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要約

マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として、短いと高い相同性の RNA シーケンスです。現在の miRNA 検出方法は、感度と特異度で変わる。In situハイブリダイゼーションや免疫染色マウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出を組み合わせたプロトコルについて述べる。

要約

マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) にバインドの翻訳を阻害して、劣化を促進させる、単一座礁させた RNA 転写産物です。日には、miRNAs はマイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性を意味したが、生物学的および病気プロセスの多数に関与しています。ここでは、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブを用いた miRNA 検出、マウス心臓セクションにおける蛋白免疫染色と組み合わせるための詳しいプロトコルについて述べる。まず、プローブを使用して、コントロールと心臓肥大のマウスからの中心セクションに miRNA 182 式を識別するの in situハイブリダイゼーション法を行った。次に、共同 miRNA-182 心筋細胞をローカライズするのには、同じセクションの心臓トロポニン T (cTnT) タンパク質に対する免疫染色を行った。このプロトコルを使用して、アルカリ性ホスファターゼによる miRNA 182 ベースの比色定量法と蛍光染色を通じて cTnT を検出することができました。このプロトコルは、LNA の掘分類されたプローブを介して関心の任意の miRNA の発現とマウス心臓切片に関連するタンパク質の発現を検出する使用することができます。

概要

マイクロ Rna (Mirna) は短い (18-25 のヌクレオチド)、単一座礁させた、非コード Rna メッセンジャー RNA (mRNA) の翻訳を抑制することおよび/または mRNA の分解促進により転写レベルでの遺伝子発現の負の制御因子として機能します。1。 miRNAs はイントロンやコーディングのエクソンから転写されるまたは非コード遺伝子と切断 70 ヌクレオチド2の短い茎ループ構造は、前駆体 miRNAs (pre-Mirna) に DROSHA、による核。次の細胞質をエクスポート、プレは 18-25 のヌクレオチド3,4にまたがる成熟 Mirna にダイサーによってさらに処理されます。その後、RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) として組み込まれていますこれらの Mirna 一本鎖 Rna を式3,5 を抑制するため、3' 非翻訳領域 (3' UTR)、ターゲット Mrna に結合可能.

最後の三十年に彼らが最初に識別されたので、遺伝子発現、その独自の表現のレベルが厳しく制御された6のマスター調節因子に Mirna が登場しました。Mirna の役割は、臓器開発7,8,9,10、11,12、恒常性1314,のメンテナンスに記載されています。、病気コンテキスト神経15,16,17,18,19, 心血管20, を含む自己免疫条件21 だけでなく、 ,22癌23,24,25。MiRNA 発現パターンの関連性の増加の感謝は前方マイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性をもたらしています。このようなメソッドなどリアルタイム PCR、マイクロ アレイ、北にしみが付くことの in situハイブリダイゼーション、miRNA のトラン スクリプトは短いから成るという事実のために主に感度、特異性、定量的な力で変化して高い相同配列の6。

我々 は最近、miRNA-182、心筋肥大26、高架の血行力学的要求27,28に応えて心臓の構造的に適応を記述する条件の開発の重要な役割を報告しました。心臓肥大は不適応改造29に関連付けられている場合は、会計 8.5% すべての死のために起因する心血管の条件、心不全のリスク増加につながることができる心筋の量の増加によって特徴付けられる病気30。

ここで、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブとマウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出用免疫染色での in situハイブリダイゼーションを組み合わせた私たちのプロトコルを説明私たち心臓肥大のモデル。

プロトコル

この研究のマウス心臓組織サンプルは関連する法律と制度のガイドラインに準拠して得られたし、イェール大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. ソリューションの準備

