מודל תפליט פלאורלי בחולדות על ידי החדרה Intratracheal של Polyacrylate/Nanosilica

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבנות מודל תפליט פלאורלי בחולדות על ידי החדרה intratracheal של polyacrylate/nanosilica.

Abstract

תפליט פלאורלי הוא ממצא קליני שכיחה של מחלות רבות. יש מודל שימושי תפליט פלאורלי בעלי חיים חשוב מאוד ללמוד אלה מחלות ריאות. דגמים קודמים של תפליט פלאורלי יותר לשים לב הגורמים הביולוגיים, ולא חלקיקים בסביבה כאן, אנחנו מציגים מודל תפליט פלאורלי בחולדות על ידי החדרה intratracheal של polyacrylate/nanosilica, ואם שיטה של ננו-חלקיק בידוד ב תפליט פלאורלי. על ידי intratracheal החדרה של polyacrylate/nanosilica עם ריכוזים של 3.125, 6.25 ו- 12.5 מ ג/kg∙mL, תפליט פלאורלי בחולדות הציג ביום 3, הגיעה לשיאה ב- 7-10 ימים 6.25 ו- 12.5 מ ג/kg∙mL קבוצות, ואז לאט לאט ירד ונעלם ביום 14 כאשר הריכוז של polyacrylate/nanosilica גדל, תפליט פלאורלי הוא מיוצר יותר ויותר מהר. נוזל פלאורלי זה זוהה על-ידי בדיקת אולטראסאונד או CT חזה סריקה של אושר על ידי ניתוח של חולדות. חלקיקי סיליקה נצפו ב תפליט פלאורלי של החולדות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. התוצאות הראו כי החשיפה polyacrylate/nanosilica מוביל אינדוקציה של תפליט פלאורלי, אשר היה עקבי עם הדו ח. הקודמים שלנו בבני אדם. בנוסף, המודל הזה הוא מועיל עבור מחקר נוסף של ננו טוקסיקולוגיה והמחלות תפליט פלאורלי.

Introduction

תפליט פלאורלי הוא ביטוי קליני נפוצה מאוד של מחלות ריאות עם מגוון של סיבות. יש מודל שימושי תפליט פלאורלי בעלי חיים חשוב מאוד ללמוד אלה מחלות ריאות, התפקידים של שתי השכבות ממברנה פלאורלי במנגנונים של תפליט פלאורלי, הטיפול בה. עם זאת, חלק דיווח תפליט פלאורלי מודלים מתמקדים בעיקר על תפליט פלאורלי ממאיר או הגורמים הביולוגיים במקום על חלקיקים הסביבה^1,2. כאן, אנחנו מציגים מודל חדש של תפליט פלאורלי, זה פשוט, בטוח ויעיל.

עם ההתפתחות של ננו-טכנולוגיה, שימוש נרחב nanoproducts, יש דאגה לגבי הסיכונים הפוטנציאליים של ננו כדי על הסביבה ועל בריאות האדם^3,4. ננו להציג את גורמי הסיכון, שעשויה להוביל מפגעים הרומן בתוך מקום העבודה או דרך זיהום סביבתי. מחקרים במבחנה, ויוו מראים כי ננו יכול לגרום נזק רב איבר ל הריאות, הלב, הכבד, הכליות, מערכת העצבים, וכן את הרבייה ומערכת החיסוןs^5,6. בנוסף, מחקרים דיווחו כי רעילות ספציפיים של ננו-חומרים עקב שלהם מאפיינים ייחודיים physicochemical^3,4,7.

