Индивидуальные культивирования копепод Tigriopus и количественного анализа их поведения, мате охрана

Резюме

Мате охрана поведение играет важную роль в воспроизводстве приливной копепод рода Tigriopus. Однако не были хорошо описаны методы для изучения этого поведения. Здесь мы описываем методы: 1) отдельные культуры девственной Tigriopus животных, и 2) количественный анализ их поведения, мате охрана.

Аннотация

Копепод род Tigriopus, которые являются общей зоопланктона в скалистых прилива бассейны, показать precopulatory Мате охрана поведение, где мужчина замочки потенциального партнера сформировать пару. Хотя это явление вызвало интерес исследователей, методы для его анализа не были хорошо описаны. Здесь мы описываем процедуры: 1) индивидуальных культивирования и постановка Tigriopus несовершеннолетних и взрослых и 2) видео на основе анализа их поведения, мате охрана. Метод культивирования позволяет экспериментальный контроль кожура опыт животных, а также возможность отслеживать их развития до поведенческие тесты. Метод анализа позволяет дать количественную оценку некоторых аспектов поведения Мате охрана, включая захват попытки мужчины и плавание траектории Мате охрана пар. Хотя эти методы были первоначально созданы для этологии исследования на Tigriopus, с надлежащей модификации они могут также применяться для исследования других зоопланктона в различных исследовательских областях, таких как физиологии, токсикологии и экологические генетика.

Введение

Дезовые приливные копепод рода Tigriopus широко распространены в скалистых высоких приливных бассейнов через несколько континентов¹. Эти копепод демонстрируют поведение, мате охрана в рамках их размножения, когда взрослый мужчина захватывает потенциального партнера (несовершеннолетних или взрослых) используя его подключили первые антенн до совокупления (рис.1 и рис.2)^{2 ,3,4,5}. Хотя это явление является предметом этологии и биохимических исследований для десятилетий^2,3,6,7, подробные процедуры для исследования этого поведения, в том числе Индивидуальные культуры девственной животных и критерии поведения событий видели в Мате охрана попытки, не были хорошо описаны. Таким образом здесь мы разработать методы, позволяющие исследования поведения под контролируемой экспериментальной среде.

Индивидуальные культивирования и постановка животных

Предыдущие исследования размножения Tigriopus условно заняты пару отсоединение метод для подготовки несовершеннолетних (copepodids) и взрослых самок поведенческие тесты и разведение эксперименты^{3,8,9 ,10}. Однако этот метод позволяет животных форма пар и потенциально совокупляться до испытаний (обсуждается в 1988 году Ито¹¹), которые могут изменить поведенческие свойства животных⁵. Кроме того есть потенциал, чтобы недооценивать этапы развития копепод с обычными протоколами, как они полагаются на размер очевидной тела для постановки. В настоящем документе мы описываем индивидуальный метод культивирования в нашем недавнем исследовании с Tigriopus californicus⁵, который был разработан для устранения этих недостатков, управляя спаривания опыт животных и отслеживание их развития от copepodid до стадии взрослого.

Количественный анализ поведения, мате охрана

Исследовано поведение Мате охрана видов Tigriopus не только в области этологии^2,6 , но и в других областях, таких как экотоксикология и эволюционной генетики^{3,4, 7 , 8 , 9 , 10}. Однако, предыдущие исследования объяснили курс этого поведения в основном письменные формы без достаточного визуальных иллюстраций изложить как поведение, так и методы для его изучения, которые создает технических препятствий для Репликация и продвижение исследований. Здесь мы предоставляем подробные описания некоторых из ключевых событий в Мате охрана поведение Tigriopus копепод, поддерживаемых визуальные материалы. Мы также продемонстрировать оборудование и методы для количественного анализа поведения. Эти методы позволяют оценки поведенческих свойств животных во время попытки Мате охрана в точно реплицированных экспериментов.

С помощью этих методов мы стремимся предоставить методологические основы исследования контролируемого и воспроизводимые на Мате охрана поведение род Tigriopus.