  1. RNase フリー ddH2O を用意し、5 ml の 0.1% ジエチルピロカーボネート (DEPC) の ddH2O の 5 L を扱うことによって常温 (RT) (O/N) を一晩します。オートクレーブ (121 ° C)、DEPC を非アクティブ化します。使用 DEPC 処理 ddH2O 準備のため下流のソリューションが示されます。
    注意: DEPC は既知の発癌物質、発煙のフードのみを処理します。
  2. 1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ソリューションを準備するには、1 l の DEPC 処理 ddH2o ・ オートクレーブ (121 ° C) 5 PBS 錠剤を溶解します。
  3. 非イオン性洗剤 1 × PBS の 1 L あたり 1 mL を希釈して 0.1% 非イオン性洗剤/PBS (pbst;) を準備します。
  4. DEPC 処理 ddH2o. で 90%、70%、50%、30% のエタノールを準備します。
  5. DEPC 処理 ddH2O. 因数でプロテアーゼ K (ProK) の原液 10 mg/mL を準備し、-20 ° C で保存ProK DEPC 処理 ddH2o. を使用する前に新鮮な 50 mL の原液希釈 100 μ l の ProK のソリューション作業 20 μ g/mL を準備します。
  6. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備するには、50 mL の 1x PBS で PFA の 2 g を追加します。時折揺れ、65 ° C で熱溶解するまで。因数と-20 ° C にてストア
    注意: PFA は、既知の発癌物質、発煙のフードのみを処理します。
  7. 87.8 g を 500 mL の ddH2o ・ オートクレーブ (121 ° C) に追加することによって 3 M 塩化ナトリウム水溶液を準備します。
  8. 20.3 g を 100 mL の ddH2o ・ オートクレーブ (121 ° C) に追加することによって 1 M MgCl2ソリューションを準備します。
  9. 1 M トリス pH 8.0 で ddH2O. 調整 pH 8.0 800 mL に溶解 121.1 g 1 N の HCl を数滴を準備、1 L とオートクレーブ (121 ° C) にボリュームをもたらします。1 M トリス pH 8.0 で 47.5 ddH2o. の mL の 2.5 mL を希釈して 50 mM Tris pH 8.0 の実用的なソリューションを準備します。
  10. 1 M トリス pH 9.5 ddH2O を 9.5 に pH を調整の 400 mL に溶解 60.6 g で 1 N の HCl を数滴を準備、500 mL とオートクレーブ (121 ° C) にボリュームをもたらします。
  11. 3 M の NaCl の 12 N HCl。 追加 16 mL の約 450 μ L の DEPC 処理 ddH2O. 8.0 pH を調整 130 mL に 1 Methylimidazole の 1.6 mL の希釈による 0.13 M 1 Methylimidazole pH 8.0 を準備し、160 mL にボリュームをもたらします。使用する前に新鮮なを確認します。
    注意: 1 Methylimidazole は皮膚、目、粘膜に有害、発煙のフードの処理のみ。
  12. EDC 0.13 M 1 Methylimidazole 10 mL に希釈 176 μ 0.16 M N-(3-Dimethylaminopropyl) n ′-ethylcarbodiimide 塩酸塩 (EDC) を準備します。使用する前に 12 N 塩酸を作る新鮮な約 100 μ L で 8.0 pH を調整します。
    注意: EDC は皮膚、目、粘膜に有害、発煙のフードの処理のみ。
  13. 1% H2O2を準備するには、1.5 mL 30% H2O2 50 mL の 1x PBS で希釈します。使用する前に新鮮なを確認します。
  14. 準備 20 x SSC pH 7.0 175.3 g 塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウム (Na3C6H5O7) 800 mL ddH2O. 調整による 88.2 g 溶解 1 を数滴と 7.0 に pH N HCl は、1 L とオートクレーブ (121 ° C) にボリュームをもたらします。
    1. DdH2o. の 20 x SSC pH 7.0 で 180 mL の 20 mL を希釈して 2 x SSC pH 7.0 の実用的なソリューションを準備します。
    2. DdH2o. の 20 x SSC pH 7.0 で 47.5 mL 2.5 mL を希釈して 1 x SSC pH 7.0 の実用的なソリューションを準備します。
    3. DdH2修の 2 x SSC pH 7.0 で 45 mL の 5 mL を希釈して 0.2 x SSC pH 7.0 の実用的なソリューションを準備します。
  15. DEPC 処理 ddH2o. を使用する前に新鮮な 0.5 mL の 2 x microRNA っぽいバッファーの 0.5 mL を希釈して交配ソリューション × 1 を準備します。
  16. 250 mg を 5 mL の ddH2O. 因数に追加することによってレバミゾールの 200 mM 在庫ソリューションを準備し、-20 ° C で保存
  17. 9 mL PBST、ヒツジ血清 1 mL を希釈して BSA の 0.1 g を追加 5 (10% 羊 serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) のステップのブロッキング液を準備します。レバミゾールの 10 μ L を使用する前に追加します。使用する前に新鮮なを確認します。
  18. PBST、9 mL のヤギ血清 1 mL を希釈して BSA の 0.1 g を追加 6 (10% ヤギ serum/1% BSA) のステップのブロッキング液を準備します。4 ° C で保存し、1 週間以内に使用します。
  19. 3 3.3 mL を希釈して予加工ソリューションを準備 M 塩化ナトリウム、5 mL 1 M MgCl2、1 M トリス pH 9.5、10 mL のトゥイーン 20、ddH2O を作る新鮮な 81.5 mL 中のレバミゾールの 100 μ L の 100 μ L を使用前に。
  20. 使用して、ニトロブルーテトラゾリウム (製造元の指示に従ってアルカリ性ホスファターゼ (AP) 基質溶液 20 mL を準備する NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly リン酸 (BCIP) 錠。レバミゾールの 20 μ L を追加します。使用前に新鮮なを確認し、光から保護します。
  21. KTBT ソリューションを準備するには、4 g のトリス、4.4 g の塩化ナトリウムと ddH2o ・ オートクレーブ (121 ° C) の 500 mL に KCl の 375 mg を追加します。
  22. オプション: 50 mL の 1x PBS で DAPI 原液 (1 mg/mL) の 50 μ L に希釈して DAPI 使用液 (1 μ g/mL) を準備します。
    注: 標準溶液 1 1 M MgCl2、3 M NaCl など x SSC 20 1x PBS、ヌクレアーゼ フリー ddH2O M トリス-HCl または購入できます。このプロトコル、50 mL ガラス Coplin jar または 20 mL ポリプロピレン スライド メーラーの jar ファイルが使用されています。

