Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.

Abstract

Zebrafish è che un organismo riconosciuto a livello mondiale di acqua dolce frequentemente utilizzato in biologia dello sviluppo, tossicologia ambientale e malattia umana campi di ricerca correlate. Grazie alle sue caratteristiche uniche, tra cui la grande fecondità, traslucidità dell'embrione, sviluppo rapido e simultaneo, ecc., embrioni di zebrafish sono spesso utilizzati per la valutazione della tossicità su larga scala di prodotti chimici e droghe/mescola lo screening. Una procedura di screening tipica prevede la deposizione delle uova di zebrafish adulto, selezione di embrioni e arraying gli embrioni in piastre multi-pozzetto. Da lì, gli embrioni sono sottoposti per l'esposizione e la tossicità del prodotto chimico, o l'efficacia dei farmaci/composti può essere valutato relativamente rapidamente basata su osservazioni fenotipiche. Tra questi processi, embrioni arraying sono uno dei passaggi più molto tempo e laboriosi che limita il livello di velocità effettiva. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio innovativo che fa uso di un modello di arraying 3D-stampato accoppiato con manipolazione per accelerare questa laboriosa fase di vuoto. Il protocollo di questo documento descrive il disegno complessivo del modello arraying, una dettagliata messa a punto sperimentale e della procedura, seguita da risultati rappresentativi. Quando implementato, questo approccio dovrebbe rivelarsi vantaggioso in una varietà di applicazioni di ricerca utilizzando embrioni di zebrafish come soggetti di prova.

Introduzione

Come organismo modello popolare, zebrafish è ampiamente usato nei campi della medicina e tossicologia^1,2,3,4. Rispetto alle piattaforme in vitro , zebrafish offrono molto maggiore complessità biologica che uno o due tipi di cellule non potevano offrire. Oltre ad essere un intero organismo modello, grande fecondità di zebrafish, rapido e simultaneo dello sviluppo embrionale e organo ad alta traslucenza hanno dato questo vantaggi unici di modello da utilizzarsi per tossicità su larga scala o farmaci/mescola⁵di screening. Le centinaia di embrioni prodotti da una coppia di zebrafish adulto ogni settimana superano tutti gli altri modelli animali intero e hanno reso adatto per screening su vasta scala.

Una procedura di screening tipica utilizzando zebrafish comporta una notevole quantità di lavoro manuale, ad esempio di zebrafish adulto deposizione delle uova, selezione degli embrioni e arraying embrioni in idonei contenitori dove sono sottoposti all'esposizione attraverso l'immersione in acqua. Lo sviluppo degli embrioni è monitorato e osservabile endpoint come anomalia, la schiusa e la mortalità sono spesso valutati manualmente e utilizzati come le identificazioni preliminari la tossicità di sostanze chimiche o indicazioni sull'efficacia del farmaci o composti. Per velocizzare la procedura di screening, approcci come l'imaging automatici e analisi di immagine computerizzata sono stati esplorati precedentemente. Ad esempio, microscopi ad alto contenuto funzionalità di imaging sono stati adattati per eseguire automatizzato del luminoso-campo o fluorescenza sugli embrioni di zebrafish alle varie fasi di sviluppo da 96/384 pozzetti⁶. Dispositivi microfluidici accoppiati con microscopi sono stati utilizzati per posizionare le larve di zebrafish tramite manipolazione corrente per l'imaging del cervello neuroni⁷. Questi approcci potrebbero migliorare sensibilmente l'efficienza delle acquisizioni di immagine rispetto al tradizionale funzionamento manuale. Inoltre, con gran numero di immagini viene generato, strumenti di analisi di immagine sono anche stati sviluppati per velocizzare l'elaborazione di dati, come dimostrato da Liu et al e Tu et al. ^{8 , 9}.

