Culturing בודדים של Tigriopus משטרגליים וניתוח כמותי של התנהגותם שומרים על חבר

Satomi Tsuboko-Ishii; Ronald S. Burton

doi:10.3791/58378

Summary

שמירה חבר ממלא תפקיד חשוב ברבייה של משטרגליים intertidal של הסוג Tigriopus. עם זאת, שיטות לימוד התנהגות זו לא היה טוב המתואר. כאן נתאר שיטות: תרבות 1) בודדים של חיות Tigriopus בתולה, 2) ניתוח כמותי של ההתנהגות שומרים על חבר שלהם.

Abstract

משטרגליים של הסוג Tigriopus, אשר נפוץ זואופלנקטון בבריכות הגאות רוקי, להראות precopulatory חבר-שמירה איפה זכר האוחזת זוג פוטנציאליים כדי ליצור זוג. בעוד תופעה זו משכה עניין של חוקרים, שיטות לניתוח שלו לא היה טוב המתואר. כאן נתאר נהלי: 1) בודדים culturing ו- staging של Tigriopus נוער, ומבוגרים 2) וידאו המבוסס על ניתוח של התנהגותם שומרים על חבר. השיטה culturing מאפשר שליטה ניסויית של קיצוץ ניסיון של בעלי חיים, כמו גם היכולת לעקוב אחר התפתחותם לפני מבחנים התנהגותיים. שיטת הניתוח מאפשר הערכה כמותית של מספר היבטים של ההתנהגות שומרים על חבר, לרבות לכידת נסיונות על ידי הזכרים ושחייה מסלול של חבר-שומרים על זוגות. למרות ששיטות אלה הוקמו במקור ללימודי ethological על Tigriopus, עם שינויים נכונה הם ניתן להחיל גם מחקרים של זואופלנקטון אחרים בתחומים מחקר שונים, כגון: פיזיולוגיה, טוקסיקולוגיה, וגם אקולוגית גנטיקה.

Introduction

משטרגליים intertidal של הסוג Tigriopus מופצים באופן נרחב בבריכות רוקי intertidal גבוהה על פני יבשות מספר¹. משטרגליים אלה שהפגינו התנהגות שומרים על חבר כחלק הרבייה שלהם, שבו גבר בוגר לוכדת זוג פוטנציאליים (נער או מבוגר) ניצול שלה מכור אנטנות הראשון לפני הזדווגות (איור 1 , איור 2)² ^,³^,⁴^,⁵. למרות התופעה היה נושא של מחקרים ethological וביוכימי עשורים²^,³^,⁶^,⁷, הליכים מפורטים עבור מחקרים על התנהגות זו, לרבות תרבות בודדים של בעלי חיים בתולה, קריטריונים של אירועים התנהגותית נראה ניסיון שמירה-mate, שלא היו תיאר היטב. לכן, כאן אנו להקים שיטות להפעלת מחקרים של ההתנהגות תחת סביבת ניסוי מבוקר.

Culturing וביצוע בודדים של בעלי חיים

מחקרים קודמים על רבייה של Tigriopus כמקובל המועסקים זוג ניתוק שיטה להכין קטינים (copepodids) ואת הנקבה הבוגרת לבדיקות התנהגותית, גידול ניסויים³^,⁸^,⁹ ^,¹⁰. עם זאת, שיטה זו מאפשרת חיות זוגות ואפשרות להזדווג לפני בדיקות (שעלון איטו 1988¹¹), אשר עשוי לשנות מאפיינים התנהגותיים של חיות⁵. בנוסף, יש גם פוטנציאל לטעות שלבים התפתחותיים של משטרגליים עם הפרוטוקולים קונבנציונאלי. כפי הם מסתמכים על גודל הגוף לעין עבור האחסון הזמני. בנייר זה, אנו מתארים שיטה culturing בודדים השתמשו במחקר האחרונה שלנו עם Tigriopus californicus⁵, שנועד לטפל הגבלות אלה על-ידי שליטה ניסיון שיוך של חיות ומעקב אחר ההתפתחות שלהם מ copepodid בשלבים למבוגרים.

ניתוח כמותי של חבר-שמירה

חבר-שמירה של מינים Tigriopus נחקר לא רק בתחום של אתולוגיה²^,⁶ , אלא גם בתחומים אחרים כגון ecotoxicology וגנטיקה אבולוציונית³^,⁴^, ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰. עם זאת, המחקרים הקודמים הסבירו את הקורס של התנהגות זו בעיקר בתוך נכתב טפסים ללא איורים חזותיים מספיק כדי לחלק לרמות את ההתנהגות והן את השיטות כדי ללמוד אותו, אשר יוצר מכשולים טכניים עבור שכפול וקידום של המחקרים. כאן, אנו מספקים תיאורים מפורטים של חלק מהאירועים מפתח בהתנהגות שומרים על חבר של משטרגליים Tigriopus הנתמכים על ידי חומרים ויזואליים. נדגים גם ציוד ושיטות לניתוח כמותי של ההתנהגות. שיטות אלה מאפשרות הערכה של מאפייני התנהגות של חיות במהלך ניסיונות שומרים על חבר בדיוק משוכפל בניסויים.

באמצעות שיטות אלה אנו שואפים לספק בסיס מתודולוגי של מחקרים מבוקרים לשחזור על חבר-שמירה של הסוג Tigriopus.

Protocol

1. הכנה של חיות בתולה תצפית התנהגותית

להשיג את הביצים ולאפשר להם לבקוע.
1. לאסוף את הנקבות gravid נושא ברור כתום (קרי, מופרית, בשלבים מתקדמים של פיתוח) ביצים (איור 3C) מתרבות מניות עם פיפטה פסטר. יש לשטוף את הנשים על ידי בעדינות pipetting אותם במדיום תרבות נקי כדי למנוע העברה של בעלי חיים אחרים, כולל בזחלים nauplial, ייתכן נמצאו בתרבות.
  הערה: במהלך הפרוטוקול, מי ים מלאכותי עם מליחות של 35% משמש תרבות בינוני. השתמש בינוני שונים (למשל ים מלאכותי עם מליחות גבוהה יותר או של ממס נוספים) בהתאם למטרת ניסוי.
  הערה: ראה אם אתם ואח 2015¹² עבור שיטה עבור הקמת מעבדה תרבות מניות, פריירה. ואח 2016¹³ לדוגמאות של אוסף האתרים של אוכלוסיות טבעית של californicus טי. פיטרסון. et al. דיווח גם על האתרים שלהם-אוסף של californicus טי, טי fulvus ג'אפוניכאס טי עם מידע קו רוחב וקו אורך⁹. השתמש פיפטות פלסטיק עם קיבולת של-30-50 מ"ל איסוף Tigriopus משטרגליים בריכות סלע.
2. מקם כל נקבה בנפרד טוב של צלחת תרבות 6-ובכן תא תרבות נקי בינונית (איור 4, שמאל). ודא כי אין חיה אחרת (כולל זחל nauplial) מזהם את הבאר.
3. לשמור על הלוחות באינקובטור מוגדר ב- 20 ° C עם מחזור של 12 שעות אור-כהה תרבות הנקבות עד שישחררו את שקי ביצים. שלב זה בדרך כלל לוקח אחד עד עשרה ימים בהתאם מינים שלבים התפתחותיים של העוברים. בינתיים, להאכיל כל נקבה gravid פעמיים בשבוע עם שני גרגרי דק מזון לדגים הקרקע (כ < 0.5 מ"מ קוטר) (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ).
  הערה: השתמש טמפרטורות שונות ומחזורי אור בהתאם למטרת ניסוי. טמפרטורות גבוהות יותר יכול להקל להתפתחות מהירה יותר של העוברים.
  הערה: להימנע מהשארת מזון עודף מרקיבים בבארות. אם פסולת מזון מתחיל להירקב, pipette זה מחוץ וולס עם פיפטה פסטר.
4. לאחר שקי ביצים משתחררות, להסיר הנקבות מן הבארות תרבות עם פיפטה פסטר.
  הערה: נקבות הופרתה מסוגלים ההשרצה וזעקה מרובים של הצאצאים²^,³. אם יש צורך, להעביר הנקבות אל םש לאסוף וזעקה נוספות.
איסוף copepodids לתרבות בודדים.
1. לשמור על הצלחות עם הדברים המקווקו בחממה, תרבות את הדברים עד שהם מפתחים. כדי השלב הראשון copepodid (CI) (איור 4, התיכון). שלב זה בדרך כלל לוקח מאחד עד שבועיים. כל ההזנות היטב עם מספר גרגרי הקפה דגים תוך חיפוש לבעלי CI פעם שני ימים. מילוי מחדש המים המתאיידים לגידול עם מים מזוקקים.
  הערה: אם פסולת צפים מונעת את התצוגה, להחליק את זה עם חתיכה קטנה של מגבת נייר.
2. ברגע CI חיות מתחילים להגיח, לאסוף אותם מן הבארות עם micropipette P-10 עם הנפח שלה pipetting שוכן בגובה כ- 8 µL, תחת stereomicroscope ב- 10 X ל X 40 הגדלה (איור 4, נכון). לשטוף כל חיה CI מאת בעדינות pipetting זה במי ים נקי מלאכותי ולמקם אותו טוב של צלחת תרבות 24-ובכן התא המכיל 2-3 מ מ עומק (כ 400-600 µL) של מי ים מלאכותי.
  הערה: להימנע מסחיבת מעל nauplial exuviae או חיות אחרות לתוך הבארות לתרבות בודדים.
מעקב אחר התפתחות של האנשים על ידי ספירת exuviae נשרתי.
1. לבחון בתוך כל טוב של exuviae נשרתי כל יומיים שלושה (להתאים את תדירות במידת הצורך) על ידי התבוננות stereomicroscopic בתאורה אפל-שדה-10 X 40 X הגדלה. Exuviae של copepodids הם שקופים לזיהוי עם הרגליים סמר, זוג סימטרית רמי (קרי, רזה בולטות המבנים בסוף סימטרית), ו/או פילוח של prosome ו- urosome (איור 5). לשנות את המיקוד ואת תאורה כדי לזהות exuviae בעומקים שונים בבאר (איור 6A).
  הערה: exuviae נשרתי קטנים החיה יש נשרתי אותם. להתחיל בבדיקה הגדלה נמוכה יותר עבור חיה, exuviae חדשים יחסית והאטרקציות shift כדי הגדלה גבוהה יותר עבור מבוגר exuviae (קרי, קטן יותר).
  הערה: אם exuviae לבאר פגומים, לשלול את הבאר נוספות התפתחותית ממעקב כדי להימנע משפח שלבים התפתחותיים.
  הערה: אם פסולת צפים מונעת את התצוגה (איור 6B), להחליק את זה עם חתיכה קטנה של מגבת נייר.
2. להקליט את המספר הכולל של copepodid exuviae כל היטב עם סימן צמיגים בוערים על המכסה צלחת (איור 7). להוסיף קו לסימן כפי exuviae החדש נמצא בתוך הבאר.
  הערה: אם יש nauplial exuviae מזוהם בבאר, לחסל אותם מהרוזן.
3. להאכיל כל אדם עם שני גרגרי הקפה דגים. מילוי מחדש עם מים מזוקקים כדי לשמר את המליחות המים המתאיידים לגידול.
  הערה: להאכיל copepodids כל שלושה ימים כדי למנוע מהם לצרוך ופגיעה נשרתי exuviae, אשר פוטנציאל להשפיע שערוך של שלב התפתחותי (שלב 1.3.4).
4. ההערכה בשלב התפתחותי החיה מבוסס על מספר exuviae. אם אין exuviae, הפרט מוערך בשלב CI. אם אחד עד ארבעה exuviae, הפרט מוערך ב CII CV בשלבים. אם ישנם חמישה exuviae, הפרט מוערך להיות מבוגר.
זיהוי מין למבוגרים המבוסס על מורפולוגיה.
1. סקס חיות על ידי בחינת המורפולוגיה שלהם. הזכרים הבוגרים Tigriopus בעלי אנטנות הראשון הברך הצדי עם מבנים מכור הכדוריים בקצה הדיסטלי (איור 3 א). הנקבה הבוגרת בעלי הראשון יחסית רזה וחלק יותר אנטנות (איור 3B) מאלה של גברים. כמה נקבות התערוכה גם צבע ירוק כהה מן האשכים השומנים בגופם (איור 3B, 3D).
2. סמן את הסקס על המכסה של הבאר (איור 7 ב).

2-מבחן התנהגותית, הקלטת וידאו של חבר-שמירה

ביום הבדיקה, בחר חיות של השלב הרצוי וסקס עבור מבחן התנהגותית.
1. להאכיל את האנשים שנבחרו בבארות תרבות עם מזון דגים טחון דק ולאפשר להם לאכול את זה במשך 30 דקות. בינתיים, המשך לשלב 2.1.2 להכין צ'יימברס הבדיקה.
2. להכין שתי בתחתית שטוח 48-ובכן, תא תרבות צלחות כמו בדיקות צ'יימברס; צלחת אחת (להלן נקרא "צלחת A") הוא לגברים והוא אחרים ("צלחת B") עבור מטרות (למשל copepodids, נשים בוגרות, הזכרים הבוגרים). הוסף µL 400 של מי ים נקיים מלאכותי מליחות של 35% במספר בארות של הלוחות. מניחים את הצלחות על רכיב pad אור LED מכוסה לוח אקרילי שקוף כמו מפזר אור (איור 8).
  הערה: השתמש בינוני שונים בהתאם מטרה של ניסוי.
  הערה: כדי למנוע עודף חום, אל תשתמש מנורות ליבון או פלורסנט כמו תאורה אחורית.
3. לאחר זמן האכלה 30-מין שמתואר 2.1.1, לשטוף כל חיה על ידי בעדינות pipetting אותו לתוך רצף של ארבע בארות של צלחת 24-ובכן מלא עם מי ים נקיים מלאכותיים (איור 9) כדי למנוע carry-over של פסולת, exuviae תרבות בארות.
4. מקום יחידים שטף את הבארות של צלחות A ו- B על משטח אור LED. לאפשר 30 דקות עבור התאמה של בעלי החיים כדי הבארות.
5. הגדר את מצלמת וידאו מעל צלחת A במהלך תקופת הסתגלות (איור 8). השתמש בחצובה או דוכן להחזיק את המצלמה.
6. להתמקד המצלמה הזכרים בתוך צלחת כדי לאפשר תצפית של אנטנות.
  הערה: כדי להפחית הבהוב התאורה האחורית בסרטים, להגדיר קצב מסגרות שווה לאו מחצית תדר חשמלי ולהשתמש זמן חשיפה ארוך יותר. כמו כן, לשמור על משטח אור LED מכוסה לוח אקרילי שקוף, כפי שמתואר בשלב 2.1.2.
לאחר תקופת הסתגלות שמתואר בשלב 2.1.4, התחל הקלטת וידאו, המבחן ההתנהגותי.
1. להעביר את המטרות צלחת B צלחת A עם פיפטה פסטר. אם הניסוי הוא רגיש רכיבים כימיים בינוני, לשנות פיפטות עבור כל זוג הבדיקה.
  הערה: כאשר pipetting חיה באמצעות גלופה B, לא תופס את זה במים עם פיפטה פסטר כמו הפרעה מים יכולים לגרות את החיה וירתקו את תנועתו עודף. להחזיק טיפ של פיפטה מעט מעל פני המים ולחכות הפרט לבוא מתחת הטיפ. בעדינות pipette זה למעלה עם כמות קטנה של מי ים מלאכותי, ואחר כך הוצא אותו לבאר בצלחת א
2. על פי תוכנית ניסויית, לאפשר זכר ואת היעד לתקשר היטב כל לתקופה הרצויה של התבוננות זמן (למשל 10 דקות) לאחר ההעברה.
3. לעצור את הקלטת וידאו אחרי הפעם תצפית. במידת הצורך, להוריד את הסרטים מוקלטים מהמצלמה למחשב.

3. ניתוח ידנית של מאפייני התנהגות

לבחון את הסרט בשביל התזמון לכל מטרה הועבר לתוך הבאר בצלחת א
לבחון החניכה, סיום בתזמון של אירועים מעניינים ולחשב משך השהיה, התדירות של האירועים.
1. הגדר חניכה של ניסיון בטחוני בידי הגברים כאיש קשר של האנטנה של הזכר עם כל חלק בגוף של היעד (איור 10, למעלה משמאל). הקשר antennal מופיע לעיתים קרובות מהיר (< 0.5 s) או להתנפל.
2. הגדרת סיום של ניסיון בטחוני כנקודת כאשר הן אנטנה של הגבר ניתוק מהגוף של מטרה (איור 10, למעלה מימין). לחשב את התדירות של שומר על ניסיונות כמו:
3. הגדר חניכה של הזדווגות על ידי עיקול הגוף הגבי של זכר ואחריו דפוס שחוזר על עצמו של urosome נגד זה של הנקבה (איור 10, הימנית התחתונה). התדירות של דחוף את זה מספר פעמים בשנייה.
  הערה: גבר שומר זוחל למטה אל סוף סימטרית בגוף של נקבה לפני הזדווגות (איור 10, למטה משמאל).
4. הגדרת סיום של הזדווגות על ידי ניתוק urosomes לאחר האירועים המתוארים 3.2.4.
  הערה: הזדווגות בדרך כלל מתרחש למשך מספר דקות במקרים של californicus טי טי ג'אפוניכאס.

4. מימדי מעקב של זוגות ויחידים

הפקת סרטון וידאו הכולל פרק של הריבית (למשל הראשון 3 s של ניסיון בטחוני) באמצעות קיטום הסרט רשמת בשלב 2 עם תוכנת עריכת הסרט.
להתקין ImageJ¹⁴ מ: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. ואז להוריד את MTrackJ, תוסף מעקב תנועה עבור ImageJ¹⁵, לפי ההנחיות על: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
לפתוח ImageJ וייבא סרט עניין (למשל, קובץ > ייבוא > באמצעות QuickTime; בחר "גווני אפור של 8 סיביות המר" כדי לצמצם את הזיכרון הדרוש עבור עיבוד תמונה).
לבצע כיול המרחבי והשעה.
1. בחרו בכלי בחירת קו ישר בחלון ImageJ לכיול מרחבית.
2. צייר קו הבחירה לאורך עצם באורך ידוע (למשל קוטר של באר) בחלון של הסרט.
3. פתח את תפריט "סולם להגדיר" (נתח > ' קבע קנה מידה '). הזן את אורך ידוע בתיבת "מרחק ידוע" ויחידת שלה (למשל מ. מ) בתיבת "של אורך יחידה". לחץ על תיבת הסימון "גלובל" לשימוש בסולם עבור קטעי וידאו אחרים.
4. פתח את תפריט 'מאפיינים' (תמונה > מאפייני) לצורך כיול זמן. הזן מרווח מסגרת (הדדיים של קצב המסגרות) בתיבת "מרווח מסגרת".
להגדיר מעקב MTrackJ.
1. לפתוח את התוסף MTrackJ תוספים > MtrackJ על ImageJ. לחץ על לחצן "מעקב" בחלון שיח MTrackJ לפתיחת מעקב תצורת התפריט.
2. להגדיר מרווח זמן המעקב על-ידי בדיקת "להעביר לאינדקס בפעם הבאה לאחר הוספת נקודה", להזנת מספר בתיבה "זמן שלב גודל" חלון הדו-שיח תצורה. כדי לבצע מעקב אחר מסגרת, הזן "1" בתיבת "גודל צעד זמן".
3. בדוק "החל המקומי הסמן הצמדה במהלך מעקב" ובחר "centroid האפל" כמו תכונה snap. אפשרות זו מאפשרת של זיהוי אוטומטי של centroid של עצם כהה (קרי, שבו אדם או זוג) תוך זיהוי מרובע ("טווח הצמד") סביב הסמן. בחר גודל של הכיכר כדי לכסות כל בזוג או חיה בסרט (למשל 31 x 31 פיקסלים).
4. לחץ על "אישור" כדי להחיל את האפשרויות שבחרת.
לבצע מעקב דו מימדי.
1. לחץ על הלחצן 'הוסף' בחלון שיח MTrackJ להתחיל מעקב.
2. מקם את הסמן (זיהוי ריבוע) כדי לכסות את זוג או אדם יחיד לבצע אחריהם מעקב. לחץ על כדי לאתר את centroid האפלים של האובייקט בתוך הריבוע.
3. חזור על שלב 4.6.2 למספר הרצוי של מסגרות.
4. כדי ליצור טבלאות נתונים, לחץ על לחצן "מדידה" בחלון שיח MTrackJ. הנתונים מוצגים שני חלונות: "MTrackJ: רצועות" חלון מציג סיכום של מסלול דו מימדי מסומנים ומראה "MTrackJ: נקודות" נתונים מפורטים עבור כל נקודת זמן. לשמירת כל טבלה, בחר ' קובץ ' > שמור בשם. בתפריט ImageJ.
  הערה: עיין במדריך המקוון שסופקו על-ידי היזם (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) לקבלת תיאורים של כל עמודה של נתונים.
5. כדי ליצור סרט עם מסלול מסומנים כשטר קו בצבע, לחץ על לחצן "סרט" בחלון שיח MTrackJ. בשביל להציל את הסרט שנוצר, בחרו ' קובץ ' > שמור בשם. בתפריט ImageJ.
שמור כל תוצאה. לחץ על הלחצן "שמור" בחלון שיח MTrackJ כדי לשמור את התוצאות כולל את הנתונים (שלב 4.6.4) ואת המסלול מימדי מסומנים (שלבים 4.6.2 ו 4.6.3).

תוצאות

השיטה culturing בודדים המתוארת בשלב 1 מאפשר הכנה הזמני של חיות בתולה ללא ניסיון קודם של ההתאמה.

במבחן ההתנהגות המתוארת בשלב 2 מאפשר הקלטת וידאו וצפייה חבר-שמירה של Tigriopus משטרגליים. הבדיקה הבאה של הווידאו המוקלט בשיטות המתוארות שלבים 3 ו- 4 מאפשרת ניתוח כמותי של מספר היבטים של התנהגות המוצגת באיור1.

איור 11 מראה הבדל משך ממוצע של שומר על ניסיונות בין זוגות גבר-אישה וזוגות הגברים של californicus טי. ניתוח ידנית הוכיח כי הגברים זוגות הראו משך קצר יחסית של ההתאמה מאשר זוגות זכר-נקבה.

דוגמאות של מסלולים מסומנים עם שיטת הניתוח מוצגים באיור 12, תוצאה נציג של ניתוח מהירות מוצג באיור13. מימדי מעקב המרחבי שהוקם על שמירת זוגות של californicus טי התגלה כי זוגות הגברים נטו להציג מהירות גבוהה יותר מאשר זוגות זכר נקבה הראשון 3 s של שומר על ניסיונות.

figure-results-1198
איור 1: חבר-שמירה ב- Tigriopus. (א) גבר בוגר בכרים קטין (copepodid) עם מחושיהם הראשון (המסומנים על ידי חצים כחולים). בר = 1 מ מ. (B) חלוקה לרמות של חבר-שמירה. גבר מנסה ללכוד אדם היעד (משמאל) ויוצר זוג עם זה (באמצע). הגברים זוגות, כמה זוגות זכר-נקבה, ניסיון בטחוני מסתיימת ללא הזדווגות. איור זה השתנה Tsuboko-אישיי, ברטון 2017⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-1902
איור 2: שלבים התפתחותיים של Tigriopus. Tigriopus המינים עוברים בדרך כלל שישה שלבים nauplius (מ- NI כדי NVI), חמישה שלבים copepodid (מ- CI ל CV), מטוס הבמה למבוגרים (CVI)¹⁶. זכרים לעשות ניסיונות בטחוני נוער מ שלב מוקדם copepodids (CI⁶^, ג'אפוניכאס ט וט fulvus¹⁷ ) של CII טי californicus³, כמו גם מבוגרים בני שני המינים⁵. איור זה השתנה Tsuboko-אישיי, ברטון 2017⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2773
איור 3: מורפולוגיה של מבוגרים (californicus ט). (א) גבר בוגר. (B) הנקבה הבוגרת. (ג) Gravid נקבה בוגרת עם שק ביצים עם ביצים (ברור כתום) מופרית ולא מפותחת. (ד) Gravid נקבה בוגרת עם שק ביצים עם מופרית או לא מפותח (ירוק כהה) ביצים. חיצים מציינים שקי ביצים. בר = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3424
איור 4: מונחים לקראת תרבות בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3768
איור 5: נשרתי exuviae. (א) Exuviae מ- CI בשלבים קורות חיים של חיים בודד של californicus טי. בר = 1 מ מ. (B) Exuviae מן המודיעים על קורות חיים מעלים בתרבות בודדים טוב. פסולת לבן הוא צואה בעל חיים תרבותי בתוך הבאר (לא מוצג בתמונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4350
איור 6: חיפוש של exuviae תחת stereomicroscope. ברים = 1 מ מ. (א) מוקד השינוי של stereomicroscope גילוי של exuviae בעומקים שונים. מגנטה חיצים מציינים exuviae ממוקד, חיצים אפורים מציינים exuviae לא ממוקד. תמונה עליונה מתמקד exuviae השמאלי, אשר הוא שקוע בתחתית הבאר. התמונה התחתונה מתמקד exuviae הנכון, אשר צפה מתחת לפני השטח בינוני. (B) תמונה עליונה מראה דוגמה של חסימה של בדיקה על ידי פסולת צף על פני השטח בינוני. חץ ירוק מציין exuviae מוסתר מתחת ההריסות. התמונה התחתונה מציגה תוצאה של משטח ניקוי עם חתיכה קטנה של מגבת נייר. Exuviae (מסומן בחץ ירוק) מוצגת לאחר הניקוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5261
איור 7: הזמני, זיהוי מין של בעלי חיים- דוגמאות כיצד לסמן מספר exuviae ומין של חיות על מכסה של צלחת תרבות. (א) דוגמא לכל באר המכילה חמישה exuviae, בעל החיים הבוגר. מספר הקווים מארק צמיגים בוערים על המכסה מייצג את מספר exuviae נמצאו בבאר. כאשר מספר exuviae מגיע חמש דקות, הסקס של החיה יכול להיקבע בהתבסס על אנטנות מורפולוגיה (ראה גם איור 3). (B) דוגמה של מכסה מסומן של צלחת תרבות. בוגרים (CIV לבוגר) לבעלי חיים מכילים השורות ומכילים שורות למטה (קרי, שנאספו לאחרונה) חיים צעירים (CI כדי CIII). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6134
איור 8: ערכת בדיקה התנהגותית- כיוונון עבור הקלטת וידאו של חבר-שמירה (משמאל) וקו מיתאר של בדיקה התנהגותית (מימין). איור זה השתנה Tsuboko-אישיי, ברטון 2017⁵. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6623
איור 9: שטיפה של בעלי חיים לפני בדיקה התנהגותית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6980
איור 10: הגדרה של אירועים בדק בניתוח ידנית. איורים של אירועים נצפו ביחס שומרים על חבר ניסיון. שמות האירועים המוגדרים וניתח בשלב 3 מודגשים. אירועים בתוך קו מנוקד לא ייבחנו בניסיונות כמה שומרים על חבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7492
איור 11: ההבדל שתשמור על משך הזמן שבין זוגות גבר-אישה וזוגות הגברים של californicus ט. לכל סמל המשולש מייצג נתונים זוג נבדק אחד. ברים, שפם מייצגים medians, טווח בין רבעוני בהתאמה. משך הזמן הממוצע של לכידת היה גדול עבור זוגות זכר-נקבה (זכר-נקבה (n = 22), זכר-זכר (n = 29); * *p < 0.01 על ידי מבחן מאן-ויטני U). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8132
איור 12: מסלולים של זוגות בשלוש השניות הראשונות של שומר על ניסיונות. דוגמאות מסומנים מסלולי דו מימדי של זוגות זכר-נקבה (משמאל), זוגות הגברים (מימין) של californicus טי. הנקודות על מסלולים מייצגים נקודות זמן (30 מסגרות לשנייה). הסורגים = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8698
איור 13: ההבדל במהירות מרושע לאחר החניכה לשמור בין זוגות גבר-אישה וזוגות הגברים של californicus ט. לכל סמל המשולש מייצג נתונים זוג נבדק אחד. ברים, שפם מייצגים medians, טווח בין רבעוני בהתאמה. ממוצע מהירות של זוג הראשון 3 s של שומר על ניסיונות היה גדול עבור זוגות הגברים (זכר-נקבה (n = 13), זכר-זכר (n = 35). * * *p < 0.001 על ידי מבחן מאן-ויטני U). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9377
תוספת איור 1: השפעת שטיפה טיפול על אופן הפעולה של Tigriopus. לכל סמל עיגול או המשולש מייצג נתונים נבדק יחיד או זוג אחד. ברים, שפם מייצגים medians, טווח בין רבעוני בהתאמה. יחידים "שטופים" ו "לא לשטוף" קבוצות שטופלו באופן זהה, פרט לכך הקבוצה "לא לשטוף" לא לחוות את הטיפול השטיפה (שלב 2.1.3) לפני הזמן התאמת 30 דקות (שלב 2.1.4). (א) מהירות ממוצעת של הזכרים שטופים נטו להיות גדול יותר מזה של גברים לא שטופים (לשטוף (n = 6), לא שטופים (n = 6), נ. ס: הבדל משמעותי אותרה על ידי מאן-ויטני U במבחן). המהירות נמדדה ב-30 s מבוסס על קטעי וידאו מוקלט לאחר זמן הסתגלות. (B) מהירות ממוצעת של נקבות שטופים נטו להיות גדול יותר מזה של נקבות לא שטופים (לשטוף (n = 6), לא שטופים (n = 6), נ. ס: הבדל משמעותי אותרה על ידי מאן-ויטני U במבחן). המהירות נמדדה ב-30 s מבוסס על קטעי וידאו מוקלט לאחר זמן הסתגלות, בעקבות שלב 4 (מעקב אחר מרווח = 0.5 s). (ג) בתדירות של שומר על ניסיונות היה גדול עבור זוגות של יחידים שטופים (לשטוף (n = 6), לא שטופים (n = 6). * * p < 0.01 על ידי מבחן מאן-ויטני U). (ד) משך שומרים על ניסיונות נטו להיות גדול עבור זוגות של יחידים שטופים (לשטוף (n = 6), לא שטופים (n = 6), נ. ס: הבדל משמעותי אותרה על ידי מאן-ויטני U במבחן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Culturing בודדים והנחישות של הבמה וסקס

כאן אנחנו תיאר את שיטת המחקר הקודם שלנו⁵ להכין חיות Tigriopus בתולה עם חוויית ההתאמה שלהם מבוקר תוך מעקב אחר ההתפתחות שלהם (איור 4 , איור 7). כפי Tigriopus מינים שאינם מנוצלים כחיות מודל בתחומים ביולוגיים שונים כגון¹⁶^,הרעלים¹⁸, פיזיולוגיה אקולוגי¹⁹^,²⁰^,²¹, אבולוציונית גנטיקה¹³^,²²^,²³^,²⁴, בשיטה זו יש פוטנציאל לספק אמצעי חשוב להעריך את השפעתם של גורמים סביבתיים וגורמים גנטיים על מחזור החיים של האלה משטרגליים.

כדי להשיג הזמני מוצלחת, החיפוש הרגילה, אוסף של CI copepodids מתרבות המוני (שלב 1.2) הוא קריטי, כמו אוסף בשלבים מאוחרים יותר עלול לגרום הזמני שגויה של בעלי החיים. בנוסף, חיפוש יסודי exuviae (שלב 1.3) חיוני גם עבור הזמני מדויק. להגדיל את התדירות של אוסף, היערכות במידת הצורך, כמו מרווח הזמן בין ומתנשל לדרגה הבאה משתנה מאחד עד מספר ימים בהתאם מינים והגידול תנאי²^,²⁵^,²⁶. הבדלים אנטנות מורפולוגיה בין copepodids לבין נשים בוגרות אינם משמעותיים בעליל כמה מינים ואוכלוסיות של¹⁶^, Tigriopus²⁵. לפיכך, הזמני לפני סקסיייי שימושי לבידול הבוגרת copepodids מתקדמים של מין או.

מבחנים התנהגותיים וניתוח ידנית של מאפייני התנהגות

באופן כללי, אחד החלקים הקריטיים ביותר של מחקרים ethological הוא הגדרה ותיאור של אירועים מעניינים. השיטות הציג נייר זה היו תחילה שפותחו עבור המחקר האחרונה שלנו⁵ , בתוספת התיאור של הזדווגות, עזרים חזותיים (איור 10). בנוסף לכך, עקביות לטיפול בבעלי חיים גם ממלא תפקיד חשוב בניסויים התנהגותיים. לדוגמה, שטיפה של משטרגליים פוטנציאלי עשוי להקל על היבטים מסוימים של אופן הפעולה שלהם (משלימה איור 1), ולכן רצוי שיבוצע באופן עקבי בין מדגמים, כגון סטנדרטית בשלב 2.1.3. אנו מצפים החומרים הניתנים הנייר הזה יסייע מחקרים מבוקרים לשחזור על חבר-שמירה של Tigriopus, קידום מחקרים הרבייה והאקולוגיה של תושב הזה שופע בריכות הגאות.

מגבלה אחת אפשרי בשיטה זו היא הגדלה נמוכה של תמונות שהושג. למרות סרטים הקליט עם המערכת שלנו לאפשר זיהוי של מבנים בולטים הגוף כולל urosomes ומחושים הראשון זכר, אחד לא יוכלו לצפות עוד מבנים עדינים כגון הרגליים, איבר המין בשיטה שלנו מאז זה אינה מעסיקה הגדלה מיקרוסקופית עבור הקלטת וידאו. בעוד קלי. ואח דיווחו כי הם היו מסוגלים להבחין spermatophore להעביר זכרים נקבות של טי ג'אפוניכאס תחת תצפית מיקרוסקופית בהגדלה X 100 (לא וידאו מוקלט)⁷, לא היינו מסוגלים להבחין spermatophore בסרטים שלנו, אולי בגלל המגבלה של רזולוציית התמונה.

מעקב דו-ממדית של זוגות

למרות ששיטה זו אינה מאפשרת מעקב תלת מימדי של בעלי חיים, הוא מאפשר ניתוח מסלול דו מימדי של זואופלנקטון ללא כימית תיוג חיות (cf. שומן חזיר. ואח 2010²⁷) על-ידי ניצול תוכניות מופץ ללא תשלום. אם הגודל של קובץ סרט גדול מדי להיות מעובד ב ImageJ, אחד יכול להפחית את הרזולוציה של הקובץ ולהמיר אותו סרט סולם אפור. בעוד השיטה המתוארת פותחה במקור עבור זוגות מבוגרים של californicus טי (איור 12 ו 13 איור), זה גם זמינה עבור מבוגר-לנוער זוגות ויחידים יחיד (משלימה באיור 1) כמו יתר המינים Tigriopus באופן עקרוני. אנו מצפים עוד יותר את השיטה להיות מסלול החלים לטווח קצר (מ מהפיצוץ כדי המאזניים בפעם השניה) ניתוח של זואופלנקטון של אחרים taxa עם התאמות.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים Sumitomo הקרן, יפן (מענק עבור פרוייקטים מחקר מדעי בסיסי, להעניק מספר: 150932), מחקר מכון של חסרי החוליות, יפן (מענק מחקר אישיים 2018) STI RSB ושל מענק מארצות הברית. הקרן הלאומית למדע (דב-1556466) כדי RSB. אנו מודים גב' קיאנה מישל וודוורד על משוב על שיטת culturing, הזמני.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands. Inc.	SS1-160P	For preparation of culture medium
PRO PlecoWafers	Tetra	16447	Food for copepods (used after being ground in a mortar)
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid	Corning Co., Ltd.	353224	Container for culture of gravid females and hatched nauplii
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid	Corning Co., Ltd.	353226	Container for individual culturing
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	Behavioral observation chambers
LED light pad	Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.	Litup LP4	Backlight for behavioral observation
Camera	Canon	0591C003 (model: Rebel T6i)	For recording of behavior
Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	For transfer of copepods
P10 micropipette tips	VWR	613-0735	For transfer of C1 stage copepodids
ImageJ	NIH	Version 1.49t	For semi-automatic analysis of movies
MTrackJ		Version 1.5.1	ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)

References

Chullasorn, S., Dahms, H. U., Klangsin, P. A new species of Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida: Harpacticidae) from Thailand with a key to the species of the genus. Journal of Natural History. 47 (5-12), 427-447 (2013).
Fraser, J. H. The occurrence, ecology and life history of Tigriopus fulvus (Fischer). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 20 (3), 523-536 (1936).
Burton, R. S. Mating system of the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 86 (3), 247-252 (1985).
Lazzaretto, I., Salvato, B., Libertini, A. Evidence of chemical signaling in Tigriopus fulvus (copepoda, harpacticoida). Crustaceana. 59 (2), 171-179 (1990).
Tsuboko-Ishii, S., Burton, R. S. Sex-specific rejection in mate-guarding pair formation in the intertidal copepod, Tigriopus californicus. PLoS ONE. 12 (8), e0183758 (2017).
Ito, T. The biology of a harpacticoid copepod, Tigriopus japonicus Mori. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Series 4, Zoology. 17 (3), 474-500 (1970).
Kelly, L. S., Snell, T. W., Lonsdale, D. J. Chemical communication during mating of the harpacticoid Tigriopus japonicus. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 353 (1369), 737-744 (1998).
Kelly, L. S., Snell, T. W. Role of surface glycoproteins in mate-guarding of the marine harpacticoid Tigriopus japonicus. Marine Biology. 130 (4), 605-612 (1998).
Peterson, D. L., et al. Reproductive and phylogenetic divergence of tidepool copepod populations across a narrow geographical boundary in Baja California. Journal of Biogeography. 40 (9), 1664-1675 (2013).
Palmer, C. A., Edmands, S. Mate choice in the face of both inbreeding and outbreeding depression in the intertidal copepod Tigriopus californicus. Marine Biology. 136 (4), 693-698 (2000).
Ito, T. Taxonomy within the genus Tigriopus (Copepoda: Harpacticoida) from Japan, with reference to the relationship between Tigriopus japonicus and T. californicus. Annual report of the Seto Marine Biological Laboratory. 2, 28-35 (1988).
Barreto, F. S., Schoville, S. D., Burton, R. S. Reverse genetics in the tide pool: Knock-down of target gene expression via RNA interference in the copepod Tigriopus californicus. Molecular Ecology Resources. 15 (4), 868-879 (2015).
Pereira, R. J., Barreto, F. S., Pierce, N. T., Carneiro, M., Burton, R. S. Transcriptome-wide patterns of divergence during allopatric evolution. Molecular Ecology. 25 (7), 1478-1493 (2016).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
Raisuddin, S., Kwok, K. W., Leung, K. M., Schlenk, D., Lee, J. S. The copepod Tigriopus: a promising marine model organism for ecotoxicology and environmental genomics. Aquatic Toxicology. 83 (3), 161-173 (2007).
Lazzaretto, I., Franco, F., Battaglia, B. Reproductive behaviour in the harpacticoid copepod Tigriopus fulvus. Hydrobiologia. 292, 229-234 (1994).
Medina, M. H., Morandi, B., Correa, J. A. Copper effects in the copepod Tigriopus angulatus Lang. Marine and Freshwater Research. 59 (12), 1061-1066 (1933).
McDonough, P. M., Stiffler, D. F. Sodium regulation in the tidepool copepod Tigriopus californicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 69 (2), 273-277 (1981).
Hagiwara, A., Lee, C. -. S., Shiraishi, D. J. Some reproductive characteristics of the broods of the harpacticoid copepod Tigriopus japonicus cultured in different salinities. Fisheries Science. 61 (4), 618-622 (1995).
Pereira, R. J., Sasaki, M. C., Burton, R. S. Adaptation to a latitudinal thermal gradient within a widespread copepod species: the contributions of genetic divergence and phenotypic plasticity. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 284 (1853), 20170236 (2017).
Barreto, F. S., Pereira, R. J., Burton, R. S. Hybrid dysfunction and physiological compensation in gene expression. Molecular Biology and Evolution. 32 (3), 613-622 (2015).
Alexander, H. J., Richardson, J. M., Edmands, S., Anholt, B. R. Sex without sex chromosomes: genetic architecture of multiple loci independently segregating to determine sex ratios in the copepod Tigriopus californicus. Journal of Evolutionary Biology. 28 (12), 2196-2207 (2015).
Foley, B. R., Rose, C. G., Rundle, D. E., Leong, W., Edmands, S. Postzygotic isolation involves strong mitochondrial and sex-specific effects in Tigriopus californicus, a species lacking heteromorphic sex chromosomes. Heredity. 111 (5), 391-401 (2013).
Koga, F. On the Life History of Tigriopus japonicus Mori (Copepoda). Journal of Oceanography. 26 (1), 11-21 (1970).
Powlik, J. J. Seasonal abundance and population flux of Tigriopus californicus (Copepoda : Harpacticoida) in Barkley Sound, British Columbia. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 78 (2), 467-481 (1998).
Lard, M., Backman, J., Yakovleva, M., Danielsson, B., Hansson, L. A. Tracking the small with the smallest - Using nanotechnology in tracking zooplankton. PLoS ONE. 5 (10), e13516 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

139 Tigriopus

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: