תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

Summary

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

Abstract

דג זברה הוא שאורגניזם גלובלית מוכרת מים טריים משמשים לעתים קרובות ב ביולוגיה התפתחותית, טוקסיקולוגיה סביבתית, מחלות אנושיות תחומי מחקר קרובים. בזכות תכונות ייחודיות שלה, כולל פוריות גדול העובר המוגבהת, פיתוח מהיר בו זמנית, וכדומה, דג זברה עוברי משמשים לעתים קרובות להערכת רעילות בקנה מידה גדול של כימיקלים, סמים/מתחם ההקרנה. תהליך ההקרנה טיפוסי כרוך דג זברה בוגרת ההשרצה, העוברים ובחירת, סידור במערך העוברים לוחות רב טוב. משם, העוברים הם נתון חשיפה הרעילות של כימיקלים, או היעילות של התרופות/תרכובות ניתן להעריך במהירות יחסית מבוסס על תצפיות פנוטיפי. בין תהליכים אלה, העוברים סידור במערך הוא אחד הצעדים מהגידולים ועתירת ביותר אשר מגביל את רמת התפוקה. פרוטוקול זה, אנו מציגים גישה חדשנית אשר גורם השימוש של תבנית arraying מודפס 3D בשילוב עם ואקום מניפולציה כדי להאיץ את שלב מפרך. פרוטוקול במסמך זה מתאר את התכנון הכולל של התבנית arraying, הגדרת הניסוי מפורט, הליך שלב אחר שלב, ולאחריו נציג תוצאות. כאשר מיושמת, גישה זו צריך להועיל במגוון רחב של יישומי מחקר שימוש דג זברה העוברים בדיקות נושאים.

Introduction

כאורגניזם מודל פופולרי, דג זברה נעשה שימוש נרחב בתחומים של רפואה ו הרעלים^1,2,3,-⁴. לעומת במבחנה פלטפורמות, דג זברה מציעים המורכבות הביולוגית גדול הרבה שאחד או שני סוגי תאים לא יכול להציע. מלבד היותו יצור כל דגם, פוריות גדול של דג זברה, התפתחות מהירה, בו זמנית, איברים גבוהה המוגבהת העניקו זה מודל ייחודי יתרונות לשמש רעילות בקנה מידה גדול או סמים/מתחם הקרנת⁵. מאות עוברי המיוצר על ידי זוג אחד של דג זברה למבוגרים בכל שבוע לעלות על דוגמניות כל בעלי חיים אחרים, הפכו אותה מתאימה להקרנה תפוקה גבוהה.

תהליך ההקרנה טיפוסי באמצעות דג זברה כרוך כמות משמעותית של עבודה ידנית, כגון דג זברה בוגרת ההשרצה, העובר בחירה, ואת סידור במערך עוברי לתוך מיכלים מתאים שבו הם נתונים לחשיפה באמצעות טבילה במי. התפתחות העוברים מנוטר, הנצפה נקודות קצה כגון תמותה, hatchability, חריגות לעיתים קרובות להעריך באופן ידני, משמש את ההזדהויות ראשוני של הרעילות של כימיקלים או סימנים של יעילות סמים או תרכובות. כדי לזרז את ההליך ההקרנה, גישות כגון הדמיה אוטומטית וניתוח תמונת המחשב בסיוע נחקרו בעבר. לדוגמה, מיקרוסקופים עם תכולה גבוהה ויכולות הדמיה הותאמו לביצוע אוטומטי בהיר-שדה או קרינה פלואורסצנטית הדמיה על דג זברה עוברי בשלבים התפתחותיים שונים 96/384 צלחות טוב⁶. התקנים Microfluidic בשילוב עם מיקרוסקופים שימשו כדי למקם דג זברה הזחלים באמצעות מניפולציה הנוכחי עבור הדמיה של נוירונים במוח⁷. גישות אלה יכול לשפר באופן משמעותי את היעילות של רכישות התמונה לעומת ידני מסורתיים. יתר על כן, עם מספר גדול של תמונות הנוצר, כלי ניתוח תמונה גם פותחו כדי להאיץ את העיבוד של הנתונים, כפי שמגלה ליו. et al. , טו. et al. ^{8 , 9}.