протокол

1. Подготовка девственной животных поведенческие наблюдения

1. Получение оплодотворенные яйца и позволяют им люк.
   1. Собирайте беременных самок, перевозящих яйца (рис. 3 c) ясно оранжевый (т.е., оплодотворенные и на продвинутых стадиях развития) от фонда культуры с пипетка Пастера. Промойте самок, нежно закупорить их в чистой питательной среды, чтобы избежать передачи других животных, в том числе nauplial личинки, которые могут вылупились в культуре.
      Примечание: В настоящем Протоколе, искусственный морской воды с минерализацией 35% используется в качестве питательной среды. Используйте различные средства (например искусственный морской воды с более высокой солености или дополнительных растворимое) в зависимости от цели эксперимента.
      Примечание: См. Баррето et al. 2015¹² для метода для создания запасов Лаборатория культуры и Перейра et al. 2016¹³ примеры сайтов коллекции природных популяций т. californicus. Петерсон et al. сообщили также их коллекции сайтов т. californicus, т. fulvusи т. japonicus с широты и долготы информацию⁹. Используйте Пластиковые пипетки с мощностью примерно 30-50 мл для сбора Tigriopus копепод от рок.
   2. Разместите каждый самка индивидуально в хорошо плиты культуры ячейки 6-колодец с чистой питательной среды (рис. 4, слева). Убедитесь, что без других животных (в том числе nauplial личинка) загрязнение колодца.
   3. Поддерживать пластины в инкубаторе при 20 ° C с 12-часовой цикл свето тени присвоено культура женщин, до тех пор, пока они выпускают яйцо мешки. Этот шаг обычно занимает от одной до десяти дней в зависимости от вида и стадии развития эмбриона. Тем временем, кормить каждый беременных женщин два раза в неделю с двумя зерна мелко местах (примерно < 0,5 мм в диаметре) рыб (см. Таблицу материалов для деталей).
      Примечание: Используйте различные температуры и света циклов, в зависимости от цели эксперимента. Более высокие температуры могут способствовать более быстрое развитие эмбрионов.
      Примечание: Избегайте, оставив избыток продовольствия, распадаясь в скважинах. Если остатки пищи начинает разрушаться, Пипетка его из скважины с пипетка Пастера.
   4. После выхода яйцеклетки sacs, удалите самки из культуры скважин с пипетка Пастера.
      Примечание: Оплодотворенных самок способны нереста несколько тисков потомство^2,3. При необходимости, перенесите самок в других скважин, для сбора дальнейшей муфты.
2. Сбор copepodids для индивидуальных культуры.
   1. Держите пластины с насиженным науплий в инкубаторе и культура науплий, до тех пор, пока они развиваются на первом этапе copepodid (CI) (рис. 4, среднего). Этот шаг, как правило, занимает от одной до двух недель. Каждый канал, хорошо с несколькими зернами мелко молотого корма для рыб во время поиска для CI животных каждые два дня. Пополните испарившейся воды воспитания с дистиллированной водой.
      Примечание: Если плавающего мусора препятствует мнению, снимать его с небольшой кусочек бумаги полотенце.
   2. Как только CI животных начинают появляться, собирают их из скважин с P-10 микропипеткой с дозирования объема на приблизительно 8 мкл, под стереомикроскопом 10 X 40 X увеличение (рис. 4, право). Вымойте каждое животное CI, нежно дозирование в чистый искусственный морской и поместите его в хорошо 24-ну клеток культуры пластины, содержащий 2-3 мм (глубина) (примерно 400-600 мкл) искусственный морской воды.
      Примечание: Избегайте переноса nauplial exuviae или других животных в скважины для отдельных культуры.
3. Отслеживать развитие лиц путем подсчета расплавленная exuviae.
   1. Изучите внутри каждой скважины для расплавленная exuviae каждые два-три дня (настроить частоту, если это необходимо), stereomicroscopic наблюдения под освещение темно поле 10 X 40 X увеличение. Exuviae copepodids являются прозрачными и узнаваемый с щетиной ноги, пара хвостового Рами (т.е., тонких торчащих структур на хвостовой конец), и/или сегментации prosome и urosome (рис. 5). Изменить фокус и освещения для обнаружения exuviae на разных глубинах в колодец (рис. 6A).
      Примечание: Расплавленная exuviae меньше, чем животное, которая перелинял их. Начинают экспертизы от нижней масштаб для животного и его сравнительно недавно exuviae и сдвиг увеличение для пожилых (то есть, меньше) exuviae.
      Примечание: Если поврежден exuviae в скважине, ликвидации скважины от дальнейшего развития отслеживания, чтобы избежать просчетов стадии развития.
      Примечание: Если плавающего мусора препятствует мнению (Рисунок 6B), снимать его с небольшой кусочек бумаги полотенце.
   2. Запишите общее количество copepodid exuviae в каждой скважине с отметкой Талли на крышке пластины (рис. 7). Добавьте строку к Марк как новый exuviae встречается в колодец.
      Примечание: Если есть nauplial exuviae, загрязненных в колодец, устраните их от граф.
   3. Кормить каждый человек с двумя зерна мелко молотого корма для рыб. Пополните испарившейся воды воспитания с дистиллированной водой для поддержания солености.
      Примечание: Кормить copepodids каждые два-три дня, чтобы предотвратить их от потребления и повреждения расплавленная exuviae, который может потенциально повлиять на оценки стадии развития (шаг 1.3.4).
   4. Оценка стадии развития животного, основанный на количество exuviae. Если не exuviae, человек оценивается на стадии CI. Если есть exuviae одного до четырех, человек оценивается в ИСИ CV этапов. Если существует пять exuviae, лицо считается взрослого.
4. Определите секс взрослых, основанный на словотолковании.
   1. Секс животных путем изучения морфологии. Взрослые самцы Tigriopus обладают коленчатые первый антенн с крючковатым и шаровидных структур на дистальном конце (рис. 3A). Взрослые самки обладают гладкой и сравнительно тонкие первый антенн (рисунок 3B), чем у мужчин. Некоторые женщины также демонстрируют темно-зеленого цвета с гонадной липидов в их тела (рис. 3В, 3D).
   2. Марк секс на крышке (рис. 7B) хорошо.