Come aumenta il livello di velocità effettiva di analisi di formazione immagine e l'immagine, è diventato chiaro che il passaggio limitante per lo screening si trova nel processo di preparazione di embrioni di zebrafish per l'esposizione, che in genere significa arraying li in piastre da 96 o 384 pozzetti. Per risolvere questo passaggio di collo di bottiglia, Fixed-based robotics sono stati sviluppati da Mandrell et al. ¹⁰ e noi¹¹ in precedenza per sostituire movimentazione manuale ma gli strumenti erano piuttosto sofisticato e c'è una curva di apprendimento profonda per implementare tali tecniche. Di conseguenza, per fornire un approccio easy-to-use diventa un fattore importante per migliorare ulteriormente il livello di velocità effettiva dello zebrafish screening ed è l'obiettivo principale di questo lavoro.

In questo lavoro, abbiamo progettato e fabbricato un embrione arraying modello di stampa 3D. Un modello di questo arraying è stato progettato per intrappolare embrione di pesce zebra in pozzetti che si adattano con una piastra a 96 pozzetti standard. Anziché selezionare embrioni e li arraying in singoli pozzetti uno per uno, uno potrebbe eseguire matrice e l'allettamento di embrione 96 tutti gli embrioni in una piastra a parete multipla in una sola volta. Utilizzando questo modello e il seguente protocollo, uno potrebbe aumentare significativamente l'efficienza di arraying embrioni in lastre multiparete, che a termine Spinta la capacità di screening almeno dieci volte, rispetto al funzionamento manuale. Il protocollo descritto di seguito include un disegno complessivo per la disposizione di modello, la deposizione delle uova di pesce zebra, raccolta degli embrioni e arraying. La figura 1 Mostra il disegno complessivo del modello arraying. La figura 2 Mostra una panoramica del protocollo dettagliata sull'utilizzo del modello descritto nelle parti 3 e 4.

Protocollo

1. progettazione e fabbricazione di un embrioni di Zebrafish Arraying modello

1. Progettazione del modello di arraying con un 12 di 8, 96 pozzetti layout che si adatta una piastra a 96 pozzetti standard. Uso le dimensioni riportate in Figura 1A per l'alloggiamento di allettamento superiore dell'embrione (Vedi anche il File supplementare).
   1. Utilizzare le dimensioni riportate in Figura 1B e 1D per l'allettamento bene.
   2. Utilizzare le dimensioni in Figura 1 per la camera a vuoto inferiore.
   3. Utilizzare le dimensioni in Figura 1B per l'aria in / presa.
2. Utilizzare una stampante 3D (con precisione di 0,1 mm) per stampare il modello; Vedi Tabella materiali per resina consigliata da utilizzare per la stampa.
   Nota: le stampanti 3D con una precisione di 0,1 mm sono raccomandate per la fabbricazione del modello arraying (Vedi Tabella materiali). Il colore suggerito per la superficie del modello è grigio scuro o nero.

2. Zebrafish embrione deposizione delle uova

1. Posizionare due paia di pesce maschio e femmina per accoppiamento scatola un giorno prima della deposizione delle uova. Separati maschi e femmine da un divisorio in plastica trasparente.
2. Togliere i divisori al mattino per mescolare pesce maschio e femmina.
3. Togliere il pesce maschio e femmina e raccogliere embrioni di zebrafish usando un colino a maglia fine. Lavare gli embrioni con uovo 250 mL di acqua (Vedi Tabella materiali).
4. Trasferire gli embrioni raccolti di Petri (diametro 90 mm) con soluzione di Holtfreter (Vedi Tabella materiali) e rimuovere embrioni morti e non fertilizzati usando uno stereomicroscopio.
5. Posizionare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C. A 4 h dopo fertilizzazione (hpf), osservare gli embrioni e rimuovere eventuali embrioni morti e malsane. Gli embrioni sono pronti per il passo successivo.

3. preparazione di Arraying modello

1. Lavare il modello 2 – 3 volte con 500 mL di acqua deionizzata e metterlo in forno di essiccazione (45 ° C) per 5 min.
2. La camera inferiore con un pezzo di pellicola (Figura 2passaggio 1) di tenuta del nastro.
3. Collegare una pompa a vuoto attraverso l'uscita dell'aria nella parte inferiore del modello.
   Nota: Il vuoto max consigliato per la pompa del vuoto è 0.1 Mpa. Essere consapevole della forza del vuoto utilizzato. Se la pressione negativa è troppo forte, tagliare un buco a forma di croce sulla pellicola sigillante per abbassare la pressione.

4. arraying embrioni di Zebrafish in una piastra a 96 pozzetti

1. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, inserire circa 150 embrioni nel modello, come dimostrato nella figura 2,, passo 2.
2. Collegare la pompa a vuoto per la presa di aria per generare pressione negativa nell'alloggiamento sigillato con la pellicola sigillante in fase 3.3.
3. Agitare l'intero modello orizzontalmente fino a quando ognuno ha anche un embrione intrappolato (Figura 2, passo 3).
   Nota: Se soluzione del Holtfreter si prosciuga prima che gli embrioni sono intrappolati in ciascun pozzetto, aggiungere soluzione di ulteriori Holtfreter nella camera di allettamento e ripetere questo passaggio.
4. Scartare di supplementare Holtfreter soluzione e gli embrioni che non vengono intrappolati nei pozzetti (Figura 2, passaggio 4).
5. Spegnere e scollegare la pompa del vuoto.
6. Capovolgere una piastra a 96 pozzetti standard contro il modello (Figura 2, Step 5) e ruotare entrambi allo stesso tempo (Figura 2, passaggio 6).
7. Toccare il fondo del modello o collegare l'aria presa a una spolverata di gas compresso possibile per trasferire gli embrioni tutti intrappolati dal modello per la piastra a 96 pozzetti (Figura 2, passaggio 6).
8. Ripetere il passaggio 4.1 a 4,8 per preparare ulteriori piastre multi-pozzetto.
9. Rimuovere la pellicola sigillante e lavare il modello 3 volte da cima a fondo con 500 mL di acqua deionizzata per un utilizzo futuro.
   Nota: Non utilizzare solventi organici, come l'etanolo, per pulire il modello.

Risultati

La figura 3 Mostra un tipico modello di arraying 3D-stampato. Questo modello utilizza resina fotosensibile come materia prima ed è stata fatta da una stampante 3D; per fornire un migliore contrasto con il colore di embrioni è stato applicato uno strato di vernice nera. La posizione di 96 pozzetti (12 da 8) è stata progettata per adattarsi con una piastra a 96 pozzetti standard. Allo stesso modo, un modello di ben (24 x 16) 384 potrebbe anche essere progett...

Discussione

Ci sono due punti critici in questo protocollo che richiedono particolare attenzione per la corretta implementazione del modello di stampa 3D per arraying embrioni di zebrafish.

Il fattore più importante sul design del modello arraying è l'allettamento. Rende sicuro che c'è un solo embrione intrappolato in ciascun pozzetto, uno dovrebbe prestare particolare attenzione per il diametro e la profondità del pozzo allettamento e il diametro del foro passante. Il diametro consigliato è all'inte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zebrafish Facility	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.	Z-A-S5
Mating box	Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Wash Bottle, 500 ml	Sangon Biotech	F505001-0001
Sodium chloride	Vetec	V900058-500G
Potassium Chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10016318
Calcium chloride	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	20011160
Sodium bicarbonate	Vetec	v900182-500G
Methylene Blue Hydrate	TCI	M0501
Hydrochloric acid	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011008
Sea Salts	Instant Ocean	SS15-10
Pipetter	Fisherbrand	13-675M
Controlled Drop Pasteur Pipet	Fisherbrand	13-678-30
Microscope	OLYMPUS	SZ61
Biochemical incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	LRH-250
3D printer	UnionTech	Lite600
Photosensitive resin	UnionTech	UTR9000
Vacuum pump	Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.	SHB-IIIA
Adhesive PCR Plate Seals	Solarbio	YA0245
96 well plate	Costar	3599
Multi 8-channel pipette 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
Compressed Gas Duster	Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.	ST1005
DI Water	Thermo	GenPure Pro UV/UF
Drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	BPG-9106A
System water			Water out of the facility’s water system
Egg water			Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water
Holtfreter’s solution			Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water