רמת התפוקה הדמיה וניתוח התמונה גודלת, התברר כי הצעד הגבלת קצב להקרנה טמון בתהליך הכנת דג זברה עוברי חשיפה, אשר בדרך כלל אומר סידור במערך אותם לתוך צלחות 96 - או 384-ובכן. כדי לפתור את שלב זה צוואר בקבוק, רובוטיקה מונחה חזון פותחו על-ידי מנדרל. et al. ¹⁰ . ואנחנו¹¹ בעבר כדי להחליף טיפול ידני אבל הכלים היו מתוחכמים למדי, יש עקומת למידה עמוקה ליישם טכניקות אלה. לכן, כדי לספק גישה נוחה לשימוש הופך להיות גורם חשוב אחד לשפר עוד יותר את רמת התפוקה של דג זברה ההקרנה היא המטרה העיקרית של עבודה זו.

בעבודה זו, אנו תוכנן, מפוברק העובר סידור במערך תבנית על-ידי הדפסת תלת-ממד. תבנית כזו arraying נועד אומללותו דג זברה העובר לתוך בארות שמתאימים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. במקום בחירה העוברים ולאחר סידור במערך אותם לבאר בודדת אחת, אחד יכול לבצע העובר מלכוד ית כל העוברים 96 לתוך צלחת multiwall בבת אחת. באמצעות תבנית זו, הפרוטוקול הבא, אחד יכול להגדיל באופן משמעותי את היעילות של סידור במערך עוברי לוחות multiwall, אשר בהמונח להגביר יכולת הקרנת לפחות פי עשרה, בהשוואה באופן ידני. הפרוטוקול המתואר להלן כוללת של עיצוב כללי עבור סידור במערך תבנית, דג זברה ההשרצה, אוסף העובר וכן סידור במערך. איור 1 מציג את התכנון הכולל של התבנית arraying. איור 2 מציג מבט כולל על פרוטוקול שלב אחר שלב באמצעות התבנית שמתואר חלקים 3 ו- 4.

Protocol

1. עיצוב, ייצור של העוברים דג זברה סידור במערך תבנית

1. לעצב את תבנית arraying עם 12 על ידי 8, פריסת 96-ובכן שמתאים צלחת 96-ובכן סטנדרטי. שימוש המימדים המופיעים איור 1A עבור תא מלכוד העובר העליון (ראה גם את קובץ משלים).
   1. השתמש מידות איור 1B ו- 1 D על מלכוד היטב.
   2. להשתמש את המידות ב- 1C דמות בתחתית המצודה ואקום.
   3. להשתמש את הממדים איור 1B באוויר ב / עודפים.
2. להשתמש במדפסת תלת-ממד (עם דיוק של 0.1 מ"מ) כדי להדפיס את התבנית; ראה טבלה של חומרי שרף מומלץ שישמש לשם הדפסה.
   הערה: מדפסות תלת-ממד עם דיוק 0.1 מ מ מומלץ עבור ייצור התבנית arraying (ראה טבלה של חומרים). הצבע המוצע על פני השטח של התבנית הוא אפור כהה או שחור.

2. דג זברה העובר ההשרצה

1. מקום שני זוגות של זכר ונקבה דגים למטר ההזדווגות תיבת יום אחד לפני ההשרצה. נפרד זכרים ונקבות על ידי מחיצה פלסטיק שקוף.
2. תוריד את המחיצות בבוקר לערבב דג זכר ונקבה.
3. הסר את הדגים זכר ונקבה ולאסוף עוברי דג זברה באמצעות מסננת פיין-רשת. לשטוף העוברים עם ביצה 250 מ ל מים (ראה טבלה של חומרים).
4. להעביר את העוברים שנאספו פטרי (90 מ מ קוטר) עם הפתרון של Holtfreter (ראה טבלה של חומרים) ולהסיר את העוברים מופרית ומתה תוך שימוש stereomicroscope של.
5. מקם את העוברים חממה 28.5 ° C. ב- 4 h פוסט הפריה (hpf), לבחון את העוברים ולהסיר כל העוברים מת, לא בריא. העוברים מוכנים עכשיו השלב הבא.

