JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

Abstract

מיקרו-RNAs (miRNAs) הן תעתיקים RNA חד-גדילי לאגד RNAs שליח (mRNAs) ו לעכב את התרגום שלהם או לקדם את שפלותם. עד כה, miRNAs היו מעורבים מספר רב של תהליכים ביולוגיים ומחלות, אשר יש למסומן את הצורך בשיטות זיהוי אמין של תעתיקים miRNA. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לגילוי התווית על-ידי digoxigenin (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם) המבוסס על בדיקה miRNA, בשילוב עם חלבון immunostaining על העכבר לב חלקים. ראשית, אנו לבצע בחיי עיר הכלאה טכניקה באמצעות המכשיר לזיהוי miRNA-182 ביטוי בסעיפים הלב של שליטה ועכברים היפרטרופיה. הבא, נוכל לבצע immunostaining לב החלבונים טרופונין T (cTnT), על הסעיפים זהה, כדי להתאים לשפה משותפת miRNA-182 עם תאי cardiomyocyte. באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות miRNA-182 דרך phosphatase אלקליין המבוסס על ערכי צבע מוחלטים assay, cTnT דרך מכתים פלורסנט. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות את הביטוי של כל miRNA עניין באמצעות מגבר קדם התווית על-ידי החפירה הגששים, וביטוי חלבון הרלוונטיים במקטעי רקמת הלב העכבר.

Introduction

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה 1. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 702. בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים3,4. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי, המאפשר את הכריכה שלהם לאזור 3' לא מתורגם (3'-UTR) של mRNAs היעד שלהם כדי לדכא את הביטוי3,5 .

בתוך שלושה עשורים, מאז שהם זוהו קודם, miRNAs הופיעו על הרגולטורים מאסטר של ביטוי גנים, רמות הביטוי האישי שלו הם מגבילים6. תפקידים miRNAs תוארו אורגן פיתוח7,8,9,10,11,12, תחזוקה של הומאוסטזיס13,14 , כמו גם מחלות בהקשרים הכוללים נוירולוגיות15,16,17,18,19,20לב וכלי דם, מחלות אוטואימוניות21 ,22,23,סרטן24ועוד25. הערכה הגוברת על הרלוונטיות של דפוסי ביטוי miRNA הביא קדימה את הצורך בשיטות זיהוי אמין של הפרוטוקולים miRNA. שיטות כאלה כוללות PCR בזמן אמת, מיקרו-מערכים, סופג בצפון, הכלאה בחיי עיר ועוד, אשר להשתנות רגישות, ירידה לפרטים, ובכוחו כמותית, בעיקר בשל העובדה כי miRNA תעתיקים המורכב מעובדים קצר ו רצפים הומולוגיים מאוד6.

לאחרונה דווח כאן תפקיד חשוב עבור miRNA-182 בפיתוח של שריר הלב היפרטרופיה26, מצב המתארת הסתגלות מבנית של הלב בתגובה לדרישות מוגברות בגרימת27,28. היפרטרופיה מאופיין על-ידי הגדלת מסת שריר הלב, אשר, אם המשויך שיפוץ maladaptive29, יכול להוביל לסיכון מוגבר לאי ספיקת לב, תנאי החשבונאי 8.5% ממקרי המוות כל המיוחס לב וכלי דם מחלת30.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו המשלבת בחיי עיר הכלאה עם התווית על-ידי digoxigenin בדיקה (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם), immunostaining איתור בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר, ב שלנו דגם של היפרטרופיה.

Protocol

העכבר דגימות רקמות הלב במחקר זה התקבלו בדרישות הרלוונטיות חוקים והנחיות מוסדיים ואושרו על-ידי ייל אוניברסיטת אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. פתרון הכנה