אנחנו דיווחו כי קבוצה של עובדים עם חשיפה תעסוקתית ננו הציג קלינית עם תפליט פלאורלי, סביב הלב, פיברוזיס של הריאה, גרנולומה^8,9. חלקיקי סיליקה היו מבודדים אותם חולים תפליט פלאורלי⁹. על מנת לשחזר ולאמת את תפליט פלאורלי המושרה על ידי חלקיקים בשאיפה של האדם, אנחנו ערכו את הניסוי על-ידי החדרת polyacrylate/nanosilica (הרשות/NPSi) דרך מערכת הנשימה אצל חולדות, אשר חיקה נשימה אנושיים אמיתיים הסביבה, מצא את intratracheal החדרה של הרשות/NPSi יכול לגרום תפליט פלאורלי בחולדות. כאן, אנו מציגים כיצד להפוך תפליט פלאורלי בחולדות מאת intratracheal החדרה של הרשות/NPSi, ואיך לבודד חלקיקים ב תפליט פלאורלי. מודל זה עשוי להיות שימושי עבור מחקר נוסף של ננו טוקסיקולוגיה ומחלות תפליט פלאורלי.

Protocol

המחקר עקב אחר ההנחיות של האוניברסיטה לרפואה הון (בייג'ינג, סין p. R) עבור טיפול והשתמש של חיות ניסוי. כל ההליכים אושרו על-ידי חיה אתי הוועדה של הבירה רפואי האוניברסיטה בסין.

1. ההכנות ניסיוני

הערה: להתאקלם הנשי ספציפי פתוגן ללא Wistar העכברושים (משקל: 200 ± 10 גרם) את סביבות ניסיוני במשך שבוע לפני המינהל (תנאים סביבתיים: אור / כהה: 12h / 12h, הטמפרטורה 22 ± 2 ° C, לחות 50 ± 10%).

1. השתמש טריים 10 מ"ל של המתלים הרשות/NPSi (nanosilica Ø:20 ± 5 ננומטר על ידי אמולסיה באתרו הפילמור) מעורבבת עם תמיסת מלח בריכוזים של 3.125, 6.25 12.5 מ"ג/מ"ל, בהתאמה¹⁰. בעבר מינהל, sonicate את המתלים למשך 20-30 דקות, מערבולת 10 דקות כדי למנוע צבירת חלקיקים.
2. במידה שווה לחלק את סכום כולל של 20 חולדות ארבע קבוצות: קבוצה אחת עבור כל ריכוז של הרשות/NPSi (0, 3.125, 6.25 ו 12.5 מ"ג/מ"ל).
3. כדי עזים ומתנגד אותם, להציב את החולדות במיכל סגור עם 1.5 מ של האתר (99.5%) או כל IACUC אושרו פרוטוקולים אחרים. לאחר 60-90 s של הרדמה, בדוק חוסר תגובה לדווש רפלקס. ודא כי החולדות נושמים.
4. העכברוש anesthetized ותצברו ולתקן את השיניים הקדמיות שלה עם חוטי ניילון על הלוח סטיריליים מדי.
5. פותח את פיו ולחשוף שלה פיסורה של glottis בעזרת מלקחיים כירורגיים ולעדשה חזיתית.
6. להקנות העכברושים 0.5 מ של הרשות/NPSi השעיה לריאה של חולדה כל עבור סכום כולל של 1 מ"ל באמצעות צינור בסדר עם מחט בוטה סטיריליים לתוך סמפון הדו-צדדיים.
7. מניחים את החולדות על לוח פלסטיק מיקום פרקדן ולתת שהחולדות לשחזר לאט בעוד 5-10 דקות.

2. אולטרסאונד הבדיקה עבור תפליט פלאורלי

1. השתמש מערכת סאונד עם מתמר מערך ליניארי (תדר: 8 מגה-הרץ) לבחון חולדות בימים 1, 3, 7 ו- 14¹⁰.
2. לתת הרדמה (10% קלוראל-הידרייט, 0.35 גרם/100 גרם, i.p.) לעכברושים ולבדוק העדר רפלקסים פדלים.
3. להסיר את השיער החזה הבטן של חולדות העליונה באמצעות מכונת גילוח חשמלית. ואז מניחים את החולדה על צלחת הרכבה במצב פרקדן.
4. לכסות את העור עם הג'ל מצופה ולאחר מכן הצב את המתמר לחלל הבין-צלעי ואזור subcostal כדי לזהות נוזל פלאורלי.
   הערה: על מנת לזהות שהאולטרסאונד במדויק, השמאל ואת העמדות הימנית נבחרו כדי לבצע בדיקת אולטרסאונד.
5. לשים את החולדה על לוח פלסטיק במצב פרקדן לאחר בדיקת אולטרסאונד ולתת שהחולדות להתאושש באיטיות תוך עשר דקות.

3. החזה סריקת CT של תפליט פלאורלי

1. על ניהול שלאחר ימים 7 ו-14, עזים ומתנגד החולדות עם 10% כלורין (מקומות). שקול זה מספיק עומק ההרדמה כאשר העכברוש אינו מגיב לדווש רפלקסים.
   הערה: המינהל שלאחר יום 7 הוא הזמן המתאים ביותר להתבונן תפליט פלאורלי על-ידי סריקת CT.
2. במקום העכבר על משטח מפלסטיק במצב של שכיבה ולאחר מכן סרוק את החזה שלה כדי לחקור תפליט פלאורלי באמצעות שימוש טי 64 ערוצים בהגדרות הבאות: תצורת גלאי 64 מ"מ x 0.625 מ"מ, 120 kV (פיק), ו- 350 mAs.

4. אוסף של תפליט פלאורלי ובידוד של חלקיקים ב תפליט פלאורלי

1. אחרי החזה CT סריקה של חולדות, תחת הרדמה של קלוראל-הידרייט, לבדוק את רפלקס פדלים של החולדות, לגלח את שיער מהבטן לחזה ו מכן לחטא את העור על-ידי יוד.
2. להביא את החולדות האזור הכירורגי.
3. תחת הרדמה, נחתך במהירות 1-1.5 ס מ של העור ואת שרירי הבטן מצאתי לאורך הקו האמצעי עם הסרעפת ללא פגע.
4. בזהירות פתח את התיבה ולבדוק הדו-צדדיים פלאורלי חללים בעזרת פינצטה, במיוחד דו צדדיים costal הסרעפת הזוויות. לאסוף מ ל 1-2 של תפליט פלאורלי אור צהוב עם מזרק סטרילי 2 מ"ל.
5. פעם עשיתי, להקריב את העכברים עם פרוטוקול IACUC אושרה.
6. Centrifuge של תפליט פלאורלי צינור 2 מ"ל למשך 15 דקות ב x 300 גר' על מנת לבודד את חלקיקי.
7. השתמש טיפה של השכבה העליונה אשר הוא נוזל בהיר, להתבונן תחת microscope(TEM,) אלקטרון תמסורת במתח מאיץ של 60-80 kV.

תוצאות

באמצעות אולטרסאונד של בית החזה, מצאנו אין מקרום ביום 1 בכל קבוצות. עם זאת, ביום 3, תפליט פלאורלי הופיעו הקבוצות 6.25 ו- 12.5 מ ג/kg∙mL. שהאולטרסאונד היה בעיקר הזווית הסרעפת costal נכון, תוך שהאולטרסאונד סביב הלב הציג רק בקבוצה 12.5 מ"ג/kg∙mL. יתר על כן, ביום 7, תפליט פלאורלי (Video 1) ו...

Discussion

Sonography הוא הכלי הנוח ביותר לקביעת מחלות ריאות, עקב רגישות מצוינת שלה נוזל חופשי חלל הצדר¹¹. זה בגלל sonography יכולים לזהות מיד את הניגוד ב עכבה אקוסטית של נוזלים בחלל הריאות¹²והאוויר. חוץ מזה, sonography היא גמישה יותר במודל של חיה קטנה מטי ובכל זאת, את האוויר בריאה משתקפת גל ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system	Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA
Polyacrylate/nanosilica	Fudan University,Shanghai, China		made by order with nanosilica(20±5)nm
10% chloral hydrate	Beijing Chemical Works	302-17-0
Transmission electron microscope	JEM-1400Plus，JEOL Ltd., Japan.
Light speed 16 spiral computed tomography	GE Healthcare, US
Specific pathogen-free Wistar	Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China)		Wistar rats