3. הכנת סידור במערך תבנית

1. לשטוף את תבנית 2-3 פעמים עם יונים 500 מ"ל מים והכניס אותו לתוך תנור ייבוש (45 ° C) במשך 5 דקות.
2. קלטת בתחתית המצודה עם חתיכה של איטום הסרט (איור 2שלב 1).
3. חבר של משאבת ואקום דרך שקע אוויר בתחתית התבנית.
   הערה: הואקום מקסימום המומלצת עבור משאבת ואקום הוא 0.1 Mpa. להיות מודע עוצמת הוואקום בשימוש. אם הלחץ השלילי חזק מדי, לחתוך חור בצורת צלב על הסרט איטום כדי להוריד את הלחץ.

4. סידור דג זברה עוברי במערך לתוך צלחת 96-ובכן

1. באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק, למקם כ 150 עוברי לתוך התבנית, כפי שמתואר באיור 2, שלב 2.
2. לחבר את משאבת ואקום שקע אוויר כדי ליצור לחץ שלילי בתא אטום על ידי הסרט איטום בשלב 3.3.
3. מנערים את התבנית כולה אופקית עד בכל טוב יש אחד העובר לכודים (איור 2, שלב 3).
   הערה: אם הפתרון של Holtfreter מתייבש לפני העוברים לכוד בתוך כל טוב, להוסיף הפתרון של Holtfreter נוספים בבית הבליעה מלכוד, חזור על שלב זה.
4. להיפטר פתרון של Holtfreter נוספת של עוברי כי הם לא לכודים בתוך הבארות (איור 2, בשלב 4).
5. לכבות ולנתק את משאבת ואקום.
6. מניחים צלחת 96-ובכן תקן הפוך נגד התבנית (איור 2, בשלב 5) ולסובב את שניהם באותו זמן (איור 2, לשלב 6).
7. הקש על תחתית התבנית או לחבר את האוויר לשקע אבקת גז דחוס יכול העברת העוברים כל לכוד מהתבנית לצלחת 96-ובכן (איור 2, לשלב 6).
8. חזור על שלב 4.1 עד 4.8 להכין צלחות רב טוב נוספים.
9. להסיר את הסרט איטום ולשטוף את התבנית 3 פעמים מלמעלה עד למטה עם יונים 500 מ"ל מים לשימוש עתידי.
   הערה: אין להשתמש כל ממסים אורגניים, כמו אתנול, לנקות את התבנית.

תוצאות

איור 3 מראה תבנית אופיינית arraying מודפס 3D. תבנית זו משתמשת שרף פוטוסנסיטיבית כחומר גלם, נעשתה על ידי מדפסת תלת-ממד; שכבה של צבע שחור הוחל לספק ניגוד יותר לצבע של העוברים. המיקום של 96 וולס (12 על ידי 8) תוכנן כדי להתאים עם צלחת 96-ובכן סטנדרטי. באופן דומה, תבנית טוב 3...

Discussion

ישנם שני שלבים קריטיים של פרוטוקול זה מחייבות תשומת לב לביצוע הטמעה מוצלחת של הדפסת תלת-ממד תבנית עבור סידור במערך דג זברה עוברי.

הגורם החשוב ביותר על העיצוב של התבנית arraying הוא מלכוד היטב. ודואג אין היחיד העובר לכוד בתוך כל טוב, אחד צריך לשלם קרוב לב הקוטר ואת העומק של הבאר מל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Mating box	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Sodium chloride	Vetec	V900058-500G
Potassium Chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Sodium bicarbonate	Vetec	v900182-500G
Methylene Blue Hydrate	TCI	M0501
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011008
Sea Salts	Instant Ocean	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
Microscope	OLYMPUS	SZ61
Biochemical incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D printer	UnionTech	Lite600
Photosensitive resin	UnionTech	UTR9000
Vacuum pump	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals	Solarbio	YA0245
96 well plate	Costar	3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
Compressed Gas Duster	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Water	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
System water			Water out of the facility’s water system
Egg water			Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution			Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water