2. поведенческие тест и запись видео Мате охрана поведения

1. В день тестирования выберите животных желаемый этап и секс для поведенческой теста.
   1. Кормить отдельных лиц в культуре скважин с мелко молотый рыба продовольственной и дать им возможность съесть его на 30 минут. Тем временем перейдите к пункт 2.1.2 Подготовка испытательных камер.
   2. Подготовка двух 48-ну плоское дно клетки культуры пластин как тестирование палат; одна пластина, (в дальнейшем именуется «плиты A») для мужчин и другие («плита B») для целей (например , copepodids, взрослых женщин, взрослых мужчин). Мкл 400 чистой искусственный морской воды с минерализацией 35% в скважинах плит. Поместите пластины на площадку света LED, покрытые полупрозрачный акриловый Совет как легкий диффузор (рис. 8).
      Примечание: Используйте разные среды в зависимости от цели эксперимента.
      Примечание: Чтобы избежать избыточного тепла, не служит ламп накаливания или люминесцентных ламп подсветки.
   3. После 30 мин время кормления, описанные в 2.1.1 промойте каждое животное, нежно дозирование в последовательность четырех скважин плиты 24-колодец с чистой искусственный морской водой (рис. 9), чтобы предотвратить перенос мусора и exuviae от культуры скважин.
   4. Место промыть лиц в скважинах плит A и B на светодиодные света pad. Разрешить 30 минут для регулировки животных к скважинам.
   5. Установка видео-камеры над пластиной A в период перестройки (рис. 8). Используйте штатив или стоять, держать камеру.
   6. Сфокусировать камеру на мужчины внутри плиты A разрешить наблюдение антенн.
      Примечание: Чтобы уменьшить мерцание подсветки в кино, установите частоту кадров, равную или половину электрической частоты и использовать более длительное время экспозиции. Кроме того Держите светодиодный свет pad покрыты полупрозрачный акриловый Совет, как описано в пункте 2.1.2.
2. После периода перестройки, описанный в шаге 2.1.4 Начните запись видео и поведенческих тест.
   1. Перевести цели от пластины B пластиной A с пипетка Пастера. Если эксперимент чувствителен к химических компонентов в среде, измените пипетки для тестирования каждой пары.
      Примечание: Когда закупорить животного от пластины B, не преследовать его в воде с пипетка Пастера как помеха воды может стимулировать животных и вызывают его избыток движения. Удерживая наконечник пипетки чуть выше поверхности воды и ждать для того прийти под наконечник. Аккуратно Пипетка его с небольшим количеством искусственной морской воды и затем извлечь его в скважину на тарелку а.
   2. Согласно экспериментальный план позволяют мужчиной и цель взаимодействовать в каждой скважине для желаемого срока наблюдения (например 10 минут) после передачи.
   3. Остановите запись видео после времени наблюдения. При необходимости, скачайте записанных фильмов из камеры на компьютер.