  1. הכנת RNase ddH חינם2O, על ידי טיפול 5 L של ddH2O עם 5 מ של 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) בין לילה (O/N), בטמפרטורת החדר (RT). אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס) כדי לבטל את DEPC. שימוש ddH שטופלו DEPC2O עבור ההכנה של פתרונות במורד הזרם כמו מצוינת.
    התראה: DEPC הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume.
  2. להכין 1 x פוספט Buffered מלוחים (PBS) פתרון על ידי המסת טבליות PBS 5 ב- 1 ליטר של ddH שטופלו DEPC2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  3. הכן 0.1% דטרגנט ללא יונית/PBS (PBST) על ידי דילול 1 מ"ל של דטרגנט ללא יונית לכל 1 ליטר ל- 1 x PBS.
  4. להכין אתנול 90%, 70%, 50% ו- 30% שטופלו DEPC ddH2O.
  5. הכינו 10 מ"ג/מ"ל פתרון מניות של K Proteinase (ProK) ב- ddH שטופלו DEPC2O. Aliquot ולאחסן ב-20 ° C. להכין 20 μg/mL הפתרון עובד של ProK על ידי המדללת 100 μL של פתרון מניות ProK 50 מ של ddH שטופלו DEPC2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  6. להכין 4% paraformaldehyde (PFA) על-ידי הוספת 2 גר' PFA 50 מ של 1 x PBS. חום-65 ° C עם טלטולים מפעם לפעם, עד התפרקה. Aliquot וחנות ב-20 ° C.
    התראה: PFA הוא חומר מסרטן ידוע, לטפל רק בשכונה fume.
  7. להכין פתרון NaCl 3 מ' על-ידי הוספת 87.8 g עד 500 מ"ל של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  8. להכין פתרון2 MgCl 1 מ' על-ידי הוספת 20.3 g 100 מ של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  9. הכנת 1 מ' טריס pH 8.0 על ידי המסת 121.1 g ב 800 מיליליטר ddH2O. התאם ה-pH ל 8.0 עם כמה טיפות של 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 1 L והחיטוי (121 מעלות צלזיוס). הכן הפתרון עובד של 50 מ מ טריס pH 8.0 על ידי דילול 2.5 מ של 1 מ' טריס pH 8.0 ב- 47.5 מ של ddH2O.
  10. הכנת 1 מ' טריס pH 9.5 על ידי המסת 60.6 g ב- 400 מ של ddH2O. התאם ה-pH ל 9.5 עם כמה טיפות של 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 500 מ"ל ו autoclave (121 מעלות צלזיוס).
  11. להכין 0.13 ז 1-Methylimidazole pH 8.0 על ידי המדללת 1.6 מ ל 1-Methylimidazole 130 מ של ddH שטופלו DEPC2O. התאם ה-pH ל 8.0 עם בערך 450 µL של 12 N HCl. להוסיף 16 מ"ל של 3 M NaCl ולהביא את אמצעי האחסון עד 160 מ"ל. להפוך טריים לפני השימוש.
    התראה: 1-Methylimidazole הוא מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, לטפל רק בשכונה fume.
  12. הכן מ' 0.16 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide הידרוכלוריד (EDC) על ידי µL 176 המדללת של EDC 10 מ של 1 מ' 0.13-Methylimidazole. להתאים את ה-pH ל 8.0 עם µL כ-100 12 טריים N HCl. לעשות לפני השימוש.
    התראה: EDC מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, לטפל רק בשכונה fume.
  13. הכן 1% H2O2 על ידי דילול 1.5 מיליליטר 30% H2O2 ב- 50 מ של 1 x PBS. להפוך טריים לפני השימוש.
  14. להכין x SSC 20 pH 7.0 על ידי המסת 175.3 g של NaCl ו- g 88.2 של ציטראט נתרן (Na3ג'6H5או7) ב- 800 מיליליטר ddH2O. התאם את ה-pH אל 7.0 עם כמה טיפות 1 N HCl, להביא את אמצעי האחסון 1 ליטר, תא לחץ (121 מעלות צלזיוס).
    1. הכן הפתרון עובד של x SSC 2 pH 7.0 באמצעות דילול 20 מ של 20 x SSC, pH 7.0 ל- 180 מ"ל של ddH2O.
    2. הכן הפתרון עובד של x SSC 1 pH 7.0 באמצעות דילול 2.5 מ של 20 x SSC pH 7.0 ב- 47.5 מ של ddH2O.
    3. הכן הפתרון עובד של x SSC 0.2 pH 7.0 באמצעות דילול 5 מיליליטר 2 x SSC, pH 7.0 ב 45 מ"ל של ddH2O.
  15. הכן 1 x הכלאה פתרון על ידי דילול 0.5 מ של מאגר איש x microRNA 2 ב- 0.5 מ של ddH שטופלו DEPC2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  16. להכין תמיסת מניות 200 מ"מ Levamisole על-ידי הוספת 250 מ"ג עד 5 מ"ל של ddH2O. Aliquot ולאחסן ב-20 ° C.
  17. היכונו חסימה פתרון שלב 5 (10% כבשים serum/1% BSA/0.2 מ מ Levamisol) על-ידי דילול 1 מ"ל של כבשים נסיוב ב 9 מ ל PBST, והוספת 0.1 גר' BSA. להוסיף 10 μL של Levamisole לפני השימוש. להפוך טריים לפני השימוש.
  18. היכונו חסימה פתרון שלב 6 (10% עז serum/1% BSA) על-ידי דילול 1 מ"ל של נסיוב עז ב 9 מ של PBST, והוספת 0.1 גר' BSA. לאחסן ב 4 ° C ולהשתמש תוך שבוע.
  19. להכין פתרון prestaining על ידי דילול 3.3 מ של 3 M NaCl, 5 מ של MgCl 1 מ'2, 10 מ של 1 מ' טריס pH 9.5, 100 µL של יצירת רצף-20, µL 100 של Levamisole ב mL 81.5 ddH2O. להפוך טריים לפני השימוש.
  20. השתמש nitroblue tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly פוספט (BCIP) טבליות להכין 20 מ של פתרון המצע אלקליין פוספטאז (AP) על פי הוראות היצרן. הוסף 20 μL של Levamisole. להפוך טריים לפני השימוש, להגן מפני אור.
  21. הכן KTBT פתרון על ידי הוספת 4g של טריס, 4.4 g של NaCl, 375 מ"ג אשלגן כלורי ב 500 מ"ל של ddH2או אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס).
  22. אופציונלי: הכן הפתרון עובד דאפי (1 μg/mL) על ידי המדללת 50 μL של פתרון מניות דאפי (1 מ"ג/מ"ל) 50 מ של 1 x PBS.
    הערה: פתרונות סטנדרטיים כגון 3 M NaCl, MgCl 1 מ'2, 1 מ' טריס-HCl, נטולת נוקלאז ddH2O, 1 x PBS ו 20 x SSC ניתן לרכוש לחלופין. עבור פרוטוקול, צנצנות Coplin זכוכית 50 מ ל או מ"ל 20 שקופית פוליפרופילן מיילר שימשו צנצנות.