2. ティッシュの準備

注:、ここで使用されるマウス心臓セクションがホルマリン-固定・ パラフィン包埋組織からエール大学病理組織サービスの作製された、5 μ m でカットおよび充電スライドに配置されています。

  1. 組織の水分補給。
    1. 温かいパラフィンが溶けて目に見えてまでの交配のオーブンで、10 分の 60 ° C でスライド。
    2. 市販のクリア剤 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい (材料表参照) 2 回、10 分間。
    3. 2 倍、2 分の 50% エタノールと 2 分の 30% エタノール、2 分間の 100% エタノール 50 mL を 2 回含む、90% のエタノールの 2 分、2 分、70% エタノールが続くガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい。
    4. DEPC 処理 ddH2O 5 分の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい。
    5. 5 分の 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい。
  2. ティッシュ デ-proteinating。
    1. 20 μ g/mL ProK 実用的なソリューション、ハイブリダイゼーション オーブンで 15 分間 37 ° C で 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい。
      注意: 過剰消化組織劣化と背景の汚損の開発になる下消化を貧しい国または信号開発なしで可能性があります。最適化このステップで (1-20 μ g/mL ProK、5-20 分インキュベーション RT 37 ° C) 必要があります。
    2. RT での 5 分の 1 × PBS の 50 mL を 2 回含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  3. ティッシュの固定。
    1. 疎水性のペンを使用して、各スライドに周囲の組織撥水円を描きます。
    2. 各スライドの長さに 4 %pfa 液 500 μ L を適用し、10 分、室温の水平方向にスライドを孵化させなさい
    3. RT での 5 分の 1 × PBS の 50 mL を 2 回含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
    4. 2 回 10 分間、常温では、0.13 M 1 methylimidazole 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
    5. 各スライドの長さを 500 μ L の 0.16 M EDC ソリューションを適用し、加湿チャンバー内の RT で 1 h の水平方向にスライドを孵化させなさい。
    6. 室温 50 mM Tris pH 8.0 の 50 mL を含むガラス Coplin jar にスライドをすすぐ
    7. 常温では、1 × PBS の 50 mL を 2 回含むガラス Coplin jar にスライドをすすぐ。
      注: 両方 PFA と EDC の固定ステップ miRNA の架橋に必要なおよび省略しないでください。31
  4. 内因性ペルオキシダーゼ ブロック。
    1. 50 mL の 1% H2O2室温 30 分間を含むガラス Coplin jar 内のスライドを孵化させなさい
    2. 常温では、1 × PBS の 50 mL を 2 回含むガラス Coplin jar にスライドをすすぐ。

3. 交配

  1. ハイブリダイゼーション オーブンで 50 ° C の温度が設定温度までハイブリダイゼーション液 (スライドあたり 500 μ L) を予熱、(10-15 分) に達する。
  2. チャンバーの下部にフィルターまたはティッシュ ペーパー 2 個を置き、50% ホルムアミド/1 紙を濡れハイブリダイゼーション チャンバを準備 x SSC。
    注意: ホルムアミドは粘膜、目や皮膚、発煙のフードだけハンドルに有害です。
  3. ハイブリダイゼーション溶液 200 μ L を各スライドの長さに適用されます。加湿チャンバーで 50 ° C で 1-3 h の水平方向にスライドを孵化させなさい。
  4. 1.5 mL チューブの 250 μ L ofhybridization ソリューション (最終濃度 50 nM) で 0.5 μ L 在庫プローブ (25 μ M) を混合することによってプローブ ソリューションを準備します。
    注: 異なる miRNAs は、プローブ濃度に関する最適化ない信号や高いバック グラウンドの開発を避けるためにこのステップ (1-50 nM) の必要がありますので、さまざまなレベルで表されます。
  5. 各スライドの長さにプローブ ソリューションの 250 μ L を適用し、上 RNase フリー coverslip の場所します。気泡の形成を避けるため。
  6. 慎重に交配チャンバー内にパラフィルムをシールし、O/N を 50 ° c. で孵化させなさい
    メモ: ハイブリダイゼーション温度各プローブの RNA 融解温度 (Tm) 以下およそ 30 ° C を設定する必要があります。最適化が必要になる場合があります。ここでは、miRNA 182 の交配/洗浄温度として 50 ° C を使用、調整異なるプローブ用。

4. 金詰りの洗浄

  1. 2 の 200 mL を prewarm ターゲット温度 (20-40 分) に達するまで、ハイブリダイゼーション オーブンで 50 ° C で x SSC。
  2. 2 の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗う 50 ° c、5 分間、または、coverslips を緩めるまで x SSC。
  3. 2 の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗って 2 回、5 分間室温で x SSC。
  4. 0.2 の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗って 5 分常温 x SSC。
  5. 5 分間常温 pbst; 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  6. 5 分間常温 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
    メモ: RNA ハイブリッド車は安定するいると見なされるので、RNase フリーの条件を使用する必要がもはやです。

5. 抗体の検出を掘る

  1. 疎水性ペンを使用して、必要に応じて各スライドの周囲の組織撥水円を再描画します。
  2. 500 μ L の各スライドの長さにソリューションをブロックを適用します。RT 加湿チャンバー内で 30 分間水平にスライドを孵化させなさい。
  3. 500 μ L ofblocking 溶液 1.5 mL チューブに掘る抗体の 0.5 μ L に希釈して掘る抗体溶液 (1:1, 000) を準備します。
    注意: 最適化はこのステップに必要な可能性があります (1: 500-1:2, 000)。
  4. DIG 抗体溶解液 500 μ L を各スライドの長さに適用されます。加湿チャンバー内の RT で 1 h の水平方向にスライドを孵化させなさい。
  5. 3 回、5 分間常温 pbst; 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  6. 50 mL の溶液中常温 5 分間を 2 回予加工を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  7. スライド 6 – 24 h、光から保護のための 37 ° C で 20 mL に対して基板の解決を含むポリプロピレン スライド メーラー jar で孵化させなさい。
    注意: 発色は、このステップの必要がありますすべての 2 h. 最適化チェック必要があります。
  8. 洗浄は 2 回 5 分間常温 KTBT 溶液 50 mL を含むガラス Coplin jar に滑る。
  9. 5 分間常温 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。

6. cTnT 抗体の検出

  1. 疎水性ペンを使用して、必要に応じて各スライドの周囲の組織撥水円を再描画します。
  2. 500 μ L の各スライドの長さにソリューションをブロックを適用します。加湿チャンバー内の RT で 1 h の水平方向にスライドを孵化させなさい。
  3. 1.5 mL チューブに 200 μ L ofblocking ソリューションで cTnT 抗体希釈 2 μ l cTnT 抗体溶液 (1: 100) を準備します。
  4. CTnT 抗体溶液 200 μ L を各スライドの長さに適用されます。スライドをインキュベート水平 O/N 4 ° c、加湿チャンバーで。
  5. 3 回、5 分間常温 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  6. 1.5 mL チューブの 250 μ L ofblocking ソリューションでアンチうさぎ 568 抗体希釈 0.5 μ l 抗うさぎ 568 抗体溶液 (1: 500) を準備します。
  7. アンチうさぎ 568 抗体溶液の 250 μ L を各スライドの長さに適用されます。加湿チャンバー内の RT で 1 h の水平方向にスライドを孵化させなさい。
  8. 3 回、5 分間常温 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar 内のスライドを洗います。
  9. オプション: 各スライドの長さに DAPI 実用的なソリューションの 250 μ L を適用し、光から保護された RT で 1 分の水平方向にスライドを孵化させなさい。
  10. 洗浄は 2 回 5 分間常温 1 × PBS の 50 mL を含むガラス Coplin jar に滑る。

7. マウントおよびイメージング

  1. メディアをマウントし、ガラス製カバー スリップの 2-3 滴でスライドをマウントします。干し、O ・ N、4 ° c で、光から保護するスライドを許可します。
  2. Epifluorescent または共焦点顕微鏡に進みます。

結果

miRNAの in situハイブリダイゼーション スクランブル miRNA と U6 snRNA、それぞれ正と負のコントロールとして提供を使用してマウス中心セクションの最適化を行った。否定的な汚損は発色の欠乏によって示されている間、青で示されます陽性 (図 1 a-1 b)。MiRNA 182 の心筋細胞特異的発現を制御 PlGF 過剰発現マウスからの心臓セクシ?...

ディスカッション

miRNA のトラン スクリプトの検出は、感度、特異性、定量的な力が異なる別の技術で実現できます。ここでは、miRNAの in situハイブリダイゼーション免疫染色のカップリングを示す心のセクションは同じに、マイクロ Rna とタンパク質分子の発現量の同時評価を可能にするプロトコルを記述し、。心臓切片で上皮内掘 LNA マイクロ Rna プローブの交配を実行する方法を示す.次に、我?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は原稿の批判的なコメントのアタナシオス Papangelis を感謝したいです。バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC; で FM をサポートします。BB/M009424/1)。IP は、アメリカ心臓協会の科学者開発の補助金 (17SDG33060002) によってサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DiethylpyrocarbonateSigma AldrichD5758DEPC
Phosphate buffered salineSigma AldrichP4417PBS
Tween-20American BioanalyticalAB02038non-ionic surfactant
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K, recombinant, PCR GradeSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
Sodium ChlorideThermoFisherS271NaCl
Magnesium Chloride HexahydrateThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Hydrochloric Acid Solution, 1 NThermoFisherSA48HCl
Hydrochloric Acid Solution, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-MethylimidazoleSigma Aldrich336092
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma Aldrich39391EDC
Hydrogen peroxide solution H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrate dihydrateSigma AldrichS1804Sodium Citrate
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probeQIagenYD006157015'-DIG and 3'-DIG labelled
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletsSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Potassium ChlorideThermoFisherP217KCl
DAPI solution (1mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
Glass coverslipThermoFisher12-545EGlass coverslip
Plastic coverslipGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase free plastic coverslip
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910DIG antibody
Hydrophobic barrier penVector LaboratoriesH-4000Pap pen
Anti-Cardiac Troponin T antibodyAbcamab92546cTnT antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011anti-rabbit-568 antibody
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023mounting medium
Sheep serumSigma AldrichS3772
Goat serumSigma AldrichG9023
Deionized FormamideAmerican BioanalyticalAB00600
Hybridization OvenThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer

参考文献

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