3. ручной анализ поведенческих свойств

1. Изучить фильм для времени, когда каждый целевой был переведен в колодец на тарелку а.
2. Изучить посвящения и сроков завершения мероприятий, представляющих интерес и рассчитать длительность, задержки и частота событий.
   1. Определите начало охранные попытки мужчины как контакт мужчины антенны с любой частью тела целевого объекта (рис. 10, слева сверху). Усиков контакта зачастую предшествует Свифт (< 0.5 s) преследовать или наброситься.
   2. Определите прекращение охранные попытки как точка, когда оба антенны самца отделить от тела целевого объекта (рис. 10, вверху справа). Рассчитайте частоту охранного попытки как:
      
   3. Определите начало совокупления, изгиб спинной тела мужчины, за которым следуют повторяющихся пресс urosome против самки (рис. 10, внизу справа). Частота push — несколько раз в секунду.
      Примечание: Охранные самец обходит вплоть до каудального конца тела девушки до совокупления (рис. 10, внизу слева).
   4. Определите прекращение совокупления, отряд urosomes после событий, описанных в 3.2.4.
      Примечание: Совокупление обычно происходит в течение нескольких минут в случаях т. californicus и т. japonicus.

4. двухмерный отслеживания пар и отдельных лиц

1. Создайте видео-клип с изображением эпизод интереса (например первые 3 s охрана попытки) путем обрезки фильма, записанный на шаге 2 с программным обеспечением для редактирования фильма.
2. Установка¹⁴ ImageJ от: https://imagej.nih.gov/ij/download.html. Затем скачать MTrackJ, отслеживания движения плагин для ImageJ¹⁵, по следующие инструкции на: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/.
3. Откройте ImageJ и импортировать фильм интерес (например, файл > Импортировать > с помощью QuickTime; выберите «Преобразовать 8-битные оттенки серого» уменьшить память, необходимую для обработки изображений).
4. Пространственные и временные калибровки.
   1. Выберите инструмент прямой линии выделения в окне ImageJ для пространственной калибровке.
   2. Нарисуйте линию выбора вдоль объекта с известной длиной (например , диаметр скважины) в окне фильма.
   3. Откройте меню «Задать шкалу» (анализ > задайте шкала). Введите известные в поле «Известный расстояние» и его группы (например , мм) в поле «Длина кондиционера». Установите флажок «Глобальные» использовать шкалу для других видео клипы.
   4. Откройте меню «Свойства» (изображение > Свойства) для калибровки время. Введите интервал кадра (взаимные частоты кадров) в поле «Интервал кадра».
5. Настройка отслеживания с MTrackJ.
   1. Открыть MTrackJ плагин плагины > MtrackJ на ImageJ. Нажмите кнопку «Отслеживание» в диалоговом окне MTrackJ, чтобы открыть отслеживания меню конфигурации.
   2. Задать интервал отслеживания путем проверки «Переместить в следующий раз индекс после добавления точки» и введя число в поле «Размер шага времени» в диалоговом окне конфигурации. Для выполнения отслеживания по кадрам, введите «1» в поле «Размер шага времени».
   3. Поставьте флажок «Применить локальный курсор привязки во время отслеживания» и выберите «Темные тяжести» как компонент оснастки. Эта опция позволяет автоматическое обнаружение центроид темный объект (то есть, человек или пара) в пределах обнаружения квадратный («оснастки диапазон») вокруг курсора. Выберите размер площади для покрытия всего пара или животного в фильме (например 31 x 31 пикселей).
   4. Нажмите кнопку «ОК», чтобы применить выбранные параметры.
6. Выполнения двумерных отслеживания.
   1. Нажмите кнопку «Добавить» в диалоговом окне MTrackJ чтобы начать отслеживание.
   2. Установите курсор (обнаружение площади) для покрытия пару или индивидуальный отслеживаться. Нажмите, чтобы обнаружить темно центроида объекта в пределах площади.
   3. Повторите шаг 4.6.2 для нужное количество кадров.
   4. Для создания таблицы данных, нажмите кнопку «Измерения» в диалоговом окне MTrackJ. Данные отображаются в двух окнах: «MTrackJ: дорожки» окно со сводкой отслеживаемых двухмерной траектории и «MTrackJ: точек» показывает подробные данные для каждой точки времени. Чтобы сохранить каждую таблицу, выберите Файл > Сохранить как... меню на ImageJ.
      Примечание: Обратитесь к руководству онлайн, предоставляемый разработчиком (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) для описания каждого столбца данных.
   5. Чтобы создать фильм с отслеживаемой траектории, как цветные линии, нажмите кнопку «Кино» в диалоговом окне MTrackJ. Чтобы сохранить созданный фильм, выберите Файл > Сохранить как... меню на ImageJ.
7. Сохраните весь результат. Нажмите кнопку «Сохранить» в диалоговом окне MTrackJ для сохранения результатов, включая данные (шаг 4.6.4) и гусеничные двухмерной траектории (шаги 4.6.2 и 4.6.3).

Результаты

Индивидуальный культивирования методом, описанным в шаг 1 позволяет подготовку и постановку девственной животных без предварительного опыта спаривания.

Поведенческие испытания, описанного в шаге 2 позволяет запись видео и наблюдения за поведением Мате охрана копепод Tigriopus . Следующие проверки записанного видео с методами, описанными в шагах 3 и 4 позволяет количественный анализ некоторых аспектов поведения, показанный на рисунке 1.

На рисунке 11 показана разница в средней продолжительности охраны попытки между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Ручной анализ показал, что пар НР НР показали относительно краткосрочных спаривания чем пары мужчин и женщин.

На рисунке 12 представлены примеры траекторий, отслеживаются с помощью метода анализа и представитель результат анализа скорости показан на рисунке 13. Двумерные пространственные отслеживания новообразованной охранные пар т. californicus показал, что НР НР пар, как правило, показывают более высокие скорости чем пары мужчин и женщин в первые 3 s охранного попыток.

Рисунок 1: Мате охрана поведение в Tigriopus. (A) Взрослый самец, сжимая несовершеннолетнего (copepodid) с первым антенн (обозначается синие стрелки). Бар = 1 мм. контуром Мате охрана поведения (B) . Мужчина пытается захватить цель индивидуальных (слева) и образует пару с ним (в середине). НР НР пар и некоторые пары мужчин и женщин охрана попытка завершается без совокупления. Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 2017⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Этапы развития Tigriopus. Tigriopus видов обычно проходят шесть этапов nauplius (от NI НВИ), пять этапов copepodid (от ди-CV) и взрослой стадии (CVI)¹⁶. Мужчины делают охранные попытки несовершеннолетних от ранней стадии copepodids (CI в japonicus т. и т. fulvus^6,17 ) и ИСИ в s т. californicu³, а также взрослых обоих полов⁵ . Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 2017⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Морфология взрослых (T. californicus). (A) взрослого самца. (B) взрослая самка. (C) беременных взрослой самки с яйца мешка с яйца оплодотворенные и развитых (снимите оранжевый). (D) беременных взрослой самки с яйца мешка с неоплодотворенные или неразвитых (тёмно-зелёный) яйца. Стрелки указывают яйцо мешки. Бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: план подготовки для отдельных культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: расплавленная exuviae. (A) Exuviae от CI CV этапов одного животного т. californicus. Бар = 1 mm. (B) Exuviae от CI для CV этапов в отдельные культуры хорошо. Белый мусор это экскремент животного культивировали в колодец (не показано на рисунке). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: Поиск для exuviae под стереомикроскопом. Бары = 1 мм. координационные (A) изменение стереомикроскопом для обнаружения exuviae на разных глубинах. Малиновая стрелки указывают сосредоточены exuviae и серые стрелки указывают нецеленаправленных exuviae. Верхнее изображение фокусируется на левой exuviae, который является затонувшее в нижней части скважины. Нижнее изображение фокусируется на правой exuviae, который располагается под поверхностью средних. (B) верхнем изображении показан пример непроходимости экспертизы мусор, плавающей на поверхности среднего. Зеленая стрелка указывает exuviae, скрытые под обломками. Изображение внизу показывает результат очистки с небольшой кусочек бумаги полотенце. Exuviae (обозначается зеленой стрелкой) видна после очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: определение пола животных и промежуточной. Примеры того, как отметить количество exuviae и секс животных на крышку плиты культуры. (A) пример для колодца, содержащий пять exuviae и взрослого животного. Количество линий в Талли Марк на крышке представляет количество exuviae в колодец. Когда количество exuviae достигает пяти, Пол животного может быть определена на основании Морфология усиков (см. также рис. 3). (B) пример заметное крышка плиты культуры. Верхние строки содержат старых животных (CIV для взрослых) и нижней строки содержат младший (т.