2. רקמת הכנה

הערה: הסעיפים הלב עכבר להשתמש כאן היו שהוכנו על ידי שירותי רקמה ייל פתולוגיה, מרקמות פורמלין-קבוע/פרפין-מוטבע, חותכים 5 μm וממוקמים בשקופיות טעונה.

  1. רקמות התייבשות.
    1. חממו את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, בתנור הכלאה עד פרפין נמס בעליל.
    2. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של הסוכן סליקה זמין מסחרית (ראו טבלה של חומרים) למשך 10 דקות, פעמיים.
    3. דגירה של השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכילים 50 מ של אתנול 100% למשך 2 דקות, פעמיים, ולאחריו 90% אתנול למשך 2 דקות, אתנול 70% למשך 2 דקות, פעמיים, 50% אתנול למשך 2 דקות ו- 30% אתנול למשך 2 דקות.
    4. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של ddH שטופלו DEPC2O למשך 5 דקות.
    5. דגירה השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות.
  2. רקמות דה-proteinating.
    1. דגירה שקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 20 μg/mL הפתרון עובד ProK, ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור הכלאה.
      התראה: תת מערכת העיכול עלול לגרום לעניים או אין התפתחות האות, בזמן העיכול יתר עלולה לגרום השפלה רקמות ופיתוח של צביעת הרקע. אופטימיזציה עשוי להידרש בשלב זה (μg 1 – 20/ProK, דגירה 5 – 20 דקות, mL RT-37 ° C).
    2. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות, ב- RT, פעמיים.
  3. קיבוע הרקמה.
    1. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית.
    2. להחיל 500 µL של 4% PFA פתרון האורך של כל שקופית, דגירה שקופיות אופקית במשך 10 דקות, בשעה RT.
    3. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS במשך 5 דקות, ב- RT, פעמיים.
    4. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 מ' 0.13-methylimidazole 10 דקות, ב- RT, פעמיים.
    5. החל µL 500 מ' 0.16 EDC פתרון האורך של כל שקופית, דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
    6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 50 מ מ טריס pH 8.0-RT.
    7. יש לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT, פעמיים.
      הערה: שני צעדים קיבוע כדורגלן ו- EDC נדרשים עבור miRNA crosslinking, לא צריך להיות מושמט. 31
  4. בלוק peroxidase אנדוגני.
    1. דגירה שקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1% H2O2 למשך 30 דקות ב- RT.
    2. יש לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT, פעמיים.

