4. Coloca o tubo no gelo ou a-20 ° C por 30 min.
  5. Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
  6. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota.
  7. Adicionar 3 vezes o volume de etanol a 70% para o tubo e misture rapidamente, usando um vórtice (ex., se o volume em 5.1 foi 100 μL, adicionar 300 μL de etanol a 70%).
  8. Centrifugar o tubo a 18.300 x g durante 30 min a 4 ° C.
    Nota: Esta etapa deve ser realizada em condições estéreis em uma câmara de segurança biológica.
  9. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo. Não perturbe a pelota. Deixar o tubo aberto e permitir a pelota secar ao ar durante 15 minutos.
  10. Armazene o DNA precipitado a-20 ° C até que ela é necessária para transfeccao.

6. isolamento humanos glóbulos vermelhos do sangue inteiro em preparação para transfeccao

  1. Alíquota sangue fresco em tubos cônicos de estéril 50 mL (aproximadamente 25 mL por tubo).
  2. Centrifuga os tubos a 1.088 x g durante 12 min, com freios de centrífuga definidos como 4.
  3. Aspire pelo casaco o sobrenadante e buffy. Ressuspender o RBC com um volume igual de RPMI incompleta.
    Nota: RPMI incompleta é preparado completando RPMI 1640 com 10.32 timidina μM, 110.2 hipoxantina μM, piruvato de sódio 1 mM, 30 mM de bicarbonato de sódio, 5 mM HEPES, glicose 11,1 mM e gentamicina 0,02% (v/v).
  4. Repita as etapas de 6.2 – 6.3 duas vezes. Após a última lavagem, Ressuspender as hemácias em um volume igual de RPMI incompleta e armazenar os tubos a 4 ° C.

7. transfecting hemácias com o plasmídeo CRISPR/Cas9 (para ser feito em condições assépticas)

Nota: P. falciparum culturas são mantidas conforme descrito em outros relatórios de17. Manter todas as culturas a 37 ° C em 3% O2, 3% de CO2e 94% N2 , salvo indicação em contrário. Sempre que o sangue é usado no presente protocolo, ele está se referindo as células vermelhas do sangue puras preparadas no passo 6. O sangue utilizado não deve ser mais de 6 semanas, como normalmente há uma diminuição da proliferação do parasita no sangue mais velho. As etapas a seguir descrevem hemácias pre-carregamento com DNA e adicionando uma cultura parasita as células transfectadas. Outros protocolos de transfeccao estabelecidos são compatíveis com transfecting estas construções18,19.

  1. Prepare um 1 buffer de x cytomix na água (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2mm EGTA, 5 mM MgCl2, 10mm K2HPO4, 25mm HEPES, pH 7,6). Filtro-esterilize o buffer usando um filtro de 0,22 μm.
  2. Adicione 380 μL do cytomix 1x para o DNA precipitado na etapa 5 e o vórtice para dissolver. Permitir que o DNA se dissolva no cytomix 1 x por 10 minutos, num Vortex cada 3 min para 10 s.
  3. Em um tubo cônico estéril 15ml, combinar 300 μL de glóbulos vermelhos (hematócrito de 50%, da etapa 6) no RPMI incompleto com 4 mL de 1x cytomix.
  4. Centrifugar as hemácias de passo 7.3 a 870 x g durante 3 min e em seguida retire o sobrenadante a pelota de RBC.
  5. Resuspenda o pellet de RBC com a mistura de DNA/cytomix da etapa 6.2 e transferência para uma cubeta de eletroporação de 0,2 cm.
  6. Electroporate as hemácias usando as seguintes condições: 0.32 kV, 925 μF, capacitância, definida como "Alta Cap" e a resistência definida como "Infinito".
  7. Seguindo electroporation, transferi o conteúdo da cubeta para um 15ml cónico contendo 5 mL de RPMI completa (cRPMI). Centrifugar o tubo a 870 x g durante 3 minutos a 20 ° C e em seguida decante o sobrenadante.
    Nota: cRPMI é preparado por meio do mesmo método como RPMI incompleta com a adição de 0,25% (p/v) rica em lipídios albumina de soro bovino.
  8. Resuspenda o pellet em 4 mL de cRPMI e a transferência de um bem em uma placa de cultura de tecidos de 6-poços. Adicionar 400 μL de uma cultura de alta-schizont (7 – 10% schizont parasitemia é ideal) para as hemácias transfectadas.
    Nota: Parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas por parasita.
  9. No dia seguinte, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Centrifugar a cultura a 870 x g por 3 min e aspirar o sobrenadante. Resuspenda a cultura em 4 mL de cRPMI.
  10. 48 h após completar o passo 7,6, lave a cultura com 4 mL de cRPMI. Resuspenda então a cultura em cRPMI contendo 1 μM DSM1 para selecionar para o plasmídeo Cas9.
  11. Continue lavando as culturas cada dia com cRPMI até parasitas não são mais visíveis por esfregaço de sangue. Após este ponto, substitua o meio de cultura fresco cRPMI mais 1 μM DSM1 cada 48 h.
    1. Para fazer um sangue manchar, pipetar 150 μL da cultura para um tubo de centrífuga de 0,6 mL. As células de pelotas por centrifugação a 1.700 x g durante 30 s.
    2. Aspire o sobrenadante. Utilize uma pipeta para transferir as células peletizadas para uma lâmina de vidro. Usar uma lâmina de vidro a segunda realizada em um ângulo de 45° para o primeiro slide, manchar a gota de sangue. Mancha o slide usando um kit de coloração comercialmente disponível de acordo com o protocolo do fabricante.
    3. Ver os parasitas usando um 100 X objetivo de imersão de óleo.
  12. Começando a 5 dias pós-transfecção (etapa 7,6), remover 2 mL da cultura com hemácias resuspended em meio de cultura. Adicionar fundos a 2 mL de meio fresco (cRPMI e mais 1 μM DSM1) e sangue em 2% do hematócrito. Adicione sangue fresco desta forma uma vez por semana até parasitas reaparecem, conforme determinado pelo esfregaço de sangue fino (etapa 7.11).
    Nota: Se a integração for bem-sucedida, parasitas geralmente reaparecem na cultura por transfecção pós um mês.
  13. Uma vez que os parasitas ressurgir, remova DSM1 pressão de drogas. Como alternativa, remova a pressão de drogas depois de parasitas foram clonadas para fora.

8. verificação de parasitas para a integração do modelo de reparação

  1. Quando os parasitas são visíveis novamente por esfregaço de sangue fino, isole o DNA da cultura através do kit apropriado.
  2. Use PCR para amplificar a região modificada do genoma para determinar se o locus de destino foi alterado com êxito e se o locus do selvagem-tipo não modificado (indicativo de parasitas do tipo selvagem) é detectável.
    1. Para detectar parasitas que integraram o modelo de reparação, use um primer para a frente que fica no início da ORF, fora da região de homologia clonado. Use um primer reverso que senta-se no 3'-UTR.
      Nota: Como esta amplificação inclui as sequências das etiquetas HA e MLG ribozima, amplicons de parasitas integradas será maior do que a mesma região amplificada no selvagem-tipo parasitas.

9. clonagem parasitas limitando a diluição

  1. Realize diluições em série da cultura parasita da etapa 7.13 a obter uma concentração final de 0,5 μL de parasitas/200. Adicione 200 μL da cultura diluída para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços.
    Nota: Porque a parasitemia é definida como a porcentagem de hemácias infectadas e o hematócrito é também um número definido (2%), o número de parasitas por unidade de volume é inferido facilmente.
    1. Prepare-se 1 mL da cultura em cRPMI em 5% parasitemia e 2% de hematócrito (a estes níveis de parasitemia e hematócrito, a cultura contém 1 x 107 parasitas/mL).
    2. Dilua esta cultura 1: 100 com cRPMI. Dilua novamente 1: 100 com cRPMI.
    3. Dilua 1: 400. Execute esta diluição adicionando 62,5 μL da cultura de 25 mL de cRPMI e 1 mL de sangue. Esta diluição resulta na concentração desejada de 0,5 μL de parasitas/200.
  2. Manter a placa de clonagem até parasitas são detectáveis em poços.
    1. Todos os 48 h, substitua o meio da placa de 96 poços de meio fresco.
    2. Uma vez por semana, a partir de 5 dias após o início da placa de clonagem (passo 9.1), remover 100 μL de cada poço e adicionar de volta 100 μL de meio fresco + sangue (2% do hematócrito).
  3. Identifica qualquer poços contendo parasitas.
    1. Coloque a placa de 96 poços em um ângulo de 45°, por aproximadamente 20 min, permitindo que o sangue ao acordo em um ângulo dentro da placa.
    2. Coloque a placa de 96 poços em uma caixa de luz. Observe que os poços contendo parasitas contenham a mídia que é amarela na cor, em comparação com os meios de comunicação-de-rosa de poços livre de parasita, devido à acidificação do meio por parasitas.
    3. Usando uma pipeta sorológica, mover o conteúdo dos poços contendo parasita para uma placa de cultura de tecidos de 24-bem para permitir a expansão da parasitemia.
    4. Usando a análise PCR conforme descrito na etapa 8, verifique estas linhas parasita clonal para integração correta.

10. knockdown da proteína por tratar parasitas com glucosamina e confirmação via análise ocidental do borrão

  1. Prepare uma 0,5 M GlcN (glucosamina) solução stock, que pode ser armazenada a-20 ° C.
  2. Adicionar GlcN para as culturas de parasita MLG e permitir-lhes a crescer na presença de GlcN.
    Nota: A concentração final e o tempo de tratamento GlcN depende da linha de experimento e parasita. GlcN podem afetar o crescimento do parasita, então a tensão parasita parental deve ser exposta a uma gama de GlcN concentrações para determinar sua sensibilidade ao composto. Muitas vezes, uma concentração de 2,0-7.5 mM GlcN é usado13,14,20.
  3. Isole amostras da proteína do GlcN-Tratado parasitas13.
  4. Utilize amostras de proteínas para análise ocidental do borrão para detectar reduções na proteína13.
    1. Use um anticorpo anti-HA, de acordo com as instruções do fabricante para detectar a proteína HA-MLG-marcados. Compare a banda HA para um controle de carregamento, como PfEF1α.

Resultados

Um esquema do plasmídeo utilizado este método, bem como um exemplo de uma mutação do escudo são mostrados na Figura 1. Como um exemplo de como identificar parasitas mutantes depois de transfeccao, resultados de PCRs para verificar a integração da construção deMLG HA - são mostrados na Figura 2. Uma imagem representativa de uma placa de clonagem é mostrada na Figura 3 , para demons...

Discussão

A implementação de CRISPR/Cas9 em p. falciparum tanto aumentou a eficiência de e diminuiu a quantidade de tempo necessária para modificar o genoma do parasita, em comparação com os métodos anteriores de manipulação genética. Este protocolo abrangente descreve as etapas necessárias para a geração de mutantes condicionais usando CRISPR/Cas9 em p. falciparum. Enquanto o método aqui é voltado especificamente para a geração de HA -MLG mutantes, esta estratégia pode ser adaptada par...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Muthugapatti Kandasamy no núcleo microscopia biomédicas Universidade da Geórgia (UGA) para assistência técnica e Jose-Juan Lopez-Rubio por compartilhar o plasmídeo pUF1-Cas9 e pL6. Este trabalho foi financiado pelo prêmio Fundação arcos D.W.C. e H.M.K., concede fundos de inicialização UGA de V.M., bolsas da Fundação de março das moedas de dez centavos (Basil o ' Connor Starter estudioso Research Award) para V.M. e nos institutos nacionais de saúde (R00AI099156 e R01AI130139) para o V.M. e (T32AI060546) para H.M.K.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
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Referências

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