е., недавно собранных) животные (CI CIII). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: схема поведенческой тест. Установка для записи видео Мате охрана поведения (слева) и наброски поведенческих теста (справа). Этот рисунок был изменен с Tsuboko-Ишии и Бертон 2017⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: полоскание животных до поведенческих test. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 10: определение событий в ручной анализ. Иллюстрации событий наблюдается по отношению к Мате охрана попытки. Выделяются имена событий определены и проанализированы в шаге 3. События, заключенный в пунктирной линии не могут наблюдаться в некоторых попыток Мате охрана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 11: Разница в охране продолжительность между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Каждый символ треугольника представляет данные из одной пары испытания. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Средняя продолжительность записи была больше для пары мужчин и женщин (мужчины женщины (n = 22), мужчина мужчина (n = 29); **p < 0.01 проверкой U Манна-Уитни). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 12: траекторий пар в течение первых трех секунд охранного попытки. Примеры отслеживаемых двумерных траекторий мужской женский пар (слева) и мужчинами пар (справа) т. californicus. Точки на траектории представляют моменты времени (30 кадров в секунду). Бары = 10 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 13: Разница в средней скорости после начала охранного между парами мужчина женщина и мужчина мужчина пар т. californicus. Каждый символ треугольника представляет данные из одной пары испытания. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Средняя скорость пары в первые 3 s охранного попыток была больше для НР НР пар (мужчины женщины (n = 13), мужчина мужчина (n = 35). ***p < 0,001 проверкой U Манна-Уитни). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: Эффект полоскания лечения на поведение Tigriopus. Каждый круг или треугольник символ представляет данные из одного испытания отдельных или пары. Бары и усы представляют, соответственно, медианы и межквартильный диапазон. Люди в «промыть» и «не промыть» группы были обработаны таким же образом, за исключением того, что группе «не промывать» не испытывали ополаскивания лечения (шаг 2.1.3) до 30-минутный регулировки времени (шаг 2.1.4). (A) средняя скорость промыть мужчины, как правило, быть больше, чем у мужчины не промыть (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). Скорость измерялась для 30 s, основанный на видео записанный после регулировки времени. (B) средняя скорость промыть самки, как правило, быть больше, чем у самок не промыть (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). Скорость измерялась для 30 s, основанный на видео записанный после регулировки времени, следующий шаг 4 (отслеживание интервал = 0.5 s). (C) частота охранного попыток была больше для пар промыть лиц (промыть (n = 6), не промыть (n = 6). ** p < 0.01 проверкой U Манна-Уитни). (D) срок охраны попытки, как правило, быть больше для пар промыть лиц (промыть (n = 6), не промыть (n = 6), н.с.: было обнаружено статистически значимого различия по U Манна-Уитни тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Индивидуальные культивирования и определение стадии и секс

Здесь мы описал метод, используемый в наших предыдущих исследований⁵ подготовить девственной Tigriopus животных с их спаривания опыт, контролируемых отслеживая их развития (рис. 4 и рис. 7). Как Tigriopus видов используются как модель животных в различных областях биологических например токсикологии^16,18, экологическая физиология^19,20,21и эволюционный Генетика^13,,2223,24, этот метод имеет возможность предоставлять ценные средства для оценки воздействия экологических и генетических факторов на жизненный цикл этих рачков.

Для достижения успешной постановки, обычный поиск и сбор CI copepodids от массовой культуры (шаг 1.2) имеет решающее значение, как коллекции на более поздних этапах может привести к неправильной постановке животных. Кроме того тщательный поиск exuviae (шаг 1.3) также имеет важное значение для точной постановки. Увеличьте частоту сбора и проведение по мере необходимости, как интервал между линяет варьируется от одного до нескольких дней в зависимости от видов и воспитания условие^2,25,26. Различия в морфологии антенн copepodids и взрослых самок не заметно значительное в некоторых видов и популяций Tigriopus^16,25. Следовательно постановка перед sexing полезно различать взрослых самок от передовых copepodids обоего пола.

Поведенческие тесты и ручной анализ поведенческих свойств

В целом одним из наиболее важных частей этологическая исследований является определение и описание событий, представляющих интерес. Методы, представленные в настоящем документе были впервые разработаны для нашего недавнего исследования⁵ и дополнено описанием совокупление и наглядных пособий (Рисунок 10). В дополнение к этому последовательность в животных обработки также играет важную роль в поведенческих экспериментов. Например промывки копепод потенциально может облегчить некоторые аспекты их поведения (дополнительная цифра 1) и поэтому желательно, чтобы выполняться последовательным образом среди образцов, таких, как стандартизированные в шаге 2.1.3. Мы ожидаем, что материалы, представленные в настоящем документе будет помогать контролируемых и воспроизводимости исследований на Мате охрана поведение Tigriopus, поощрение репродуктивного и экологические исследования этот богатый житель прилива бассейны.

Одно из возможных ограничений с помощью этого метода является малое увеличение полученных изображений. Хотя фильмы, записанные с нашей системой позволяют идентифицировать выдающихся тела структур, включая urosomes и мужской первый антенн, одно не сможет наблюдать более тонкие структуры, такие как ноги и гениталии с нашим методом, так как он не использовать микроскопические увеличение для записи видео. Хотя Келли et al. сообщили, что они были в состоянии соблюдать сперматофоры передачи от мужчины женщины т. japonicus под микроскопические наблюдения на 100 крат (не видео)⁷, мы не смогли наблюдать сперматофор в наших фильмов, возможно из-за ограничения разрешения изображения.

Двумерные отслеживания пар

Хотя этот метод не позволяет трехмерного отслеживания животных, он позволяет анализ двумерных траектории зоопланктона без химически маркировки животных (cf. Сало et al. 2010²⁷), используя программы распространяется бесплатно. Если размер файла фильма является слишком большим, чтобы быть обработаны в ImageJ, можно уменьшить разрешение файла и преобразовать его в фильм серой шкалы. В то время как описан метод первоначально был разработан для взрослых пар т. californicus (рис. 12 и рис. 13), также доступна для взрослых несовершеннолетних пар и отдельных лиц (дополнительная цифра 1) как а также других видов Tigriopus , в принципе. Мы ожидаем дальнейшего метод, чтобы быть применимым к краткосрочной (от миллисекунд до второй шкалы времени) траектории анализ зоопланктона других таксонов с соответствующими изменениями.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands. Inc.	SS1-160P	For preparation of culture medium
PRO PlecoWafers	Tetra	16447	Food for copepods (used after being ground in a mortar)
Flat bottom 6-well tissue culture plate with lid	Corning Co., Ltd.	353224	Container for culture of gravid females and hatched nauplii
Flat bottom 24-well cell culture plate with lid	Corning Co., Ltd.	353226	Container for individual culturing
Flat bottom 48-well cell culture plate with lid	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	Behavioral observation chambers
LED light pad	Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.	Litup LP4	Backlight for behavioral observation
Camera	Canon	0591C003 (model: Rebel T6i)	For recording of behavior
Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	For transfer of copepods
P10 micropipette tips	VWR	613-0735	For transfer of C1 stage copepodids
ImageJ	NIH	Version 1.49t	For semi-automatic analysis of movies
MTrackJ		Version 1.5.1	ImageJ plugin for tracking developed by Dr. Erik Meijering (Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)