3. הכלאה

  1. מחממים הכלאה פתרון (500 µL לכל שקופית) ב 50 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה, עד טמפרטורת היעד, נגיש (10-15 דקות).
  2. להכין את התא הכלאה על-ידי הצבת 2 חתיכות של מסנן או ממחטת נייר בתחתית התא ומרטיב את הנייר עם 50% formamide/1 x SSC.
    התראה: Formamide מזיק הקרומים הריריים, עיניים, עור, ידית היחידה בשכונה fume.
  3. µL 200 של הכלאה פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית 1 – 3 h ב 50 מעלות צלזיוס, בתוך תא humidified.
  4. להכין את הפתרון בדיקה על ידי ערבוב µL 0.5 מלאי רגש (25 מיקרומטר) בתמיסה 250 µL ofhybridization (ריכוז סופי 50 ננומטר) צינור 1.5 מ.
    הערה: miRNAs שונים באים לידי ביטוי ברמות שונות, כך אופטימיזציה לגבי ריכוז בדיקה העשויים להידרש בשלב זה (1 – 50 ננומטר) להימנע אין אות או רקע פיתוח.
  5. החל µL 250 בפתרון בדיקה האורך של כל שקופית, למקם coverslip חינם RNase למעלה. למנוע את היווצרות בועות.
  6. לאטום את התא הכלאה עם מצלמות-מיקרוסקופים ובזהירות דגירה O/N ב- 50 מעלות צלזיוס.
    הערה: הטמפרטורה הכלאה צריך להיות מוגדר כ 30 מעלות צלזיוס מתחת הטמפרטורה ההיתוך RNA (Tm) של כל בדיקה. אופטימיזציה עשוי להידרש. . הנה, 50 ° C משמש הטמפרטורה הכלאה/שטיפת miRNA בלינק 182, משתנות בהתאם עבור הגששים שונים.

4. לכתחילה שוטף

  1. Prewarm 200 מיליליטר 2 x SSC ב 50 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה, עד טמפרטורת היעד (20-40 דקות).
  2. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 2 x SSC ב 50 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, או עד coverslips לשחרר.
  3. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 2 x SSC ב RT למשך 5 דקות, פעמיים.
  4. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 0.2 x SSC ב RT במשך 5 דקות.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של PBST ב RT במשך 5 דקות.
  6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות.
    הערה: השימוש RNase ללא תנאים כבר לא נחוץ מאז כלאיים RNA-RNA נחשבים יציבים.

5. זיהוי נוגדנים לחפור

  1. השתמש בעט הידרופובי לצייר מחדש מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית, במידת הצורך.
  2. החל µL 500 של חסימת פתרון האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית למשך 30 דקות ב- RT, בתוך תא humidified.
  3. הכן את הפתרון נוגדן החפירה (1:1, 000) על ידי המדללת 0.5 μL של החפירה נוגדן בתמיסה ofblocking µL 500 צינור 1.5 מ.
    התראה: אופטימיזציה העשויים להידרש בשלב זה (שבערך – 1:2, 000).
  4. µL 500 של החפירה נוגדן פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של PBST ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  6. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של prestaining פתרון RT במשך 5 דקות, פעמיים.
  7. דגירה שקופיות בתוך צנצנת מיילר שקופית פוליפרופילן המכיל 20 מ"ל ofAP המצע פתרון ב 37 מעלות צלזיוס, במשך 6-24 h, מוגן מפני אור.
    התראה: פיתוח צבע צריך להיבדק שכל ה 2 אופטימיזציה העשויים להידרש בשלב זה.
  8. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של פתרון KTBT RT במשך 5 דקות, פעמיים.
  9. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות.

6. cTnT זיהוי נוגדנים

  1. השתמש בעט הידרופובי לצייר מחדש מעגל דוחה מים סביב הרקמה בכל שקופית, במידת הצורך.
  2. החל µL 500 של חסימת פתרון האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  3. הכן את הפתרון נוגדן cTnT (1: 100) על ידי המדללת 2 μL של cTnT נוגדן בתמיסה ofblocking μL 200 צינור 1.5 מ.
  4. µL 200 בפתרון נוגדן cTnT חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית O/N ב 4 ° C, בתוך תא humidified.
  5. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  6. הכן את הפתרון נוגדן אנטי-rabbit-568 (שבערך) על ידי המדללת 0.5 μL של נוגדן אנטי-rabbit-568 בפתרון ofblocking μL 250 צינור 1.5 מ.
  7. µL 250 של נוגדן אנטי-rabbit-568 פתרון חלות על האורך של כל שקופית. דגירה שקופיות אופקית h 1-RT, בתוך תא humidified.
  8. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, שלוש פעמים.
  9. אופציונלי: החל µL 250 של הפתרון עובד דאפי האורך של כל שקופית ולאחר דגירה שקופיות אופקית 1 דקות ב- RT, מוגן מפני אור.
  10. לשטוף את השקופיות בצנצנת זכוכית Coplin המכיל 50 מ של 1 x PBS ב RT במשך 5 דקות, פעמיים.

7. הרכבה והדמיה

  1. הר של השקופיות עם 2-3 טיפות של הרכבה בינונית, תגית כיסוי זכוכית. לאפשר את השקופיות להתייבש שטוחים, O/N, ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
  2. המשך פלורסנטי או מיקרוסקופיה קונפוקלית.

תוצאות

miRNA בחיי עיר הכלאה אופטימלי במקטעי הלב העכבר באמצעות לטרוף miRNA U6-snRNA, אשר שימש ואתאיזם הפקדים בהתאמה. צביעת חיובי מסומן בכחול, בעוד ההכתמה שלילי הוא הצביע על ידי חוסר צבע פיתוח (איור 1A-1B). Cardiomyocyte ביטוי מסוים של miRNA-182 הוערכה בסעיפים הלב של שליטה ?...

Discussion

זיהוי תעתיק miRNA יכולה להיות מושגת באמצעות טכניקות שונות המשתנות רגישות, ירידה לפרטים, כוח כמותית. . הנה, נדגים את צימוד miRNA בחיי עיר הכלאה עם immunostaining. ומתארות פרוטוקול המאפשר להערכת בו-זמניות של רמות הביטוי של מולקולות miRNA, חלבון, על הלב הנוכשה. אנו הראשונים מראים כיצד לבצע בחיי עיר ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות אנטאנאסיוס Papangelis, על תגובות ביקורתיות על כתב היד. FM נתמך על-ידי ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC; BB/M009424/1). IP נתמך על ידי האמריקאי הלב האגודה מדען פיתוח המענק (17SDG33060002).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DiethylpyrocarbonateSigma AldrichD5758DEPC
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417PBS
Tween-20American BioanalyticalAB02038non-ionic surfactant
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
Sodium ChlorideThermoFisherS271NaCl
Magnesium Chloride HexahydrateThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 NThermoFisherSA48HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-MethylimidazoleSigma Aldrich336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma Aldrich39391EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probeQIagenYD006157015'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletsSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Potassium ChlorideThermoFisherP217KCl
DAPI solution (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
Glass coverslipThermoFisher12-545EGlass coverslip
Plastic coverslipGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910DIG antibody
Hydrophobic barrier penVector LaboratoriesH-4000Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibodyAbcamab92546cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023mounting medium
Sheep serumSigma AldrichS3772
Goat serumSigma AldrichG9023
Deionized FormamideAmerican BioanalyticalAB00600
Hybridization OvenThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer

References

  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139RNAimmunostaining

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved